Thiết lập phản ứng multiplex pcr nhằm xác định một số mầm bệnh ký sinh trùng đường máu trên bò

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG MULTIPLEX PCR NHẰM XÁC ĐỊNH MỘT SỐ MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU TRÊN BÕ HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG MULTIPLEX PCR NHẰM XÁC ĐỊNH MỘT SỐ MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU TRÊN BÕ Sinh viên thực : TẠ PHƢƠNG ANH Mã sinh viên : 637013 Lớp : K63CNSHA Giảng viên hƣớng dẫn : TS Dƣơng Đức Hiếu PGS TS Đồng Huy Giới HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn cơng trình nghiên cứu thực tơi, đƣợc thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Đồng Huy Giới TS Dƣơng Đức Hiếu Các số liệu đƣợc sử dụng, hình ảnh, kết nghiên cứu khóa luận hồn tồn trung thực, chƣa đƣợc sử dụng công bố cơng trình nghiên cứu khoa học trƣớc Khóa luận tốt nghiệp có tham khảo tài liệu, thơng tin trích dẫn đƣợc rõ phần tài liệu tham khảo Mọi giúp đỡ đƣợc cảm ơn Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Tạ Phƣơng Anh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đồng Huy Giới, Trƣởng môn Sinh học – khoa Công nghệ Sinh học TS Dƣơng Đức Hiếu – Giảng viên môn Ký sinh trùng - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam hƣớng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Tơi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn cán phòng nghiên cứu - Nghiên Cứu Bảo Tồn Đa Dạng Sinh Học Và Bệnh Nhiệt Đới (BIOD) tận tình hƣớng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực khóa luận Tơi muốn gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Ban lãnh đạo tập thể Viện BIOD Bệnh viện Thú y Gaia, đơn vị hỗ trợ cho thực khóa luận Tiếp theo, tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam ln tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi suốt bốn năm đại học Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, ngƣời thân gia đình tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên đồng hành năm tháng giảng đƣờng đại học Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Tạ Phƣơng Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ V DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VII TÓM TẮT KHÓA LUẬN VIII PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài PHẦN TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Một số bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò 2.1.1 Bệnh Trypanosoma evansi 2.1.2 Bệnh Anaplasma spp 2.1.3 Bệnh Theileria spp 10 2.2 Các phƣơng pháp chẩn đoán 12 2.2.1 Nhuộm tiêu máu 12 2.2.2 Tổng quan phƣơng pháp PCR 12 2.2.3 Kỹ thuật PCR phức (Multiplex PCR) 16 2.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 16 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 21 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 21 3.2.1 Hóa chất 21 iii 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4.1 Tách chiết DNA 22 3.4.4 Xây dựng tối ƣu phản ứng Multiplex PCR 23 3.4.5 Phƣơng pháp điện di DNA 25 3.4.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 25 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết q trình thiết lập tối ƣu hóa phản ứng m-PCR 26 4.1.1 Kết xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu cho mầm bệnh đơn lẻ 26 4.1.2 Kết xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu cho phản ứng m-PCR 27 4.1.3 Kết xác định nồng độ mồi tối ƣu cho phản ứng m-PCR 29 4.1.4 Kết xác định độ nhạy phản ứng m-PCR 30 4.1.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng m-PCR 31 4.2 Đánh giá kết phát mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò sử dụng phƣơng pháp s-PCR m-PCR 32 4.2.1 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR 32 4.2.2 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp m-PCR 33 4.2.3 Đánh giá thực trạng nhiễm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trại bò Phù Đổng 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iv DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 3.1 Thành phần phản ứng m-PCR 23 Bảng 3.2 Danh sách cặp mồi cho phản ứng PCR nghiên cứu 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng s-PCR 24 Bảng 3.4 Nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi phản ứng s-PCR so với quy trình tham khảo 24 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng s-PCR 24 Bảng 4.1 Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi phản ứng s-PCR 26 Bảng 4.2 Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi phản ứng m-PCR 29 Bảng 4.3 Pha loãng hàm lƣợng DNA 30 Bảng 4.4 Kết s-PCR mẫu máu bò cho mầm bệnh ký sinh trùng 33 Bảng 4.4 Sự đồng kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp mPCR với s-PCR 34 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 36 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tiêu máu nhiễm Trypanosoma evansi Hình 2.2 Vịng đời Trypanosoma evansi Hình 2.3 Tiêu máu nhiễm Anaplasma marginale (hình a) Anaplasma centrale (hình b) Hình 2.4 Vịng đời phát triển Anaplasma marginale Hình 2.5 Tiêu máu nhiễm Theileria spp 10 Hình 4.1 Hình ảnh điện di cho phản ứng s-PCR 26 Hình 4.2 Kết thí nghiệm điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi 28 Hình 4.3 Kết thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi 29 Hình 4.4 Kết độ nhạy phản ứng m-PCR 31 Hình 4.5 Hình ảnh kết điện di m-PCR với mầm bệnh 31 Hình 4.6 Sản phẩm s-PCR cho mầm bệnh 33 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa Chữ viết tắt DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction s-PCR PCR đơn lẻ m-PCR Multiplex PCR µl Microlit µm Micromet ng Nanogram pM Picomole T evansi Trypanosoma evansi vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN Tên tác giả: Tạ Phƣơng Anh Mã sinh viên: 637013 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Tên khố luận: “Thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm xác định số bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bị” Mục đích nghiên cứu: Xây dựng đƣợc phản ứng multiplex PCR nhằm phát bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò thời gian ngắn, góp phần đƣa phƣơng hƣớng điều trị ngăn ngừa truyền lây mầm bệnh gia súc Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thiết lập phản ứng multiplex PCR phát đồng thời mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu Nội dung 2: Đánh giá thực trạng nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu mẫu thực địa trại bò Phù Đổng phƣơng pháp multiplex PCR Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp PCR đơn lẻ Phƣơng pháp multiplex PCR Kết nghiên cứu Tiến hành tối ƣu hóa phản ứng m-PCR, xác định đƣợc nhiệt độ gắn mồi thích hợp 54oC, nồng độ mồi cho phản ứng 10 pmol thí nghiệm chứng minh độ nhạy phản ứng Kết kiểm tra sàng lọc mẫu thực địa phƣơng pháp PCR đơn lẻ thu đƣợc 14 mẫu dƣơng tính với Theileria spp., mẫu dƣơng tính với Anaplasma spp mẫu dƣơng tính với Trypanosoma evansi mẫu đồng nhiễm Theileria spp Anaplasma spp So sánh kết sàng lọc mẫu thực địa phƣơng pháp m-PCR cho kết đồng với kết sàng lọc phƣơng pháp PCR đơn lẻ Kết luận: Thiết lập thành công phản ứng multiplex PCR phát đồng thời ba mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi viii Dựa theo kết điện di hiển thị hình 4.3, quan sát đƣợc phản ứng multiplex PCR cho ba mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi có độ nhạy cao, thị quan sát rõ kết với nồng độ mồi 1pmol Chúng tiến hành thử nghiệm nồng độ 10; 5; 2.5 pmol kết cho thấy tất nồng độ thị rõ band ba mầm bệnh Trong nồng độ mồi 10pmol thị band chun biệt nhìn rõ đồng thời khơng xuất vạch band không đặc hiệu, kết thị hình 4.3 Vì vậy, chúng tơi lựa chọn nồng độ mồi thích hợp cho phản ứng multiplex PCR để phát đồng thời ba mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi 10pmol 4.1.4 Kết xác định độ nhạy phản ứng m-PCR Để xác định độ nhạy phản ứng multiplex PCR, pha lỗng DNA khn với nồng dộ khác tiến hành phản ứng m-PCR với nồng độ DNA pha lỗng khác Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng DNA khuôn hỗn hợp DNA (tỉ lệ 1:1:1) đƣợc pha trộn từ ba mẫu đối chứng dƣơng tƣơng ứng với ba mầm bệnh cần phân tích Để có sở pha lỗng hàm lƣợng DNA, chúng tơi tiến hành đo nồng độ DNA, pha loãng DNA thu đƣợc kết nhƣ Bảng 4.3 Bảng 4.3 Pha loãng hàm lƣợng DNA Mầm bệnh ký sinh Hàm lƣợng DNA trƣớc pha lỗng (ng/µl) Hàm lƣợng DNA sau pha lỗng (ng/µl) Anaplasma spp Theileria spp Trypanosoma evansi 219 21,9 203 20,3 235 23,5 Anaplasma spp Theileria spp Trypanosoma evansi 219 2,19 203 2,03 235 2,35 Anaplasma spp Theileria spp 219 0,22 203 0,2 Trypanosoma evansi 235 0,24 Tỷ lệ pha loãn x 10-1 x 10-2 x 10-3 Tiến hành thực m-PCR với DNA đƣợc pha loãng nồng độ khác nhau, kết thu đƣợc nhƣ hình 4.4 30 Hình 4.4 Kết độ nhạy phản ứng m-PCR Chú thích: PC-hỗn hợp DNA; BL-đối chứng âm; 1-pha loãng 1/10; 2-pha loãng 1/100; 3- pha loãng 1/1000 Kết phản ứng m-PCR với nồng độ DNA đƣợc pha loãng từ 10-1000 lần cho thấy, m-PCR phát đƣợc ba mầm bệnh tất nồng độ DNA đƣợc pha loãng Cụ thể, nghiên cứu với hàm lƣợng DNA thấp cho mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi xấp xỉ 0,2 ng/µl phản ứng m-PCR phát đƣợc mầm bệnh 4.1.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng m-PCR Kết xác định độ đặc hiệu cảu phản ứng m-PCR đƣợc thể hình 4.5 Hình 4.5 Hình ảnh kết điện di m-PCR với mầm bệnh 31 Chú thích: 1- Đối chứng dương 2- Đối chứng âm 3- Mẫu đồng nhiễm với Anaplasma spp Theileria spp 4- Mẫu đồng nhiễm với Theileria spp Trypanosoma evansi 5- Mẫu đồng nhiễm với Anaplasma spp Trypanosoma evansi 6- Mẫu dương tính với Theileria spp 7- Mẫu dương tính với Anaplasma spp 8- Mẫu dương tính với Trypanosoma evansi 9- Mẫu dương tính với bệnh Lê dạng trùng 10- Mẫu dương tính với bệnh Rickettsia 11- Mẫu dương tính với bệnh Haemoplasma Kết điện di cho thấy, phản ứng m-PCR phát band đặc hiệu cho mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi tƣơng ứng với band vị trí 1095; 345 205 bp khơng có nhiễm chéo đƣợc phát phản ứng m-PCR chúng tơi xây dựng Ngồi ra, kết cho thấy, phản ứng phát đƣợc mẫu nhiễm mầm bệnh nhiễm đồng thời hay mầm bệnh mà nghiên cứu quan tâm Chúng sử dụng mẫu DNA số mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu khác phổ biến động vật nhƣ Lê dạng trùng, Rickettsia Haemoplasma để kiểm tra khả nhiễm chéo phản ứng m-PCR Kết hiển thị hình 4.5 Cho thấy khơng có bắt cặp nhầm diễn phản ứng m-PCR đƣợc nghiên cứu xây dựng tối ƣu hóa (lane 9, 10, 11) 4.2 Đánh giá kết phát mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò sử dụng phƣơng pháp s-PCR m-PCR 4.2.1 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR Để nắm đƣợc tình hình nhiễm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu đàn bị, chúng tơi tiến hành khảo sát 54 mẫu máu bò thu thập ngẫu nhiên từ trại bò Phù Đổng Mẫu máu thu từ thực địa đƣợc tách chiết tiến hành sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR (kết hiển thị hình 4.6), kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR đƣợc thể bảng 4.4 32 Bảng 4.4 Kết s-PCR mẫu máu bò cho mầm bệnh ký sinh trùng Mầm bệnh Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ % Theileria spp 54 14 25,9% Anaplasma spp 54 1,84% Trypanosoma evansi 54 3,7% Đồng nhiễm Theileria spp 54 3,7% 19 35,2% Anaplasma spp Tổng mẫu dƣơng tính Theo Bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ bò nhiễm mầm bệnh Theileria spp chiếm tỷ lệ cao ba mầm bệnh theo sau Trypasoma evansi Anaplasma spp tƣơng ứng 25.9%, 3.7%, 1,84% Kết tiến hành phản ứng s-PCR, phát cá thể bò đồng nhiễm với hai mầm bệnh Anaplasma Theileria chiếm tỷ lệ 3,7% tổng số mẫu kiểm tra Kết đƣợc hiển thị gel agarose nhƣ hình 4.6 Hình 4.6 Sản phẩm s-PCR cho mầm bệnh 4.2.2 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp m-PCR 54 mẫu máu bò thu thập ngẫu nhiên từ trại bò Phù Đổng đƣợc sử dụng để sàng lọc mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi phƣơng pháp s-PCR phía trên, đƣợc tiếp tục sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng m-PCR để đánh giá đồng kết hai phƣơng pháp Sự đồng kết sPCR m-PCR đƣợc thể bảng 4.4 33 Bảng 4.4 Sự đồng kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp m-PCR với s-PCR Số mẫu kiểm tra PCR đơn lẻ Multiplex PCR Theileria spp 54 14 (25,9%) 14 (25,9%) Anaplasma spp 54 (1.84%) (1.84%) Trypanosoma evansi 54 (3,7%) (3,7%) Đồng nhiễm 54 (3,7%) (3,7%) 19 (35,2%) 19 (35,2%) Mầm bệnh Anaplasma spp Theileria spp Tổng mẫu dƣơng tính Kết sàng lọc mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò thực hai phƣơng pháp PCR có đồng tỷ lệ âm tính, tỷ lệ dƣơng tính với mầm bệnh có đồng kết sàng lọc cho cá thể đơn lẻ Những ƣu điểm vƣợt trội phản ứng m-PCR so với s-PCR nghiên cứu là: Để tiến hành sàng lọc cho 54 mẫu bệnh phẩm phƣơng pháp PCR đơn lẻ để phát ba mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi cần thực 168 phản ứng PCR Thực phản ứng PCR đơn lẻ để sàng lọc mầm bệnh tốn hóa chất, vật tƣ, nhân cơng thời gian tiến hành Vì vậy, phản ứng m-PCR tối ƣu đƣợc nhƣợc điểm phản ứng PCR đơn lẻ Khi ứng dụng phản ứng m-PCR, thấy hiệu tiết kiệm đƣợc 40% lƣợng hóa chất PCR cần sử dụng thời gian sàng lọc mầm bệnh rút ngắn 1/3 so với thời gian cần để thực xét nghiệm phản ứng PCR đơn lẻ Với ƣu điểm mặt thời gian tiết kiệm hóa chất đồng thời phản ứng m-PCR có độ nhạy độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với phản ứng PCR đơn lẻ Vì vậy, áp dụng phản ứng m-PCR để thay cho việc sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp PCR đơn lẻ Trong số phƣơng pháp đƣợc phát triển để chẩn đoán nhanh xác hơn, PCR đƣợc coi phƣơng pháp hàng đầu, có độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, kỹ thuật PCR phức tạp tốn thời gian (Tanyuksel Petri, 2003; Fotedar, 2007b,) Zulhainan Hamzah cộng sự, năm 2006 phát triển kỹ thuật m-PCR để chẩn đoán bệnh amip gây loài khác (E histolytica, E dispar E moshkovskii) một phản ứng (Zulhainan cộng sự, 2006; 2011) 34 Nghiên cứu tối ƣu phản ng m-PCR ca Bilgiỗ HB v cng s, 2013 cú thể phát mầm bệnh T annulata, B bovis A marginale từ mẫu DNA đơn nhiễm hay hỗn hợp DNA mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bị Khơng có khác biệt giới hạn phát kỹ thuật m-PCR sử dụng DNA mầm bệnh ký sinh trùng hay hỗn hợp DNA ba loài Hơn nữa, s-PCR m-PCR phát DNA loài với độ nhạy tƣơng đƣơng hỗn hợp DNA đƣợc pha loãng DNA T annulata, B bovis A marginale Navpreet cộng sự, 2013 nghiên cứu phát triển phản ứng m-PCR để phát đồng thời ba mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu chó (B vogeli, E canis H canis) dƣờng nhƣ khơng có báo cáo đƣợc cơng bố việc phát đồng thời mầm bệnh ký sinh trùng Hơn nữa, trƣớc xác nhận xét nghiệm m-PCR điều kiện thực địa, kết xét nghiệm đƣợc so sánh với xét nghiệm s-PCR mối liên quan yếu tố nguy khác nhƣ tuổi, giống, giới tính vật chủ, mùa huyện đƣợc làm sáng tỏ Nghiên cứu xét nghiệm m-PCR phù hợp để xử lý số lƣợng lớn mẫu máu thời gian ngắn với mức độ đặc hiệu cao ba mầm bệnh nhân ký sinh trùng đƣờng máu với độ nhạy tốt Ngoài ra, xét nghiệm m-PCR, đƣợc sử dụng để phát lây nhiễm đồng thời sinh vật gây bệnh phổ biến khu vực địa lý cụ thể, công cụ nhanh chóng xác để đánh giá tình trạng dịch tễ học bệnh khu vực (Jain cộng sự, 2018) Về nghiên cứu giới, Kledmanee cộng (2009) thiết kế phản ứng m-PCR để phát đồng thời ba loại ký sinh trùng máu (Babesia spp., E canis H canis) chó Hơn nữa, để khắc phục nhƣợc điểm liên quan đến chi phí thời gian tiến hành xét nghiệm, cần cải thiện nhƣợc điểm phản ứng s-PCR cách thực xét nghiệm m-PCR Nghiên cứu đánh giá xét nghiệm m-PCR để phát ba ký sinh trùng ve quan trọng lây nhiễm cho chó Xét nghiệm s-PCR để phát mầm bệnh Ehrlichia spp., Hepatozoon spp., Trypanosoma evansi Babesia spp đƣợc tiến hành nhiều nhà nghiên cứu toàn giới (Omanwar cộng sự, 1999; Chansiri cộng sự, 2002; Sacchini cộng sự, 2007; Adaszek Winiarczyk, 2008; Tamarit cộng sự, 2010; Shahid cộng sự, 2013) bao gồm Ấn 35 Độ (Parmar cộng sự, 2013; Milanjeet cộng sự, 2014; Singh cộng sự, 2014; Singla cộng sự, 2016; Singh cộng sự, 2017a; Singh cộng sự, 2019) Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu có xét nghiệm m-PCR nhằm phát ký sinh trùng máu truyền lây qua ve đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng cách sử dụng mẫu máu thu đƣợc từ thực địa (Azhahianambi cộng sự., 2018; Jain cộng sự., 2018) 4.2.3 Đánh giá thực trạng nhiễm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trại bò Phù Đổng Căn theo kết sàng lọc ba mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi hai phƣơng pháp s-PCR m-PCR cho thấy, thực trạng nhiễm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 54 mẫu thực địa thu trại bò Phù Đổng đƣợc đánh giá qua biểu đồ 4.1 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trại bò Phù Đổng (n=54) Tỷ lệ ca bệnh dƣơng tính với bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trại bò Phù Đổng 19/54 mẫu (35.2%) Trong đó, tỷ lệ bị đơn nhiễm mầm bệnh Theileria spp chiếm tỷ lệ cao (25.9%), theo sau Trypasoma evansi Anaplasma spp tƣơng ứng 3.7%, 1,84% Đặc biệt, nghiên cứu phát cá thể bò đồng nhiễm với hai mầm bệnh Anaplasma spp Theileria spp chiếm tỷ lệ 3,7% tổng số mẫu kiểm tra Tại Việt Nam có nhiều báo cáo tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng 36 đƣờng máu bò đƣợc ghi nhận Một số khảo sát tình hình nhiễm Theileria orientalis đƣợc thực Thừa Thiên Huế Hà Nội (theo Khukhuu cộng sự, 2011 Sivakumar cộng sự, 2013) ghi nhận tỷ lệ nhiễm mầm bệnh Theileria orientalis chiếm 13,8% 0,9% Đến năm 2017, nghiên cứu Gebrekidan cộng ghi nhận bùng phát mầm bệnh Theileria spp giống bò sữa nhập từ Úc Việt Nam Báo cáo ghi nhận tỷ lệ nhiễm bệnh Theileria lên đến 72,3% So sánh với kết nghiên cứu chúng tơi, có tƣơng đồng tỷ lệ nhiễm Theileria spp với tỷ lệ nhiễm chiếm 73,7% (14/19) ca dƣơng tính với mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu) Ngoài ra, mầm bệnh khác nhƣ Anaplasma marginate chiếm tỷ lệ nhiễm lên đến 54% điều tra khảo sát T Geurden cộng sự, 2018 tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng gia súc Việt Nam Nghiên cứu Holland cộng sự, 2004 tập trung tiến hành khảo sát mầm bệnh Trypanosoma evansi gia súc tỉnh thành Việt Nam Kết nghiên cứu rằng, kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp PCR thu đƣợc tỷ lệ nhiễm Trypanosoma evansi 5% tổng số mẫu tiến hành kiểm tra Tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò gia tăng theo năm nhƣng mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu cần có phác đồ điều trị khác Chính vậy, hiểu biết sở chăn nuôi mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu đại gia súc cịn thiếu sót dẫn đến chẩn đoán điều trị sai thuốc Vậy nên cần tiến hành thêm nghiên cứu điều tra tình hình nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu phƣơng pháp phát mầm bệnh cách nhanh chóng xác, tránh ảnh hƣởng đến sức khỏe vật nuôi gây thiệt hại kinh tế cho ngƣời chăn nuôi 37 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Thiết lập đƣợc quy trình multiplex PCR để phát ba mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi.với điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ƣu 54oC, nồng độ mồi tối ƣu 10pmol Phản ứng có độ nhạy độ đặc hiệu cao phát mầm bệnh với hàm lƣợng DNA xấp xỉ 0,2 ng/µl khơng xảy bắt cặp chéo phản ứng m-PCR dƣợc xây dựng Sử dụng phản ứng multiplex PCR đƣợc thiết lập để xác định mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 54 mẫu máu bò thu thập từ trại bò Phù Đổng cho thấy: 14 mẫu dƣơng tính với Theileria spp., mẫu dƣơng tính với Anaplasma spp mẫu dƣơng tính với Trypanosoma evansi mẫu đồng nhiễm Theileria spp Anaplasma spp Kết trùng khớp với kết khảo sát mầm bệnh Theileria spp., Anaplasma spp Trypanosoma evansi phƣơng pháp s-PCR 5.2 Kiến nghị Thử nghiệm quy trình multiplex PCR mẫu bệnh loài khác Thiết lập phản ứng multiplex PCR phát đồng thời nhiều mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Sỹ Lăng, Chu Duy Bào (1971) Vai trò truyền bá mầm bệnh Trypanosoma evansi lồi mịng Tabanus rubidus miền Bắc Việt Nam, Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, (5) Trang 367 Phạm Sỹ Lăng (1982), Một số ñặc ñiểm dịch tể học bệnh Tiên mao trùng trâu, bò Trypanosoma evansi tỉnh phía Bắc Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Thú y Phạm Chiên cs., 1999 Kết khảo sát ký sinh trùng máu đàn bò huyện M’DRAC (ĐAKLAK) Khoa học Kỹ thuật Thú y, Tập VI, (1), trang 53 Nguyễn Hữu Hƣng cs, 2014 Khảo sát tình hình nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu bò 02 huyện Tri Tôn Tịnh Biên tỉnh An Giang thử nghiệm điều trị Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề: Nông nghiệp (2014) (2): 79-83 Nguyễn Thanh Tùng, 2006 Khảo Tình hình nhiễm ký sinh trùng đường máu đàn bò sữa thành phố Hồ Chí Minh hiệu điều trị số loại thuốc Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Trƣờng Đại học Nông lâm Tp.H CM Nguyễn Văn Phát Nguyễn Văn Thành, 2004 Nghiên cứu quy trình phịng ngừa trị số bệnh bị sữa để góp phần tăng nguồn sữa cho nhà máy sữa khu vực thành phố Hồ Chí Minh Sở Khoa học Công nghệ Môi trƣờng TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Hậu cs., 1999 Bƣớc đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đốn bệnh huyết bào tử trùng bị Khoa học Kỹ thuật Thú y, Tập VI, (1), trang 48 Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Văn Thọ, Đàm Văn Phải, Phạm Thị Lan Hƣơng Nguyễn Văn Minh, 2013 Đặc điểm sinh học Trypanosoma evansi số đặc điểm bệnh lý ký sinh trùng gây đàn trâu số tỉnh miền núi phía Bắc Khoa học Kỹ thuật Thú y, Tập XX, (1), trang 43 Phạm Sỹ Lăng Phan Địch Lân, 2000 Bệnh trâu bò Việt Nam biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 39 10 Phạm Sỹ Lăng, 2002 Ba bệnh huyết bào tử trùng (Haemosporidiosis) chủ yếu gây hại cho bò sữa Việt Nam kỹ thuật chẩn đốn, phịng trị Nhà xuất Hà Nội 11 Phạm Sỹ Lăng, 2000 Tình hình bệnh huyết bào tử trùng bò sữa nƣớc ta ứng dụng tiến kỹ thuật chẩn đoán phòng trị bệnh Khoa học Kỹ thuật Thú y, Tập VII, (1), trang 74 - 80 12 Phạm Sỹ Lăng, 2002 Ba bệnh huyết bào tử trùng (Haemosporidiosis) chủ yếu gây hại cho bò sữa Việt Nam kỹ thuật chẩn đốn, phịng trị Nhà xuất Hà Nội 13 Tào Anh Tuấn, 2004 Khảo sát bệnh ký sinh trùng đường máu trâu, bị huyện Ninh Hồ bước đầu thử nghiệm số thuốc điều trị bệnh Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Trƣờng Đại học Nông lâm Tp HCM 14 Đào Trọng Đạt Phạm Sỹ Lăng, 1993 Đưa tiến kỹ thuật phòng chống bệnh tiên mao trùng trâu bò Việt Nam Cơng trình nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, trang 106 - 109 15 Khanh Linh Bui, Duc Hieu Duong, Dao Tran Anh Bui, Viet-Linh Nguyen, Thom Do, Thi Lan Anh Le, Khanh Trang Tran A case of Trypanosoma evansi in a German Shepherd dog in Vietnam, Parasitology International, Volume 80, 2021, 102198, ISSN 1383-5769, https://doi.org/10.1016/j.parint.2020.102198 16 Claes F, Radwanska M, Urakawa T, Majiwa PA, Goddeeris B, Büscher P Variable Surface Glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection of Trypanosoma evansi infections Kinetoplastid Biol Dis 2004 Sep 17;3(1):3 doi: 10.1186/1475-9292-3-3 PMID: 15377385 17 Raisinghami, P M, Lodha, K R (1989) Incidence of Trypanosoma evansi infection in camels of Rajasthan Indian J Animal Science 59 (1), 1390-1392, Seances Soe Biol Ses Fil (64), pp 38-40 18 Garcia, F., Aso, P M (1992) Association between Trypanosoma evansi and equine infectious anemia in horses of apure state, Venezuela Seminar France, (10), pp 64 19 Chen Qijun (1992) Trypanosoma evansi in China, Seminar Paris, (10), pp 200 20 Joshi, Prashant P., et al “Human trypanosomiasis caused by Trypanosoma evansi in India: the first case report.” The American journal of tropical 40 medicine and hygiene 73.3 (2005): 491-495 21 Daniel S B., 2001 Sensitivity and specificity of the complement fixation test for detection of cattle persistently infected with Anaplasma marginale 22 Garcia F.A., Aso P.M., 1992 Association between Trypanosoma evansi and equine infectious anemia in horses of aprute state Venezuela Seminar France, pp 10-64 23 Grazia Carelli, Nicola D., Alessio L., Buonavoglia C., 2014 Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale Veterinary Microbiology 124 (2007) 107–114 24 Inokuma H, Terada Y, Kamio T, Raoult D, Brouqui P Analysis of the 16S rRNA gene sequence of Anaplasma centrale and its phylogenetic relatedness to other ehrlichiae Clin Diagn Lab Immunol 2001 Mar;8(2):241-4 doi: 10.1128/CDLI.8.2.241-244.2001 PMID: 11238202; PMCID: PMC96043 25 Allsopp, B., Baylis, H., Allsoppi, M., Cavalier-Smith, T., Bishop, R., Carrington, D., Spooner, P (1993) Discrimination between six species of Theileria using oligonucleotide probes which detect small subunit ribosomal RNA sequences Parasitology, 107(2), 157-165 doi:10.1017/S0031182000067263 26 DEVI, A., SHANKER, D., SUDAN, V., JAISWAL, A., & SINGH, A (2017) Molecular characterization and phylogenetic sequence analysis of unique conserved portion of VSG of Trypanosoma evansi The Indian Journal of Animal Sciences, 87(8) Retrieved from https://epubs.icar.org.in/index.php/IJAnS/article/view/73582 27 Guido F C L., Angela P S., Lloyd H L., Laudio R M., 2002 Assessment of primer designed from the small ribosomal subunit RNA for specific discrimination between Babesia bigemina and Babesia bovis by PCR Ciência Animal Brasileira v 3, n 2, p 27-32, jul./ dez 2002 28 Maged El-Ashker., Helmut H., Mayada G., Mohamed E., Cornelia S., Herbert T., 2014 Molecular biological identification of Babesia, Theileria, and 41 Anaplasma species in cattle in Egypt using PCR assays, gene sequence analysis and a novel DNA microarray Veterinary Parasitology 207 (2015) 329-3 29 Marc Desquesnes, Philippe Holzmuller, De-Hua Lai, Alan Dargantes, Zhao-Rong Lun and Sathaporn Jittaplapong, 2013 Trypanosoma evansi and Surra: A Review and Perspectives on Origin, History, Distribution, Taxonomy, Morphology 30 MDachi R.E., Murilla G.A., Omukuba J.N., Cagnolati V., 1995 Disposition of diminazene aceturate (Berenil®) in trypanosome-infected pregnant and lactating cows Veterinaey Parasitology 58 (1995) 215 – 225 31 Nantiya Saetiew, Patcharathorn Simking, Tawin Inpankaew, Kannika Wongpanit, Ketsarin Kamyingkird, Sirichai Wongnakphet, Roger W Stich, and Sathaporn Jittapalapong, 1990 Serological Survey of Trypanosomiasis and Babesiosis in cattle and buffalo in Thailand J Trop Med Parasitol 2015;38: 9-16 32 OIE Terrestrial Manual 2015 - Chapter 2.4.1, 2.4.2 33 Ola Abd-El Hussain Agaar, Ghyda'a Abbas Jassem, 2014 Some molecular and sero-prevalence study of Anaplasma marginale in cattle in Wassit province AL-Qadisiya Journal of Vet Med Sci Vol 14 No.1 (2015) 34 Onah D.N., Hopkin M., Lukins A.G., 1997 Effects of Trypanosoma evansi on the output of cell from a lympho node draining the site of Pasteurella haemolytica vaccine administration J.com path, pp 74-110 35 Peregrine A.S and Mamman M., 1993 Pharmacology of diminazene: a review Acta tropica, 54 (1993)185-203 36 Sherri B T., Susan B C., Wendy C A., Christine M K., Keith E M., Jerfrey 37 Shiby K and Jude E U., 2014 Diminazene aceturate (Berenil), a new use for an old compound International Immunopharmacology 21 (2014) 342 – 345 38 Waren N Baticados, Cherry P Fernandez, and Abigail M Baticados, 2011 Molecular detection of Trypanosoma evansi in cattle from Quirino Province, Philippines Veterinarski Arhiv 81 (5), 635-646, 2011 39 Zafar Iqbal Chaudhry, M Suleman, M Younus and A Aslim, 2010 Molecular Detection of Babesia bigemina and Babesia bovis in Crossbred Carrier Cattle Through PCR Pakistan J Zool., vol 42(2), pp 201-204, 2010 42 40 H., 2006 Confirmation of diminazene diaceturate in bovine plasma using electrospray liquid chromatography–mass spectrometry Journal of Chromatography B, 844 (2006) 127 – 133 41 Azhahianambi P, G J, GR B, M A, R RN, Latha BR, M R, Evaluation of multiplex PCR assay for detection of Babesia spp, Ehrlichia canis and Trypanosoma evansi in dogs, Acta Tropica (2018), https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2018.08.028 42 Cardoso, G.V.F.; Oliveira, A.C.S.; Silva, A.S.; Silva, M.C.L.; Lima, J.S.; Roos, T.B.; Moraes, C.M 2021 Protocol optimization for the detection of Trypanosoma cruzi DNA in aỗai (Euterpe oleraceae) pulp Acta Amazonica 51: 79-84 43 Maged El-Ashker., Helmut H., Mayada G., Mohamed E., Cornelia S., Herbert T., 2014 Molecular biological identification of Babesia, Theileria, and Anaplasma species in cattle in Egypt using PCR assays, gene sequence analysis and a novel DNA microarray Veterinary Parasitology 207 (2015) 329-3 44 Wei, Hu., Sheng, Wu., Xingang, Yu., Abullahi, A.Y., Song, M., Tan, L., Wang, Z., Jiang, B., Li, G., 2015 A multiplex PCR for simultaneous detection of three zoonotic parasites Ancylostoma ceylanicum, A caninum, and Giardia lamblia Assemblage A Biomed Res Int http://dx.doi.org/10.1155/2015/406168 45 Quemelo, P.R.V., Lopes da Fonseca, B.A., Lima, D.M., Peres, L.C., 2009 Influence of amplicon size on the polymerase chain reaction of Parvovirus B19 genome in formalin-fixed specimens J Bras Patol Med Lab 45 (2) http://dx.doi.org/10.1590/S1676- 24442009000200006 46 Marc Desquesnes, Philippe Holzmuller, De-Hua Lai, Alan Dargantes, Zhao-Rong Lun and Sathaporn Jittaplapong, 2013 Trypanosoma evansi and Surra: A Review and Perspectives on Origin, History, Distribution, Taxonomy, Morphology 47 Ullah R, Shams S, Khan MA, Ayaz S, Akbar NU, Din QU, Khan A, Leon R, Zeb J Epidemiology and molecular characterization of Theileria annulata in cattle from central Khyber Pakhtunkhwa, Pakistan PLoS One 2021 Sep 16;16(9): e0249417 doi: 10.1371/journal.pone.0249417 PMID: 34529664; PMCID: PMC8445462 43 48 Valkiunas G, Iezhova TA, Krizanauskiene A, Palinauskas V, Sehgal RN, Bensch S A comparative analysis of microscopy and PCR-based detection methods for blood parasites J Parasitol 2008;94(6):1395-1401 doi: 10.1645/GE-1570.1Gebrekidan H, Nelson L, Smith G, Gasser RB, Jabbar A An outbreak of oriental theileriosis in dairy cattle imported to Vietnam from Australia Parasitology 2017;144(6):738-746 doi:10.1017/S0031182016002328 49 Noaman V, Shayan P Comparison of Microscopy and PCR-RFLP for detection of Anaplasma marginale in carrier cattle Iran J Microbiol 2010 Jun;2(2):89-94 PMID: 22347555; PMCID: PMC3279773 50 Alemu, A., Fuehrer, HP., Getnet, G et al Comparison of Giemsa microscopy with nested PCR for the diagnosis of malaria in North Gondar, north-west Ethiopia Malar J 13, 174 (2014) https://doi.org/10.1186/1475-2875-13-174 51 Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro [published correction appears in Nucleic Acids Res 1991 Feb 11;19(3):698] Nucleic Acids Res 1990;18(21):6409-6412 doi:10.1093/nar/18.21.6409 52 Bilgiỗ HB, Karagenỗ T, Simuunza M, Shiels B, Tait A, Eren H, Weir W Development of a multiplex PCR assay for simultaneous detection of Theileria annulata, Babesia bovis and Anaplasma marginale in cattle Exp Parasitol 2013 Feb;133(2):222-9 doi: 10.1016/j.exppara.2012.11.005 Epub 2012 Nov 24 PMID: 23183165; PMCID: PMC3650576 44