Kỹ thuật chiết xuất acid gymnemic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐẠI NAM KHOA DƯỢC -   - TIỂU LUẬN CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT ACID GYMNEMIC DƯỢC 10 - 05 NHÓM 18 Đỗ Hương Giang Chu Minh Phương Mai Thùy Linh Phạm Thị Hương Giang HÀ NỘI 12/2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐẠI NAM KHOA DƯỢC -   - TIỂU LUẬN CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT ACID GYMNEMIC DƯỢC 10 - 05 NHÓM 18 Đỗ Hương Giang Chu Minh Phương Mai Thùy Linh Phạm Thị Hương Giang HÀ NỘI 12/2020 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương Tổng quan dây thìa canh 1.1 Vị trí phân bố 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Tác dụng sinh học 1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết 1.3.2 Tác dụng kháng khuẩn 1.4 Các nghiên cứu phân lập acid gymnemic từ dây thìa canh Chương Tổng quan acid gymnemic 2.1 Tìm hiểu chung nhóm Saponin 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Cấu trúc hóa học 2.2 Tìm hiểu chung acid gymnemic 2.2.1 Nhóm saponin triterpenoid 2.2.2 Cấu trúc hóa học acid gymnemic 2.3 Cơ chế tác dụng acid gymnemic dây thìa canh 11 2.4 Sinh khả dụng 12 Chương Phương pháp chiết xuất 13 3.1 Phương pháp chiết xuất saponin 13 3.1.1 Saponin trung tính acid 13 i 3.1.2 Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan solanidan 13 3.1.3 Tinh chế saponin 14 3.2 Một số phương pháp chiết xuất acid gymnemic 15 3.2.1 Phương pháp chiết pha rắn 15 3.2.2 Chiết xuất phương pháp ngâm 15 3.2.3 Chiết xuất acid gymnemic từ mô sẹo 17 3.2.4 Tinh chế acid gymnemic từ dây thìa canh 18 3.3 Phân lập acid gymicnemic dây thìa canh to 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 ii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây dây thìa canh Hình 2.1 Cấu trúc hóa học chung saponin Hình 2.2 Cấu trúc khung gymnemgagenin Hình 2.3 Cấu trúc phần glycon phân tử acid gymnemic Hình 2.4 Cấu trúc phần đường phân tử acid gymnemic 10 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất saponin trung tính acid 13 Hình 3.2 Sơ đồ tinh chế saponin kiềm 14 Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất acid gymnemic từ dây thìa canh phương pháp ngâm 16 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập acid gymenemic từ mô sẹo 17 Hình 3.5 Sơ đồ chuyển aicd gymnemic thành gymnemagenin 18 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình tinh chế acid gymnemic từ dây thìa canh 19 iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý tác dụng hạ đường huyết tương ứng acid gymnemic phân lập từ DTCLN 10 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Acid gymnemic hoạt chất dây thìa canh từ lâu biết đến rộng rãi với tác dụng hạ đường huyết kiểm sốt béo phì Dây thìa canh thương mại hóa nhiều dạng bào chế trà túi lọc, viên nang để hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân đái tháo đường Tuy nhiên, sản phẩm từ nguyên liệu ban đầu dược liệu thô dịch chiết tổng hợp chưa qua tinh chế chưa tìm thấy quy trình chiết xuất phân lập phù hợp Do đó, đề tài tiểu luận “Kỹ thuật chiết xuất acid gymnemic” giới thiệu quy trình tinh chế, chiết xuất phân lập acid gymnemic có thìa canh to Chương Tổng quan dây thìa canh 1.1 Vị trí phân bố Theo hệ thống phân loại Takhtajan công bố năm 2009 [9], Dây thìa canh to (DTCLT) có vị trí phân loại sau: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân Lớp Bạc hà (Lamiidae) Bộ Long đờm (Gentiamales) Họ Trúc đào (Apocynaceae) Phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae) Chi Gymnenia R Br Loài Gymnema latifolium Wall ex Wight Phân bố: Đảo Andaman Nicobar, Bangladesh, Trung Qu ốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thái Lan, Việt Nam (Cúc Phương, Hịa Bình, Thái Ngun) [5] Hình 1.1 Cây dây thìa canh 1.2 Thành phần hóa học Cho đến nay, nghiên cứu thành phần hóa học tập trung vào lồi dây thìa canh nhỏ (DTCLN) Theo đó, DTCLN có chứa triterpen saponin thuộc nhóm oleanan (acid gymnemic gymnema – saponin) nhóm drammaran (gymnemaside) [7] Ngồi ra, dịch chiết nước dịch chiết cồn DTCLN có flavon, anthraquinon, hentri-acontane, phytin, resin, acid tartaric, acid formic, acid butyric, lupeol, β – amyrin, stigmasterol, α β cholorphyl, inositol, d-quercitol, alkaloid [2] Trong đó, thành phần tạo nên tác dụng xác định acid gymnemic, tên chung acid hữu thuộc nhóm saponin triterpenoid khung olean Về chất, acid gymnemic chất tinh khiết mà hỗn hợp chất 1.3 Tác dụng sinh học 1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết Theo tác giả Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương cộng (2011), dịch chiết DTCLT Việt Nam có tác dụng hạ đường huyết cá thể chuột bình thường (24,07%) cao sau giờ, kéo dài đến chuột gây tăng đường huyết Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết Liều dung thích hợp dây thìa canh cắn tồn phần pha thành hỗn dịch nước cất với tỉ lệ 1:1, với liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g khô/kg thể trọng [10] Kết thử nghiệm cho thấy tác dụng hạ đường huyết dịch chiết DTCLT mạnh DTCLN Ngoài công bố trên, giới Việt Nam chưa có cơng bố thức tác dụng sinh học DTCLT 1.3.2 Tác dụng kháng khuẩn Các nhà khoa học nhận thấy DTCLT có tác dụng kháng khuẩn chủng Gram âm (Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella paratyphi, Shigella boydi, S brunci, S dysentriae, Vibrio parahaemolyticus, Yersimiaenterocolitica, Escherichia coli) Gram dương (Cornybacterium diptheriae, Enterococus faccalis, Staphylococcus aureus, Streptococci pneumoniae, Bacillus subtilis) [6] 1.4 Các nghiên cứu phân lập acid gymnemic từ dây thìa canh Cho đến nay, nghiên cứu phân lập acid gymnemic chủ yếu tiến hành lồi DTCLN Trong phương pháp phổ biến dung nhiều nghiên cứu để chiết xuất saponin triterpenoid mà thành phần acid gymnemic phương pháp tạo tủa GS4 Ở Việt Nam, vào năm 2010, tác giả Nguyễn Hương Giang tối ưu hóa quy trình tạo tủa GS4 từ DTCLN quy trình thu sau: Dịch chiết EtOH 60% sau loại nhựa dung mơi thích hợp, nhỏ từ từ H2SO4 5% vào cao 1:2 pH = 3, vừa nhỏ vừa khuấy đều, dung dịch tạo tủa (GS3), ly tâm thu tủa Tủa tạo thành tiếp tục hòa tan dung dịch KOH 0,1M tới pH = 11 Nhỏ từ từ H2SO45% pH = 3, vừa nhỏ vừa khuấy đều, dung dịch tạo tủa (GS4), ly tâm thu sấy tủa đến khối lượng không đổi [4] Phương pháp sử dụng dung dịch acid base khó áp dụng vào quy mơ cơng nghiệp Dựa cấu trúc hố học phần genin người ta chia saponin thành nhóm lớn saponin triterpenoid saponin steroid Mỗi nhóm chia thành nhiều nhóm nhỏ [101] Hình 2.1 Cấu trúc hóa học chung saponin 2.1.3 Tính chất Saponin thường chất vơ định hình, khơng màu tối màu trắng ngà Một số saponin có mạch đường ngắn kết tinh Sapogenin thường chất kết tinh khơng màu Đa số saponin có vị nhẫn đắng trừ số chất có vị glycyrrhizin có Cam thảo bắc, abrusosid A Cam thảo dây, osladin Polypodium vulgare L có vị Saponin chất phân cực nên tan dung môi phân cực alcol, hỗn hợp cồn - nước, nước dung môi phân cực khác dimethyl sulfoxid, dioxan, acid acetic, pyridin Butanol dung mơi hịa tan tương đối chọn lọc saponin có mạch đường ngắn tới trung bình nên thường dùng để tinh chế saponin cách phân bố với nước Các saponin có mạch đường dài tan tốt nước Saponin tan aceton, ether, hexan người ta dùng dung mơi thêm vào dung dịch cồn để kết tủa saponin Saponin bị tủa chì acetat, bari hydroxyd muối ammoni sulfat Tính tan sapogenin ngược lại, chúng tan tốt dung môi phân cực tới phân cực trung bình benzen, chloroform tan phần methanol, ethanol Sapogenin dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh saponin Saponin có tính chất hoạt động bề mặt Đặc tính giải thích tính chất vừa thân dầu vừa thân nước phân tử saponin Phần aglycon có tính thân dầu cịn phần đường có tính thân nước Khả tạo bọt saponin thay đổi theo cấu trúc saponin: phần genin, số mạch đường, chiều dài mạch đường Nhờ đặc tính mà saponin tạo bọt nhiều lắc với nước, có tác dụng nhũ hố tẩy Không phải tất saponin tạo bọt lắc với nước Do khối lượng phân tử lớn, saponin khó bị thẩm tích Dựa vào tính chất người ta tinh chế saponin Saponin có khả làm vỡ hồng cầu nồng độ loãng Saponin độc cá saponin làm tăng tính thấm biểu mô đường hô hấp nên làm chất điện giải cần thiết Saponin có tác dụng diệt loài thân mềm giun, sán, ốc sên làm ảnh hưởng đến lớp biểu mô Saponin có tính chất kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt; liều cao gây nôn mửa, lỏng Saponin tạo phức vói cholesterol với chất 3-P-hydroxysteroid khác Tuy vài tính chất khơng thể vài saponin Ví dụ: sarsaparillosid khơng có tính phá huyết tính tạo phức với cholesterol Do nhóm phân tử, saponin thể tính acid hay kiềm Do ngưịi ta cịn phân thành saponin acid, saponin kiềm [1] 2.2 Tìm hiểu chung acid gymnemic Acid gymnemic saponin triterpenoid [8] 2.2.1 Nhóm saponin triterpenoid Cấu trúc phần genin saponin triterpenoid có 30 carbon, cấu tạo đơn vị hemiterpen nối với theo quy tắc đầu đi, hay nói cách khác, cấu tạo đơn vị terpen nên có tên gọi Các saponin chia làm loại: saponin triterpenoid vòng (pentacyclic) với khung triterpen có cấu trúc gồm vịng saponin triterpenoid vịng (tetracyclic) vối khung triterpen có vịng Dung hợp vòng A/B, B/C C/D triterpenoid trans D/E sapogenin triterpenoiđ vòng cỉs 2.2.1.1 Saponin triterpenoid năm vòng (saponin triterpenoid pentacyclic) Saponin triterpenoid năm vịng có phần sapogenin có khung 30 carbon với vịng nhóm methyl Nhóm methyl C-28 thường oxy hóa thành nhóm carboxyl Nhóm kết hợp với phần đường tạo dây nối pseudoglycosid Nhóm methyỉ khung oxy hóa thành -CH2OH (như C-23, C-28), -CHO hay -COOH (như C- 23, C-27 hay C-30) Nhóm lại chia thành nhóm nhỏ Năm phân nhóm gặp saponin oleanan, ursan, taraxasteran, lupan hopan 2.2.1.2 Saponin triterpenoid bốn vòng (saponin tritrerpenoid tetracyclic) Saponin triterpenoid bốn vịng có bốn nhóm dammaran, lanostan, tirucallan cucurbitan 2.2.2 Cấu trúc hóa học acid gymnemic Trong hàng chục năm, nhiều nghiên cứu tiến hành để làm sáng tỏ cấu trúc hóa học hỗn hợp chất gọi “acid gymnemic” Về bản, tác giả đưa kết luận chung cấu thành acid gymnemic glycoside thông thường gồm có phần đường phần aglycon Ngồi ra, tiến hành kiềm hóa aglycon thu khung gymnemagenin hỗn hợp acid [8] Hình 2.2 Cấu trúc khung gymnemgagenin Trong nghiên cứu gần đầy đủ nhất, từ dịch chiết nóng DTCLN, Yoshikawa cộng phân lập xác định cấu trúc hóa học 18 gymnemic acid (đánh số từ I đến XVIII), thêm vào loạt nghiên cứu số tính chất vật lý khối lượng phân tử, nhiệt độ nóng chảy tác dụng dược lý tác giả Giovanni Di Fabio cộng tổng hợp lại tài liệu “Triterpenoids from Gymnema sylvestre and Their Pharmacological Activities” Các kết mô tả hình bảng sau: Hình 2.3 Cấu trúc phần glycon phân tử acid gymnemic [3] Hình 2.4 Cấu trúc phần đường phân tử acid gymnemic [3] Bảng 2.1 Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý tác dụng hạ đường huyết tương ứng acid gymnemic phân lập từ DTCLN Tên GA R1 R2 R3 R4 R5 R6 Khối lượng phân tử Nhiệt độ nóng chảy TD* I GlcA H OH OAc OH OTig 806,97 211-212 II GlcA H OH OAc OH OMba 808,99 212-213 II GlcA H OH OH OH OMba 766,95 218-219 0,5 IV GlcA H OH OH OH OTig 764,94 210-221 0,25 V GlcA H OH OH OTig OTig 847,04 202-203 0,5 VI A H OH OH OH OTig 927,08 225-226 0,5 VII GlcA H OH OH H OH 666,84 222-223 (-) VIII B H OH OH OH OMba 927,08 218-220 (-) IX B H OH OH OH OTig 925,06 222-224 (-) 10 X GlcA H OH OAc OH OH 724,86 210-212 0,5 XI GlcA H OH OTig OH OTig 874,04 190-192 XII A H OH OAc OH OTig 968,50 209-211 XIII GlcA H OH OMba OH OH 766,95 185-187 0,5 XIV GlcA H OH OTig OH OH 764,94 194-196 0,5 XV GlcA H OH OH OTig OMba 849,06 …/… XVI GlcA H Tig OH OTig OH 847,04 203-205 XVII GlcA H OH OH OH OBz 786,94 211-213 XVIII GlcA H OH OBz OH OH 786,94 201-203 Ghi chú: TD*: tác dụng hạ đường huyết x tác dụng hạ đường huyết acid gymnemic I, (-): không phát 2.3 Cơ chế tác dụng acid gymnemic dây thìa canh Cơ chế tác dụng dây thìa canh chủ yếu thơng qua kích thích tiết hormon INS từ tuyến tụy Ngồi ra, cịn có tác dụng trì hỗn hấp thụ glucose vào máu Cấu trúc nguyên tử acid gymnemic tương tự phân tử đường chúng cạnh tranh vị trí gắn vào thụ thể vị giác từ làm giảm vị thức ăn Tương tự, ruột gắn vào thụ thể niêm mạc ruột, từ ngăn chặn hấp thụ phân tử đường ruột, dẫn đến giảm lượng đường máu Tác dụng hạ đường huyết acid gymnemic bao gồm chuỗi trình điều tiết điều tiết hoạt động incretin làm tăng sản xuất giải phóng hormon INS Tiếp theo làm tăng tái tạo tế bào đảo tụy để tăng cường hấp thu qua enzyme trung gian glucose Quá trình làm giảm đồng hóa glucose acid béo ruột non cản trở khả thụ thể cảm nhận vị miệng ruột Đã có báo cáo trước cho thấy chế tác dụng acid gymnemic tương tự chất mô incretin Acid gymnemic tìm thấy có tương tác với glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), enzyme chủ chốt 11 đường glycolysis Các phát gốc acyl có acid gymnemic đóng vai trị quan trọng việc phá hủy GAPDH G3PDH đóng vai trị khơng thể thiếu hoạt động hạ đường huyết dẫn xuất acid gymnemic 2.4 Sinh khả dụng Acid gymnemic có độ hịa tan lipid cấu trúc phức tạp nên khó qua màng sinh học để hấp thụ hệ tuần hoàn Pathan cộng phát triển công thức thảo dược (phytosome, phức hợp acid gymnemic phospholipid) với mục đích cải thiện khả hấp thụ sinh học dược động học Phytosome thể hấp thu thể sinh khả dụng tốt khả tăng sinh khối lipid lưu thơng tồn thân Phức hợp thể tiềm chống ung thư nhiễm độc tim doxorubicin gây chuột cho thấy tác dụng bảo vệ tim mạch Nghiên cứu độc tính chiết xuất dây thìa canh cho thấy an tồn dùng liều khuyến cáo Liều cao dẫn đến tác dụng phụ bao gồm hạ đường huyết, yếu cơ, run rẩy, đổ mồ hôi nhiều loạn dưỡng Sử dụng acid gynemic chế độ ăn chuột Wistar 52 tuần cho thấy khơng có tác dụng bất lợi khơng có động vật chết thí nghiệm 12 Chương Phương pháp chiết xuất 3.1 Phương pháp chiết xuất saponin Có nhiều quy trình chiết xuất saponin khác nhau, tiến hành chiết xuất tinh chế sơ saponin theo quy trình sau: 3.1.1 Saponin trung tính acid Có thể tiến hành sau: bột dược liệu chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo chiết saponin methanol - nưóc (4:1) Loại methanol áp suất giảm Hòa cặn nước để có dung dịch 10% lắc với n-butanol Tách lớp n-butanol, bốc butanol áp suất giảm thu lấy cắn Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất saponin trung tính acid 3.1.2 Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan solanidan Bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi nồi cách thủy Dịch lọc đem bốc 13 đến khơ nồi cách thủy, cắn hồ tan acid acetic 5%, đun nóng đến 80°C kiềm hoá ammoniac, lọc lấy tủa, sấy làm khơ thu saponin tinh chế Hình 3.2 Sơ đồ tinh chế saponin kiềm 3.1.3 Tinh chế saponin Có thể thực với phương pháp sau: - Thẩm tích - Dùng bột MgO bột polyamid để tách saponin khỏi tanin: saponin hòa vào nước trộn với bột polyamid bột Mg oxyd nồi cách thủy 10 phút để có khối nhão Sau chiết saponin từ khối nhão ethanol 80% nóng Lọc bốc - Dùng Sephadex G-25, G-50, G-75: lượng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin đem ngâm nước cất cho trương nở, gạn bỏ lượng nước thừa, cho gel vào cột sắc ký Cho dung dịch đậm đặc saponin nước cho lên phần cột khai triển nước cất Saponin có phân tử lớn khỏi cột trưóc saponin có phân tử nhỏ 14 Dùng Sephadex LH-20: cách acyl hoá alkyl hoá nhóm OH phân tử loại Sephadex G nói trên, người ta chế loại Sephadex vừa có tính thân nước vừa có tính thân dung mơi hữu Ví dụ từ Sephadex G-25 cách alkyl hố người ta thu Sephađex LH-20 có khả sử dụng với dung môi nước, alcol, aceton chloroform Loại dùng để tách saponin hiệu - Để tinh chế saponin steroid dùng phương pháp kết hợp với cholesterol: g saponin hịa 200 ml ethanol đun nóng đến 50 - 60°c cho tác dụng với dung dịch chứa g cholesterol 200 ml ethanol đun nóng, tủa phức tạo thành Sau nguội đem lọc tủa sấy khơ Phá phức cách hồ tan pyridin Saponin tinh khiết dược tủa ether Để loại hết cholesterol, tủa hòa tan methanol lại tủa với ether - Để tinh chế dẫn chất nhóm glycoalcaloid, ngưịi ta hịa tan chúng vào nbutanol cho lên cột chứa nhơm oxyd, đẩy nước bão hòa n-butanol 3.2 Một số phương pháp chiết xuất acid gymnemic 3.2.1 Phương pháp chiết pha rắn Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction - SPE) kỹ thuật chiết tách dựa nguyên tắc chung kỹ thuật sắc ký, pha động pha lỏng pha tĩnh hạt rắn Trong nhiều phương pháp dung để tách làm giàu hoạt chất thiên nhiên (chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn, kết tủa, cộng kết, sắc ký,…), chiết pha rắn có ưu điểm vượt trội so với phương pháp khác độ chọn lọc, hệ số làm giàu cao, sử dụng dung mơi, thao tác đơn giản, dễ tự động hóa rẻ tiền Theo chất tương tác với chất phân tích, loại hạt sử dụng kĩ thuật chiết pha rắn phân loại thành loại như: hạt hấp phụ (tương tác phân cực – phân cực, liên kết hydro, tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, hạt trao đổi ion (lực tĩnh điện), hạt rây phân tử (lọc chất phân tích theo kích thước phân tử) 3.2.2 Chiết xuất phương pháp ngâm - Chuẩn bị nguyên liệu: Dược liệu dây thìa canh cắt nhỏ, sấy khơ nhiệt độ 60oC đến hàm ẩm < 10%, xay tới bột thô bảo quản túi ni long kín - Chiết dược liệu: 15 Cân lượng xác định bột dược liệu, thấm ẩm ethanol 60% cho dược liệu trương nở hoàn toàn nạp vào thiết bị chiết Lót lớp bơng thấm nước lên ống thoát dịch chiết để bột dược liệu khơng gây tắc bình lẫn vào dịch chiết Sau đặt giấy lọc cắt vừa vặn vào đáy bình Cho bột dược liệu thấm ẩm vào bình, vừa cho vừa san nén nhẹ Đổ từ từ dung mơi ethanol 60% vào bình chiết dịch chiết bắt đầu chảy khóa lại Tiếp tục bổ sung dung mơi ngập bề mặt dược liệu khoảng 3-4cm (600ml 100g dược liệu) Ngâm 24 Hết thời gian ngâm, mở khóa thu lấy dịch chiết Bổ sung dung môi tiến hành chiết ngâm thêm lần với lượng dung môi thời gian tương tự Gộp dịch chiết thu dịch chiết ethanol 60% Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất acid gymnemic từ dây thìa canh phương pháp ngâm 16 3.2.3 Chiết xuất acid gymnemic từ mô sẹo a Phân lập acid gymnemic từ mơ sẹo Hình 3.4 Sơ đồ phân lập acid gymenemic từ mô sẹo 17 b Chuyển acid gymnemic thành hỗn hợp genin Hình 3.5 Sơ đồ chuyển aicd gymnemic thành gymnemagenin 3.2.4 Tinh chế acid gymnemic từ dây thìa canh - Bước 1: Chiết xuất ether dầu hỏa Lá dây thìa canh sau thu hái cắt nhỏ, sấy khô nhiệt độ 60oC đến hàm ẩm