Nghiên cứu các giải pháp kiểm soát tạp nhiễm trong quá trình nuôi tảo xoắn arthrospira platensis

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -🕮 - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CÁC GIẢI PHÁP KIỂM SỐT TẠP NHIỄM TRONG Q TRÌNH NI TẢO XOẮN ARTHROSPIRA PLATENSIS Sinh viên thực : NGUYỄN XUÂN VIỆT Lớp : K63-CNSHD Mã sinh viên : 637375 Giảng viên hƣớng dẫn : PGS TS NGUYỄN ĐỨC BÁCH Bộ môn : SHPT & CNSH Ứng dụng Khoa : Công nghệ Sinh học HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết đƣợc trình bày khố luận hồn tồn trung thực Kết đƣợc thu thập dựa vào trình nghiên cứu khoa học trực tiếp dƣới hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Đức Bách khoa Công nghệ Sinh học - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Xuân Việt i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tất thầy, cô giảng dạy, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập, rèn luyện, nghiên cứu Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS TS Nguyễn Đức Bách tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, quan tâm tạo điều kiện suốt trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Viện nghiên cứu Vi tảo Dƣợc mỹ phẩm - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến bổ ích tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, với tất lịng thành kính biết ơn vô hạn, xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi nấng, động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Xuân Việt ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT ĐỀ TÀI viii PHẦN I PHẦN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, ý nghĩa yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Ý nghĩa PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tảo xoắn Arthrospira platensis (Spirulina) 2.1.1 Tảo xoắn tình hình ni trồng giới 2.1.2 Tiềm tình hình ni trồng tảo xoắn Việt Nam 2.2 Tạp nhiễm q trình ni tảo 2.3 Các nguyên nhân dẫn đến tƣợng tạp nhiễm 10 2.3.1Các yếu tố môi trƣờng dẫn đến nhiễm sinh vật ăn tảo 10 2.3.2.Ảnh hƣởng điều kiện nuôi trồng vệ sinh 11 2.3.3.Ảnh hƣởng nguồn giống 12 2.4 Một số loại tạp nhiễm điển hình khu vực ni tảo 12 2.5 Ảnh hƣởng tác động tạp nhiễm 14 2.5.1 Ảnh hƣởng động vật nguyên sinh 14 2.5.2 Ảnh hƣởng vi khuẩn 16 2.5.3 Ảnh hƣởng nấm 17 2.5.4 Ảnh hƣởng tảo tạp 17 iii 2.6 Các phƣơng pháp xác định tạp nhiễm 17 2.6.1 Phƣơng pháp soi nhuộm dƣới kính hiển vi 17 2.6.2 Phát tạp nhiễm kỹ thuật Flow cytometry 18 2.6.3 Phƣơng pháp phát công cụ phân tử 18 2.7 Các giải pháp kiểm soát tạp nhiễm 19 2.7.1 Kiểm soát độ pH 19 2.7.2 Sử dụng ánh sáng UV để kiểm soát tạp nhiễm 20 2.7.3 Xử lý tạp nhiễm giai đoạn nhân giống 20 PHẦN III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4 Phƣơng pháp thí nghiệm 22 3.4.1 Phƣơng pháp quan sát mắt thƣờng 22 3.4.2 Phƣơng pháp quan sát kính hiển vi để xác định tạp nhiễm 23 3.4.3 Phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn vi nấm môi trƣờng nuôi 23 3.4.4 Sử dụng đèn UV để xử lý môi trƣờng trƣớc nuôi 24 3.4.5 Sử dụng đèn LED xanh để kiểm soát tạp nhiễm 24 3.4.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng NH4HCO3 đến khả tạp nhiễm 25 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Các loại tạp nhiễm phát trình nuôi bể raceway 26 4.2 Xác định mật độ vi khuẩn nấm môi trƣờng nuôi 29 4.2.1 Mật độ vi khuẩn môi trƣờng nuôi 29 4.2.2 Mật độ nấm môi trƣờng nuôi 31 4.3 Ảnh hƣởng đèn UV xử lý môi trƣờng dinh dƣỡng sau tái sử dụng 31 4.3.1 Ảnh hƣởng đèn UV đến mật độ vi khuẩn 31 4.3.2 Ảnh hƣởng đèn UV đến mật độ vi nấm 33 iv 4.4 Ảnh hƣởng đèn LED xanh q trình ni 33 4.5 Các giải pháp quản lý theo dõi bể ni, xử lý phịng ngừa tạp nhiễm 34 PHẤN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 Tài liệu tiếng Việt 37 Tài liệu tiếng Anh 38 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Môi trƣờng LB 23 Bảng 3.2 Môi trƣờng thạch khoai tây PDA 24 Bảng 4.1 Tổng hợp loại nhiễm tạp bể nuôi tảo xoắn Spirulina 26 Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn xuất sau 48 hệ thống nuôi khác 29 Bảng 4.3 Mật độ nấm sau ngày hệ thống nuôi khác 31 Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn môi trƣờng nuôi tái sử dụng lần thứ 32 Bảng 4.5 Mật độ vi nấm môi trƣờng nuôi tái sử dụng lần thứ 33 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Một số hình ảnh microzooplankton thuộc nhóm grazer trích từ (John G.Day et al., 2018) 13 Hình 2.2 Một số mẫu tảo Spirulina bị nhiễm tạp hệ thống bể ni- raceway 14 Hình 2.3 Tạp nhiễm nguyên sinh động vật làm tảo chết 16 Hình 3.1 Đĩa Sacchi sử dụng để đo mật độ tảo 23 Hình 3.2 Đèn UV 24 Hình 4.1 Sự xuất tảo Chlorella sp tảo Nitzchia sp bể nuôi tảo Spirulina .27 Hình 4.2 Một số mẫu tảo xoắn bị nhiễm tạp 28 Hình 4.3 Một số hình ảnh tảo bị tạp nhiễm 28 Hình 4.4 Tảo ni bể bạt HDPE nhà lƣới đƣợc đảo trộn sục khí .30 Hình 4.5 Tảo ni bể raceway nhà lƣới đƣợc đảo trộn guồng khuấy 30 Hình 4.6 Xử lý mơi trƣờng ni tái sử dụng tia UV bể raceway .32 Hình 4.7 Ảnh hƣởng đèn LED tới mức độ tạp nhiễm 34 vii TÓM TẮT ĐỀ TÀI Arthrospira platensis (Spirulina platensis) loại vi tảo có dạng xoắn màu xanh lam Tảo sống phát triển mạnh môi trƣờng giàu bicarbonat độ kiềm cao ( độ pH từ 8,5 – 11) Hiện tảo xoắn Arthrospira platensis đƣợc nhân giống nuôi trồng nhiều nơi giới có Việt Nam Tuy nhiên q trình ni, đặc biệt mơ hình ni thƣơng mại ngồi trời có nhiều loại tạp nhiễm xâm nhập vào làm ảnh hƣởng đến sinh khối chất lƣợng tảo Đề tài nghiên cứu số biện pháp kiểm soát tạp nhiễm q trình ni tảo xoắn Arthrospira platensis dƣới thực nghiệm khảo sát ảnh hƣởng, có mặt loại tạp nhiễm, xác định phân loại loại tạp nhiễm, tìm hiểu ảnh hƣởng chúng đến tảo xoắn Đề tài nghiên cứu số biện pháp kiểm sốt tạp nhiễm q trình ni tảo xoắn Arthrospira platensis qua nghiên cứu số biện pháp nhằm cải thiện, hạn chế tác động tạp nhiễm đến tảo xoắn Đề tài nghiên cứu số biện pháp kiểm sốt tạp nhiễm q trình nuôi tảo xoắn Arthrospira platensis viii PHẦN I PHẦN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Vi tảo (bao gồm nhóm nhân chuẩn vi khuẩn lam nhân sơ) nhóm vi sinh vật có khả quang tự dƣỡng, tạo thành lƣới thức ăn sơ cấp ăn hệ sinh thái thuỷ vực Chính vi tảo nguồn thức ăn cho nhiều loại sinh vật bao gồm nguyên sinh động vật (protista), tiên mao, trùng roi (ciliates), amip (amoebae) luân trùng (rotifers) loại động vật lớn nhƣ ấu trùng nhuyễn thể, giáp xác Trong đó, nguyên sinh động vật, trùng roi, amip luân trùng nhóm sinh vật “ăn thịt” vi tảo q trình nuôi gây thiệt hại lớn đến suất chất lƣợng tảo Ngoài ra, điều kiện tự nhiên, mơi trƣờng ni vi tảo cịn bị nhiễm tạp virus, vi khuẩn vi nấm chí lồi tảo khác tác động mơi trƣờng bên ngồi nhƣ gió, bụi, trùng đem tới Đối với tảo xoắn Arthrospira platensis, tảo sinh trƣởng mơi trƣờng có độ kiềm cao, pH thƣờng xuyên giao động từ 9,5 đến 11 thân môi trƣờng nuôi không phù hợp cho nhiều đối tƣợng virus, vi khuẩn, vi nấm phát triển Tuy nhiên, nuôi chuyên canh quy mô công nghiệp, bể ni bị nhiễm tạp các yếu tố trên, chủ yếu nhóm sinh vật ăn tảo trực tiếp Do đó, để thành cơng q trình ni tảo quy mơ cơng nghiệp cần phải kiểm sốt tối đa đƣợc yếu tố tạp nhiễm Xuất phát từ vấn đề nêu trên, đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu giải pháp kiểm sốt tạp nhiễm q trình ni tảo xoắn Arthrospira platensis” nhằm khảo sát, đánh giá phân tích nguyên nhân đƣa số giải pháp thử nghiệm đánh giá kiểm soát tạp nhiễm việc kết hợp số yếu tố bao gồm kiểm sốt khu vực bể ni thử nghiệm số giải pháp nhằm ngăn ngừa hạn chế tƣợng tạp nhiễm q trình ni Qua làm sở để có biện pháp ngăn ngừa xử lý tạp nhiễm khu vực nuôi tảo đặc biệt ni quy mơ cơng nghiệp 1.2 Mục đích, ý nghĩa yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Xác định loại tạp nhiễm có mơi trƣờng ni tảo xoắn Arthrospira platensis - Đƣa số giải pháp thử nghiệm quy mơ thí nghiệm để kiểm tra tính khả thi giải pháp đề xuất Theo kết khảo sát, hệ thống PBR xuất tế bào vi khuẩn khơng có xuất loại tạp nhiễm cịn lại Hệ thống bể raceway nhà lƣới xuất vi khuẩn có xuất vi nấm động vật nguyên sinh nhƣng xảy bể tái sử dụng môi trƣờng sau lần thứ Hệ thống ni bể raceway ngồi trời có mật độ vi khuẩn > 10 tế bào/ml Ngoài xuất vi khuẩn vi nấm mức 5-10 tế bào/ml động vật nguyên sinh xuất nhóm ăn tảo (ciliates, amoebae, rotifers) Trong số bể nuôi, lƣợng NaHCO3 bổ sung mức thấp < 200 mM có tƣợng tảo Chlorella bắt đầu xuất Mật độ tảo Chlorella đôi lúc lên tới > 103 tế bào/ml Ở giai đoạn từ tháng đến tháng nhiệt độ thấp (nhiệt độ trung bình < 25C) và cƣờng độ ánh sáng thấp (trung bình < 30 klux) , tƣợng tảo silic xuất số bể, điển hình tảo Nitzchia sp., Nguyên nhân tƣợng gió bụi mang theo loại tảo bay vào khu bể nuôi Hình 4.1 Sự xuất tảo Chlorella sp tảo Nitzchia sp bể nuôi tảo Spirulina Ghi chú: Mẫu soi tươi độ khuếch đại 600 lần (không sử dụng lamella) để quan sát lớp khác tiêu Tảo tạp xuất môi trường tái sử dụng lần thứ 27 Hình 4.2 Một số mẫu tảo xoắn bị nhiễm tạp Bên phải: Mẫu bị nhiễm Nuclearia sp., Bên trái: mẫu bị nhiễm tảo Nitzchia sp Cả mẫu bị nhiễm khuẩn giàu chất hữu tảo chết tiết + Hình 4.3 Một số hình ảnh tảo bị tạp nhiễm Các mẫu bị nhiễm vi khuẩn lam, tảo silic nhóm ăn tảo Nucleria simplex Khi bể ni bị nhiễm loại tảo tạp, nhiễm khuẩn nguyên sinh động vật Amoeba sp đối tƣợng ăn tảo thuộc chi Brachionus (gọi chung microzooplanktonic grazers, rotifer cillia) cần phải nhanh chóng cách ly loại bỏ tác nhân nhanh Thơng thƣờng triệu chứng quan sát thấy tảo ngừng sinh trƣởng, màu tảo bể bị nhạt đi, tảo có dấu hiệu đứt gãy, xuất vệt bám thành bể nuôi, xuất bọt Nếu không xử lý kịp thời, bể nuôi chuyển sang màu vàng nâu bị chết nhanh chóng Việc bổ sung amonium 28 bicarbonate (3-5 mM) giúp loại bỏ đáng kể ức chế tác nhân tác động NH3 Kết hợp với xử lý nên thực đảo bể thƣờng xuyên cách tốt 4.2 Xác định mật độ vi khuẩn nấm môi trƣờng nuôi 4.2.1 Mật độ vi khuẩn môi trường nuôi Các mẫu tảo thu đƣợc hệ thống nuôi khép kín photobioreactor (PBR), bể raceway ngồi nhà lƣới từ mơ hình ni khác bao gồm: Hệ thống PBR, bể nuôi raceway bể HDPE môi trƣờng nuôi tái sử dụng sau lần Kết cấy môi trƣờng LB đặc cho thấy có xuất vi khuẩn sau 48 Kết quan sát khuẩn lạc xuất sau 48 đƣợc trình bày bảng sau: Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn xuất sau 48 hệ thống nuôi khác Mật độ vi Mẫu tảo đƣợc thu khuẩn từ hệ thống bể nuôi (cfu/ml) Độ pH thời điểm lấy mẫu Hệ thống PBR 2-10 9,5  0,1 Bể raceway môi trƣờng nuôi < 102 9,5  0,1 Bể bạt HDPE môi trƣờng nuôi < 102 9,5  0,1 Bể raceway, môi trƣờng tái sử dụng lần 50-102 10,5  0,2 Bể bạt HDPE, môi trƣờng tái sử dụng lần 102-103 10,5  0,2 Bể raceway, môi trƣờng tái sử dụng lần >103 11,8  0,6 Bể bạt HDPE, môi trƣờng tái sử dụng lần >103 11,8  0,7 Kết cho thấy, mật độ vi khuẩn bể nuôi raceway bể bạt môi trƣờng nuôi tƣơng đối thấp < 102 cfu/ml Tuy nhiên, môi trƣờng tái sử dụng, mật độ vi khuẩn tăng từ 50-100 cfu/ml Đối với môi trƣờng tái sử dụng lần thứ trở lên, mật độ vi khuẩn > 103/ml Nguyên nhân thời gia môi trƣờng nuôi tiếp xúc lâu với điều kiện bên ngồi tảo q trình thu qua đợt bị tổn thƣơng học dẫn đến giải phóng yếu tố nội bào tạo điều kiện mơi trƣờng thuận lợi cho vi khuẩn phát triển 29 Hình 4.4 Tảo nuôi bể bạt HDPE nhà lƣới đƣợc đảo trộn sục khí Hình 4.5 Tảo ni bể raceway nhà lƣới đƣợc đảo trộn guồng khuấy 30 4.2.2 Mật độ nấm môi trường nuôi Tƣơng tự, mẫu tảo thu đƣợc hệ thống ni khép kín photobioreactor (PBR), bể raceway ngồi nhà lƣới từ mơ hình ni khác bao gồm: Hệ thống PBR, bể nuôi raceway bể HDPE môi trƣờng nuôi tái sử dụng sau lần Kết cấy môi trƣờng PDA cho thấy có xuất nấm, nhiên mật độ tƣơng đối thấp Kết quan sát khuẩn lạc xuất sau ngày đƣợc trình bày bảng sau: Bảng 4.3 Mật độ nấm sau ngày hệ thống nuôi khác Mẫu tảo đƣợc thu Mật độ nấm Độ pH thời từ hệ thống bể nuôi (cfu/ml) điểm lấy mẫu Hệ thống PBR 1-3 9,5  0,1 Bể raceway môi trƣờng nuôi 8-12 9,5  0,1 Bể bạt HDPE môi trƣờng nuôi 10-15 9,5  0,1 Bể raceway, môi trƣờng tái sử dụng lần 10-30 10,5  0,2 Bể bạt HDPE, môi trƣờng tái sử dụng lần 30-102 10,5  0,2 Bể raceway, môi trƣờng tái sử dụng lần