Xác định khả năng chống oxy hóa và kháng viêm từ dịch chiết tảo lục chlorella vulgaris

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~***~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM TỪ DỊCH CHIẾT TẢO LỤC CHLORELLA VULGARIS HÀ NỘI, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~***~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM TỪ DỊCH CHIẾT TẢO LỤC CHLORELLA VULGARIS Sinh viên thực : Nguyễn Thành Vinh Mã sinh viên : 637091 Lớp : K63CNSHA Giảng viên hƣớng dẫn : TS Phí Thị Cẩm Miện HÀ NỘI, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả, hình ảnh, số liệu nghiên cứu đƣợc sử dụng luận văn trung thực, chƣa đƣợc sử dụng báo cáo Tất thơng tin đƣợc trích dẫn khóa luận đƣợc rõ nguồn gốc giúp đỡ đƣợc cảm ơn Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Nguyễn Thành Vinh i năm 2022 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, nỗ lực cố gắng thân, tơi nhận đƣợc giúp đỡ, động viên tích cực từ cá nhân, tập thể Trong thời gian thực tập Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhận đƣợc quan tâm, bảo tận tình Thầy, cán phịng thí nghiệm Cùng với cố gắng, nỗ lực thân, học kinh nghiệm tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tồn thể Thầy, Cơ truyền đạt cho kiến thức chuyên ngành, kỹ làm việc phịng thí nghiệm học quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Phí Thị Cẩm Miện tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn tất anh, chị, bạn bè làm việc mơn sinh học tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến bổ ích tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Mặc dù cố gắng hoàn thiện luận văn nhiệt tình, lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đƣợc đóng góp q thầy bạn để tơi hồn thành khóa luận đƣợc tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Nguyễn Thành Vinh ii năm 2022 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ viii TÓM TẮT ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu tảo lục C.vulgaris 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Hình thái cấu trúc tế bào 2.1.3 Thành phần hóa học .4 2.1.4 Đặc điểm sinh sản 2.1.5 Môi trƣờng nuôi tảo C.vulgaris .5 2.1.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển tảo C.vulgaris 2.1.7 Ứng dụng tảo lục C.vulgaris 2.2 Kỹ thuật nuôi sinh khối phƣơng pháp nhân giống tảo lục C.vulgaris .13 2.2.1 Các phƣơng pháp đánh giá 13 2.2.2 Bảo quản giống 13 2.2.3 Kỹ thuật nuôi giống .14 2.2.4 Thu hoạch vi tảo 14 2.3 Một số phƣơng pháp tách chiết 14 2.3.1 Chiết soxhlet 14 iii 2.3.2 Ngâm dầm 16 2.3.3 Ngấm kiệt 16 2.4 Một số phƣơng pháp xác định khả chống oxi hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris 18 2.4.1 Đánh giá khả chống oxy hóa phƣơng pháp DPPH 18 2.4.2 Đánh giá khả chống oxy hóa phƣơng pháp MDA .18 2.5 Xác định khả kháng viêm từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris .19 2.6 Tình hình nghiên cứu C.vulgaris Việt Nam giới .19 2.6.1 Tình hình nghiên cứu tảo lục C.vulgaris Việt Nam 19 2.6.2 Tình hình nghiên cứu tảo lục C.vulgaris giới 21 PHẦN III ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 3.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu .26 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 26 3.2 Thời gian địa điểm .26 3.2.1 Địa điểm thực 26 3.2.2 Thời gian thực 26 3.3 Nội dung nghiên cứu 27 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 3.4.1 Các phƣơng pháp thu cao chiết tảo lục C.vulgaris 27 3.4.2 Đánh giá khả chống oxy hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp DPPH 28 3.4.3 Đánh giá khả chống oxy hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp MDA 31 3.4.4 Đánh giá khả kháng viêm từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp biến tính protein 33 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Nghiên cứu tách chiết thu dịch chiết tảo lục C.vulgaris 34 4.2 Đánh giá khả chống oxy hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp DPPH 35 iv 4.2.1 Xây dựng đồ thị chuẩn Trolox 36 4.2.2 Đánh giá khả loại bỏ gốc tự dịch chiết C.vulgaris 37 4.3 Đánh giá khả chống oxy hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp MDA .39 4.4 Đánh giá khả kháng viêm từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp biến tính protein 40 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .44 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT C.vulgaris Chlorella vulgaris BOD Biochemical Oxygen Demand COD Chemical Oxygen Demand LED Light Emitting Diode DPPH 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl OD Optical Density MDA Malonyl dialdehyde IC50 The half maximal inhibitory concentration BSA Bovine Serum Albumin NSAID Non-steroidal Anti-inflammatory Drug CGF Chlorella Growth Facter Trolox (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid EC50 The half maximal effective concentration vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần hóa học chứa tảo C.vulgaris .4 Bảng 2.2 So sánh ƣu nhƣợc điểm số phƣơng pháp tách chiết thông dụng .17 Bảng 3.1 Bảng công thức pha mẫu cao chiết C.vulgaris .29 Bảng 3.2 Bảng công thức pha dung dịch Trolox đối chứng 31 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng phƣơng pháp chiết tới khối lƣợng cao chiết thu đƣợc 34 Bảng 4.2 Hoạt tính chất chống oxy hóa dịch chiết phƣơng pháp DPPH 38 Bảng 4.3 Giá trị IC50 loại chiết xuất thử nghiệm DPPH 39 Bảng 4.4 Hoạt tính chống oxy hóa mẫu dịch chiết C.vulgaris thí nghiệm MDA 40 Bảng 4.5 Giá trị IC50 cao chiết C.vulgaris chất đối chiếu 41 vii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Tế bào tảo C.vulgaris .3 Hình 2.2 Các sản phẩm dinh dƣỡng từ tảo C.vulgaris 10 Hình 2.3 Nguyên lý hoạt động soxhlet 15 Hình 2.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH chất chống oxy hóa 18 Hình 3.1 Phƣơng pháp tách chiết thu dịch chiết phƣơng pháp soxhlet 28 Hình 3.2 Hóa chất Trolox 30 Hình 3.3 Hóa chất acid thiobarbituric 32 Hình 4.1 Cân mẫu thí nghiệm 34 Hình 4.2 Dịch chiết mẫu tảo lục C.vulgaris 35 Hình 4.3 Cao chiết C.vulgaris .35 Hình 4.4 Hóa chất DPPH .36 Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn trolox 36 Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng trolox đến loại bỏ gốc tự .37 Biểu đồ 4.3 Ảnh hƣởng dịch chiết đến khả loại bỏ gốc tự 38 Biểu đồ 4.4 Phần trăm ức chế biến tính albumin theo nồng độ cao chiết C.vulgaris chất đối chiếu 41 viii Hình 3.3 Hóa chất acid thiobarbituric Pha mẫu thử: Đƣợc pha nồng độ 8000 µg/ml, 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml sau cho 0.1 ml mẫu thử nồng độ thử nghiệm đƣợc cho phản ứng với ml dịch đồng thể não thêm 0.8 ml đệm phosphat, 0,1 ml hệ fenton vừa đủ ml nồng độ mẫu cịn 400 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml , 50 µg/ml 25 µg/ml Cách tiến hành: Tách não chuột nghiền đồng thể dung dịch đệm phosphat (pH=7.4) theo tỉ lệ 1:10 nhiệt độ 0-4°C Lấy 1ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml mẫu thử nồng độ 0,8ml đệm phosphat thêm 0.1ml hệ Penton (FeSO4 0.1 mM: H2O2 15mM theo tỉ lệ 1:1) Ủ hỗn hợp 37°C 15 phút Dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% Ly tâm 12000 vòng phút Lấy dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% (theo tỉ lệ 2:1) Ủ nhiệt độ 100°C 15 phút Làm lạnh tiến hành đo bƣớc sóng λ = 532 nm Trolox đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu tham khảo Công thức tính tốn: Cơng thức tính phần trăm hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] × 100 ODC : Mật độ quang học giếng chứng khơng có mẫu thử ODT : Mật độ quang học mẫu thử 32 3.4.4 Đánh giá khả kháng viêm từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phương pháp biến tính protein Phản ứng kháng viêm đƣợc đánh giá dựa vào khả gây biến tính protein Biến tính protein đƣợc định nghĩa q trình yếu tố bên nhƣ nhiệt, axit mạnh bazơ mạnh; dung môi hữu muối vô đậm đặc làm cho protein biến tính có nghĩa cấu trúc bậc ba cấu trúc bậc hai protein bị thay đổi Do chất enzyme protein, protein biến tính dẫn đến enzyme hoạt tính chất khơng cịn khả gắn vào vị trí hoạt động Các thuốc chống viêm khơng steroid (NSAID) có tác dụng giảm đau ngăn ngừa biến tính protein Dựa sở phản ứng kháng viêm đƣợc thực cách ủ protein gây biến tính với có mặt khơng có mặt hợp chất cần thử hoạt tính Sự thay đổi cấu trúc protein biến tính dẫn đến thay đổi phổ hấp thụ bƣớc sóng ánh sáng Trong nhiều nghiên cứu, phƣơng pháp xác định khả kháng viêm thử nghiệm khả ức chế biến tính albumin nhiệt hợp chất từ thiên nhiên đƣợc coi phƣơng pháp nhanh chóng, đơn giản xác cao Hoạt tính kháng viêm đƣợc đánh giá thơng qua khảo sát ức chế biến tính albumin mơ hình in vitro (Trần Quốc Tuấn cs 2014) với đối chứng dƣơng diclofenac Hút ml đệm acetate 0,025 M (pH 5.5), bổ sung thêm ml albumin huyết bò 0.16% ml cao chiết nồng độ sau ủ 37°C 30 phút Đun cách thủy 67°C phút, làm lạnh đo mật độ quang bƣớc sóng 660 nm Mỗi ống phản ứng đƣợc lặp lại lần giá trị trung bình đƣợc sử dụng với sai số Phần trăm ức chế protein đƣợc xác định dựa vào phần trăm tƣơng ứng so với đối chứng theo cơng thức sau: % ức chế = ([(ODc-ODm)×100])/ODc Trong : ODm: mật độ quang mẫu ODc: mật độ quang mẫu trắng (thay cao chiết đệm) Sau đó, xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính (y=ax+b) % ức chế nồng độ mẫu, xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà 50% protein bị biến tính) 33 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu tách chiết thu dịch chiết tảo lục C.vulgaris Mẫu C.vulgaris sau thu, xử lý đƣợc tiến hành tách chiết để thu dịch chiết Lƣợng mẫu dùng cho lần chiết 10g mẫu đƣợc lặp lại lần, kết lấy giá trị trung bình để đạt đƣợc độ xác cao Hình 4.1 Cân mẫu thí nghiệm Sau cô đuổi dung môi thời gian định, để lắng 24h, loại bỏ dung môi thu đƣợc cao chiết Mỗi mẫu đƣợc lặp lại lần, kết lấy giá trị trung bình để đạt đƣợc độ xác cao Cân khối lƣợng cao khơ xác cân phân tích Bảng 4.1 Ảnh hƣởng phƣơng pháp chiết tới khối lƣợng cao chiết thu đƣợc Phƣơng pháp Khối lƣợng cao Hiệu suất chiết chiết (g) (%) Soxhlet 1.294 0.138 12.94 Cao lỏng, màu xanh đậm 0,394 0,053 3.94 Cao đặc, màu xanh đậm 0.524 0.071 5.24 Cao lỏng, màu xanh nhạt Ngâm dầm dung môi ethanol Ngâm dầm dung môi nƣớc cất 34 Đặc điểm cao thu đƣợc Từ kết tách chiết, ta thấy tách chiết phƣơng pháp Soxhlet phƣơng pháp ngâm dầm với hai dung môi khác tạo khối lƣợng cao chiết khác Mẫu tảo đƣợc tách chiết với phƣơng pháp soxhlet cho khối lƣợng cao chiết nhiều so với phƣơng pháp ngâm dầm dung môi khác Vậy nên, ta dùng cao chiết đƣợc tách chiết phƣơng pháp soxhlet cho thí nghiệm Hình 4.2 Dịch chiết mẫu tảo lục C.vulgaris Ghi chú: (A) Dịch chiết sau soxhlet, (B) cô đuổi dung môi thu cao chiết Hình 4.3 Cao chiết C.vulgaris 4.2 Đánh giá khả chống oxy hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp DPPH DPPH hợp chất có màu tím đƣợc phát bƣớc sóng 517 nm Khi điện tử lẻ gốc tự DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa hình thành nên DPPH–H lúc màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng Sự biến đổi 35 màu tƣơng ứng với lƣợng electron kết hợp với DPPH (Prakash et al., 2000) Do đó, khả làm gốc tự chất cao hấp thụ quang phổ đƣợc đo 517 nm phản ứng DPPH có giá trị giảm ngƣợc lại Hình 4.4 Hóa chất DPPH 4.2.1 Xây dựng đồ thị chuẩn Trolox Để xác định khả chống oxy hoá mẫu dịch chiết, đƣờng chuẩn trolox với dải nồng độ từ đến 75µM Kết đồ thị chuẩn trolox đƣợc trình bày hình dƣới Căn vào kết đồ thị chuẩn, giá trị IC50 trolox xác định đƣợc 33.625 µg/ml Dựa đồ thị chuẩn trolox quy đổi mức độ loại bỏ gốc tự DPPH tính theo % 1,4 DPPH (OD517) 1,2 0,8 0,6 y = -0,0065x + 1,2251 R² = 0,9989 0,4 0,2 0 20 40 Nồng độ Trolox (µM) Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn trolox 36 60 80 Dựa vào đồ thị chuẩn trolox cho thấy nồng độ chất chuẩn tăng dần (từ 0- 75 µM) giá trị đo OD bƣớc sóng 517 nm giảm dần Khả kháng oxy hóa chất chuẩn đƣợc thể qua giá trị IC50, nồng độ mẫu ức chế đƣợc 50% gốc tự Giá trị IC50 thấp mẫu có hoạt tính kháng oxy hóa cao ngƣợc lại Dựa đồ thị chuẩn trolox quy đổi mức độ loại bỏ gốc tự DPPH tính theo % Kết loại bỏ gốc tự DPPH đƣợc thể hình dƣới đây: mức độ loại bỏ gốc tự DPPH (%) 80 Nồng độ trolox 70 60 50 40 30 20 10 10 25 50 75 Nồng độ trolox Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng trolox đến loại bỏ gốc tự Kết từ biểu đồ 4.2 cho thấy mức độ phần trăm loại bỏ gốc tự DPPH chất chuẩn trolox đạt 63.71% nồng độ 75 µM Nồng độ cao phần trăm loại bỏ gốc tự tăng Tại nồng độ 50 µM chất chuẩn đạt mức ức chế đƣợc 50% gốc tự 4.2.2 Đánh giá khả loại bỏ gốc tự dịch chiết C.vulgaris Khả làm gốc tự nồng độ cao chiết C.vulgaris tính tƣơng đƣơng theo µM trolox dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn, kết đƣợc trình bày bảng 4.2 37 Bảng 4.2 Hoạt tính chất chống oxy hóa dịch chiết phƣơng pháp DPPH Khả chống oxy hóa dịch chiết tảo lục C.vulgaris Nồng độ (μg/ml) Soxhlet (%) 62.09 ± 0.59 Ngâm dầm nƣớc cất (%) 43.28 ± 0.62 Ngâm dầm ethanol (%) 53.79 ± 0.44 400 200 39.42 ± 0.53 30.84 ± 0.21 38.98 ± 0.63 100 21.49 ± 0.59 13.68 ± 0.63 21.41 ± 0.22 50 9.31 ± 0.29 4.73 ± 0.45 5.61 ± 0.35 Loại bỏ gốc DPPH (%) Cao soxhlet Cao ngâm dầm ethanol Cao ngâm dầm nƣớc cất 70 60 50 40 30 20 10 50 100 200 400 Nồng độ (ug/ml) Biểu đồ 4.3 Ảnh hƣởng dịch chiết đến khả loại bỏ gốc tự Từ kết bảng 4.2 biểu đồ 4.3, nhận thấy tất dịch chiết tảo lục C.vulgaris có hoạt tính chống oxy hóa, nồng độ khác nhau, phụ thuộc nồng độ dung môi chiết xuất Khi tăng dần nồng độ dịch chiết, khả ức loại bỏ gốc tự tăng dần Điều cho thấy khả loại bỏ gốc tự phụ thuộc vào nồng độ 38 Trong dịch chiết dịch chiết đƣợc chiết phƣơng pháp Soxhlet dung môi ethanol cho hoạt tính chống oxy hóa cao phƣơng pháp cịn lại (62.09% nồng độ 400 μg/mg) Ở dịch chiết thu đƣợc phƣơng pháp ngâm dầm với dung môi nƣớc cất cho hoạt tính chống oxy hóa Bảng 4.3 Giá trị IC50 loại chiết xuất thử nghiệm DPPH IC50 (μg/ml) Cao Soxhlet Cao ngâm dầm ethanol Cao ngâm dầm nƣớc cất 173.89 343.59 437.24 Kết cho thấy khả làm gốc tự tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết, nồng độ cao chiết cao khả làm gốc tự lớn ngƣợc lại Khả làm 50% gốc tự IC50 đƣợc tính tốn dựa vào đồ thị 4.1 kết đƣợc trình bày bảng 4.2 bảng 4.3 Trong cao chiết Soxhlet có khả làm gốc tự cao (IC50= 173.89 µg/ml) sau cao ngâm dầm ethanol (IC50= 343.59 µg/ml), cuối cao ngâm dầm nƣớc cất (IC50= 437.24 µg/ml) 4.3 Đánh giá khả chống oxy hóa từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp MDA Tách não chuột nghiền đồng thể dung dịch đệm phosphat (pH=7.4) theo tỉ lệ 1:10 nhiệt độ 0-4oC Lấy ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml mẫu thử nồng độ 0,8 ml đệm phosphat thêm 0,1 ml hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15 mM theo tỉ lệ 1:1) Ủ hỗn hợp 37oC 15 phút Dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% Ly tâm 12000 vòng phút Lấy dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% (theo tỉ lệ 2:1) Ủ nhiệt độ 100oC 15 phút Làm lạnh tiến hành đo bƣớc sóng λ = 532 nm Trolox đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu tham khảo Kết xác định hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ức chế q trình peroxy hố lipid màng tế bào (thử nghiệm MDA) đƣợc trình bày bảng 4.4 39 Bảng 4.4 Hoạt tính chống oxy hóa mẫu dịch chiết C.vulgaris thí nghiệm MDA Khả chống oxy hóa dịch chiết tảo lục C.vulgaris Cao ngâm Cao ngâm dầm ethanol dầm nƣớc cất (%) (%) 53.06 ± 0.34 31.04 ± 0.21 35.53 ± 0.46 81.25±0.42 100 18.2 ± 0.41 11.2 ± 0.134 12.92 ± 0.24 77.53 ± 0.39 20 9.12 ± 0.42 6.45 ± 0.34 7.75 ± 0.36 62.33 ± 0.38 3.85 ± 0.34 2.97 ± 0.54 3.65 ± 0.45 33.16 ± 0.35 0.8 1.42 ± 0.10 1.17 ± 0.45 1.35 ± 0.10 15.66 ± 0.57 IC50 268.5 (µg/ml) >500 >500 10.04 (µg/ml) Nồng độ Cao Soxhlet (µg/ml) (%) 500 Trolox (%) Hoạt tính chống oxy hóa MDA mẫu nghiên cứu cho thấy nồng độ chất mẫu tăng dần khả ức chế MDA tăng lên Điều chứng tỏ khả chống oxy hóa chất chiết tăng tỷ lệ thuận với gia tăng nồng độ mẫu thử ống nghiệm, với nồng độ mẫu 0.8 (µg/ml) % ức chế MDA thấp, mẫu đƣợc chiết Soxhlet, tỷ lệ % ức chế MDA (1.42%), mẫu có nƣớc có % MDA bị ức chế (1.17%), mẫu chiết xuất ethanol, % ức chế MDA (1.35%) Nồng độ mẫu thử tăng lên 20 (µg/ml), mẫu cho thấy khả ức chế MDA mẫu chiết soxhlet, mẫu chiết nƣớc, mẫu chiết ethanol, tỷ lệ % ức chế MDA lần lƣợt 9.12; 6.45; 7.75 Nồng độ mẫu thử cao 500 (µg/ml), tỷ lệ % ức chế MDA ba mẫu thử tƣơng ứng mẫu đƣợc chiết soxhlet (53.06%), mẫu chiết nƣớc (31.04%) mẫu đƣợc chiết ethanol (35.53%) Mẫu đƣợc chiết xuất soxhlet cho thấy khả ức chế peroxy hóa lipid cao mẫu có IC50=268.5 (μg/ml) 4.4 Đánh giá khả kháng viêm từ dịch chiết tảo lục C.vulgaris phƣơng pháp biến tính protein Q trình viêm thể giải phóng chất trung gian, chất làm nhiệt độ thể tăng, gây biến tính loại protein thể thơng qua liên kết protein nhƣ liên kết hydro, liên kết ion, lực Van der Waals tƣơng tác tĩnh điện 40 (Shashidhar et al., 2013) Thông qua khả bảo vệ protein khỏi biến tính nhiệt đánh giá khả kháng viêm cao chiết Biểu đồ 4.4 Phần trăm ức chế biến tính albumin theo nồng độ cao chiết C.vulgaris chất đối chiếu Phân tích kết thu đƣợc dãy nồng độ khảo sát cho thấy, diclofenac (NSAIDs) chất thể khả ức chế biến tính albumin cao xét nồng độ 125 mg/mL tƣơng ứng 97.5% Cũng nồng độ này, hai dạng cao chiết C.vulgaris thấy phần trăm ức chế cao phân đoạn cao chiết phƣơng pháp soxhlet (89.48%), cao C.vulgaris phƣơng pháp ngâm dầm với dung mơi ethanol (75.8%), cịn phân đoạn cao C.vulgaris phƣơng pháp ngâm dầm với dung mơi nƣớc cất có phần trăm ức chế thấp (33.6%) Dựa vào giá trị khảo sát xác định đƣợc giá trị IC50 (g/mL) cao soxhlet, cao ngâm dầm ethanol, cao ngâm dầm nƣớc cất chất đối chiếu Kết đƣợc trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5: Giá trị IC50 cao chiết C.vulgaris chất đối chiếu Mẫu IC50 (g/mL) Cao Soxhlet 79.89 Cao ngâm dầm Ethanol 278.00 Cao ngâm dầm nƣớc cất 695.91 Diclofenac 36.88 41 Khả ức chế biến tính albumin cao IC50 thấp Từ kết cho thấy, cao chiết, cao phân đoạn soxhlet có khả ức chế biến tốt so với cao phân đoạn lại với IC50 = 79.89 μg/ml, cụ thể khoảng 1/2 lần diclofenac Các phân đoạn có khả ức chế biến tính albumin nhiệt dựa vào giá trị IC50 đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần cao soxhlet > cao ngâm dầm ethanol > cao ngâm dầm nƣớc cất Kết cho thấy tảo lục C.vulgaris có khả kháng viêm tốt 42 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết tách chiết, ta thấy tách chiết phƣơng pháp Soxhlet phƣơng pháp ngâm dầm với hai dung môi khác tạo khối lƣợng cao chiết khác Mẫu tảo đƣợc tách chiết với phƣơng pháp soxhlet cho khối lƣợng cao chiết nhiều so với phƣơng pháp ngâm dầm dung môi khác Trong phƣơng pháp DPPH xác định khả chống oxy hóa cho kết luận thử nghiệm mẫu, hoạt tính chống oxy hóa mẫu chiết soxhlet cao nồng độ 400 (µg/ml) với tỷ lệ phần trăm khả chống oxy hóa 62.09% Theo chiều tăng nồng độ, giá trị mật độ quang OD mẫu cao chiết tăng dần (sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê) Nồng độ cao, tổng lực khử hoạt tính chống oxy hóa mạnh Hoạt tính chống oxy hóa MDA mẫu nghiên cứu cho thấy nồng độ chất mẫu tăng dần khả ức chế MDA tăng lên Điều chứng tỏ khả chống oxy hóa chất chiết tăng tỷ lệ thuận với gia tăng nồng độ mẫu thử ống nghiệm Các phân đoạn có khả ức chế biến tính albumin nhiệt dựa vào giá trị IC50 đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần cao soxhlet > cao ngâm dầm ethanol > cao ngâm dầm nƣớc cất Kết cho thấy tảo lục C.vulgaris có khả kháng viêm tốt Đánh giá đƣợc tảo lục C.vulgaris có khả kháng viêm tốt 5.2 Kiến nghị Tảo lục C.vulgaris có nhiều nhóm hợp chất khác có khả chữa bệnh cao Từ kết thu đƣợc, cần phân tích để xác định thành phần hợp chất khác dịch chiết phƣơng pháp khác, đề xuất nghiên cứu sâu thành phần hóa học nhƣ hoạt tính sinh học tảo lục C.vulgaris 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Amanda Geis, William Sampson, Tai-Yin Huang, Jacqueline S McLaughlin, 2016 “The Effects of LED Lights on the Growth of Chlorella vulgaris” Journal of Introductory Biology Investigations, Vol 3, No.5 Bold H.C, and Wynne M.J, Prentice-Hall, 1978 “Introduction to the algae: Structure and reproduction” New Jersey, pp 706 Georgi P, Guilermo G, 2007 “Which are fatty acids of the green alga Chlorella” Biochemical Systematics and Ecology, vol 35, no 5, pp 281 – 285 Grant N.H, Alburn H.E, and Kryzanauskas C, 1970 “Stabilization of serum albumin by antiinflammatory drugs” Biochemical Pharmacology 19(3): 715-722 Kuchitsu K, Oh-hama T, Tsuzuki M, Miyachi S, 1987 “Detection and characterization of acidic compartments (vacuoles) in Chlorella vulgaris 11 h cells by 31P-in vivo NMR spectroscopy and cytochemical techniques” Arch Microbiol;148:83-7 Lordan S, Ross R.P, Stanton C, 2011 “Marine bioactives as functional food ingredients: potential to reduce the incidence of chronic diseases” Mar Drugs;9: 1056-100 Lovric J, Mesic M, Macan M, Koprivanac M, Kelava M and Bradamante V, 2008 “Measurement of malondialdehyde (MDA) level in rat plasma after simvastatin treatment using two different analytical methods” Periodicum Biologorum 110(1): 63-67 Martysiak-Żurowska M and Stołyhwo A, 2006 “Content of malondialdehyde (MDA) in infant formulae and follow-on formulae” Polish Journal of Food and Nutrition Sciences 56(3): 323-328 Miliauskas G, Venskutonis P.R, and Beek T.A, 2004 “Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts” Food Chemistry 85: 231-237 44 10 Qitao Gong, Yuanzheng Feng, Ligai Kang, Mengyuan Luo, Junhong Yang, 2014 “Effects of light and pH on cell density of Chlorella vulgaris”, ELSEVIER, Energy Procedia 61 11 Scragg A.H, Morrision J, Shales S.W, Stroer, 2003 “The use of a fule containing Chlorella vulgaris in a diesel engine”, Enzyme and Microbial Technology, vol 33, no 7, pp 884 – 889 12 Sharma S, Hullatti K.K, Sachin K and Tiwari K.B, 2012 “Comparative antioxidant activity of Cuscuta reflexa and Cassytha filiformis” Journal of pharmacy research 5(1): 44-443 13 Shashidhar M, Giridhar P, Sankar K.U, Manohar B, 2013 “Bioactive principles from Cordyceps sinensis: a potent food supplement - a review”, Journal of Functional Foods, 5(3), pp.1013-1030 14 Šoštariè M, Golob J, Bricelj M, Klinar D, and Pivec A, 2019 “Studies on the growth of chlorella vulgaris in culture media with different carbon sources”, Chem Biochem Eng Q 23 (4) 471–477 15 Stroev E.A, Makarova V.G, 1998 “Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory” Manual in Biochemistry (Moscow) 243 16 Thaipong K, Boonprakob U, Crosby K, CisnerosZevallo L, Byrne D.H, 2006 “Comparison of ABTS,DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts” Journal of Food Composition and Analysis 19, 669-675 17 Van den Hoek C, Mann D, Jahns H, 1995 “Algae: an introduction to phycology” Cambridge, United Kingdom: Cambridge University Press 18 Wang et al, 2010 “Potential and flux landscapes quantify the stability and robustness of budding yeast cell cycle network” Proc Natl Acad Sci USA 107(18):8195-200 19 Wang K, Brown R.C, Homsy S, Martinez L, Sidhu S.S, 2013 “Fast pyrolysis of microalgae remnants in a fluidized bed reactor for bio-oil and biochar production” Bioresour Technol;127:494-9 45 20 Wong Y.K, Ho K.C, Tsang Y.F, Wang L, Yung K.K.L, 2016 “Cultivation of Chlorella vulgaris in Column Photobioreactor for Biomass Production and Lipid Accumulation”, Water Environment Res., 88, 40 21 Yanna Liang, Nicolas Sarkany, Yi Cui, 2009 “Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions”, Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529-0099975-7 22 Yvonne N, Tomas K, 2000 “Cell wall development, microfibril and pyrenoid structure in type strains of Chlorella vulgaris”, C kessleri, C sorokiniana compared with C luteoviridis (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) Arch Hydrobiol;100:95-105 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Ngọc, T.S., H.T.N.H Phạm, and T.T Ngân, 2017 “Khả phát triển tảo Chlorella sp điều kiện dị dƣỡng”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, p 127-132 Nguyễn Lân Dũng, 2009 Giáo trình vi sinh vật học, NXB Giáo dục Nguyễn Minh Tuấn, Lê Thị Bích Yến, Nguyễn Thị Thanh Xuân, 2012 “Nghiên cứu nuôi trồng vi tảo Chlorella Vulgaris làm nguyên liệu sản xuất biodiesel”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, số 10, tr 32 Trần Chấn Bắc, Nguyễn Thi Thanh Xuân, Đặng Kim Hoàng, Võ Thị Thƣơng, 2015 “Sử dụng nƣớc thải ao nuôi cá tra để nuôi sinh khối tảo chlorella sp.”, Tạp Chí Khoa Học Công Nghệ trường Đại Học Cần Thơ, số 39, tr 90-96 Trần Quốc Tuấn, Lê Thị Oanh, Đinh Minh Hiệp Ngơ Đại Nghiệp, 2014 “Chuẩn hóa mơ hình sàng lọc in vitro hợp chất kháng viêm dựa khả ức chế biến tính albumin bị nhiệt”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(5B), tr.532-538 Võ Thị Kiều Thanh, Nguyễn Duy Tân, Vũ Thị Lan Anh, Phùng Huy Huấn 2012 “Ứng dụng tảo Chlorella sp Daphnia sp lọc chất thải hữu xử lý nƣớc thải từ q trình chăn ni lợn sau xử lý UASB”, Tạp chí sinh học,34 46