Nghiên cứu bệnh virus hại cây cà chua

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: "NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS HẠI CÂY CÀ CHUA" Ngƣời thực : TẠ NGỌC LONG Mã SV : 632053 Lớp : K63 - BVTVA Ngƣời hƣớng dẫn : PGS TS HÀ VIẾT CƢỜNG Bộ môn : BỆNH CÂY HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, khóa luận cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu khóa luận trung thực, chưa sử dụng báo cáo khoa học Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho tơi thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn khóa luận ghi rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng nhà trường Hà Nội, ngày 05 tháng 03 năm 2022 Sinh viên Tạ Ngọc Long i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành báo cáo ngồi nỗ lực thân, nhận giúp đỡ tận tình quý báu từ nhiều tập thể cá nhân Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy PGS TS Hà Viết Cường – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Bệnh Nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Hà Nội trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện để giúp tơi hồn thành khóa luận báo cáo Đồng thời xin chân thành cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo môn Bệnh Thầy cô khoa Nông học nói riêng thầy giáo trường Học viện Nơng nghiệp Hà Nội nói chung nhiệt tình dạy dỗ, bảo cho suốt thời gian học tập trường Tôi xin cảm ơn cô nông dân cung cấp cho thông tin quan trọng buổi điều tra đồng ruộng tạo điều kiện cho xuống ruộng điều tra bệnh Cuối xin chân thành cảm ơn người thân, gia đình, bạn bè hết lịng giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thời gian hồn thành báo cáo Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 03 năm 2022 Sinh viên Tạ Ngọc Long xii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN xii MỤC LỤC xiii DANH MỤC BẢNG xvii DANH MỤC HÌNH xix TÓM TẮT xxi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích: 1.2.2 Yêu cầu: PHẦN TỔNG QUAN 2.1 Cây cà chua Việt Nam 2.2 Potyvirus gây bệnh cà chua 2.2.1 Thành phần potyvirus (chủ yếu PVY) 2.2.2 Triệu chứng gây hại 2.2.3 Phổ ký chủ 2.2.4 Tầm quan trọng 2.2.5 Lan truyền 2.2.6 Phòng chống 2.2.7 Chẩn đoán 2.3 Begomovirus gây bệnh cà chua 11 2.3.1 Thành phần begomovirus 11 2.3.2 Triệu chứng 12 2.3.3 Lan truyền 13 2.3.4 Phòng chống 13 2.3.5 Chẩn đoán 14 xiii 2.4 Tobamovirus gây bệnh cà chua 14 2.4.1 Thành phần tobamovirus 14 2.4.2 Triệu chứng gây hại 15 2.4.3 Lan truyền 15 2.4.4 Phòng chống 15 2.4.5 Chẩn đoán 15 2.5 Tospoviruss gây bệnh cà chua 17 2.5.1 Thành phần tospovirus 17 2.5.2 Triệu chứng gây hại 17 2.5.3 Phổ ký chủ 17 2.5.4 Tầm quan trọng 17 2.5.5 Lan truyền 17 2.5.6 Phòng chống 18 2.5.7 Chẩn đoán 18 2.6 Kỹ thuật lây nhiễm agroinoculation 18 2.6.1 Nguyên lý 18 2.6.2 Ứng dụng 19 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu 20 3.1.1 Mẫu bệnh 20 3.1.2 Cây virus lây nhiễm 20 3.1.3 Vật liệu kiểm tra PCR (đối với begomovirus), RT-PCR virus RNA potyvirus, tospovirus, tobamovirus) 20 3.1.4 Vật liệu ELISA 21 3.2 Nôi dung nghiên cứu 23 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu: 23 3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 xiv 3.3.1 Phương pháp điều tra 23 3.3.2 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu bệnh 24 3.3.3 Phương pháp lây nhiễm potyvirus, tospovirus, tobamovirus tiếp xúc học 24 3.3.4 Phương pháp lây nhiễm begomovirus agroinoculation 24 3.3.5 Phương pháp ELISA phát virus 25 3.3.6 Phương pháp PCR phát begomovirus 28 3.3.7.Phương pháp RT - PCR (Reverse Transcription – PCR) 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Tình hình bệnh hại cà chua Gia Lâm - Hà Nội vụ Xuân Hè năm 2022 32 4.1.1 Thành phần bệnh hại cà chua 32 4.1.2 Tình hình nhiễm bệnh virus cà chua ruộng sản xuất khu vực Gia Lâm-Hà Nội lân cận vụ xuân hè 2022 36 4.2 Đánh giá khả gây bệnh số dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm virus sử dụng kỹ thuật agroinoculation cà chua thuốc cv samsum 39 4.2.1 Tái tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm TYLCVNV, ToLCuVV, ToLCHanV, ToLCHnV, ToLCuCNV, MiYLCV, AYVV, PepYLCVNV TYLCKaV 40 4.2.2 Lây nhiễm nhân tạo Begomovirus kỹ thuật agroinoculation 41 4.2.3 Kết lây nhiễm 43 4.2.4 Kiểm tra PCR lây nhiễm 47 4.3 Đánh giá tính gây bệnh Tobamovirus Tospovirus họ cà lây nhiễm nhân tạo 49 4.4 Kiểm tra ELISA, PCR, RT-PCR phát virus mẫu ớt cà chua thu 52 4.4.1 Kiểm tra ELISA phát TSWV, TNRV, CaCV ToCV (chi Tospovirus) mẫu cà chua ớt thu 52 xv 4.4.2.Kiểm tra ELISA phát ToMV TMV (chi Tobamovirus) mẫu cà chua ớt thu 57 4.4.3 Kiểm tra PCR phát begomovirus mẫu cà chua ớt thu 59 4.4.4 Kiểm tra ELISA phát TBSV (chi Tombushvirus) mẫu cà chua ớt thu 62 4.4.5 Kiểm tra ELISA phát Potyvirus mẫu cà chua ớt thu .64 4.4.6.Kiểm tra ELISA phát CMV (chi Cucumovirus) mẫu cà chua ớt thu 66 4.4.7 Kiểm tra RT- PCR phát tobamovirus mẫu cà chua ớt thu 68 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 5.1 Kết luận: 71 5.2 Đề nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 Phụ Lục 76 xvi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng, suất, cà chua Việt Nam (Tổng cục thống kê Việt Nam, 2012) Bảng 2.2 Phân loại họ Potyviridae (Berger et al 2005) Bảng 3.1 Cây virus lây nhiễm 20 Bảng 3.2 Các mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.3 Các kít ELISA (viện DSMZ) sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 4.1 Thành phần bệnh hại cà chua Gia Lâm – Hà Nội vụ xuân hè năm 2022 32 Bảng 4.2 Mức độ nhiễm bệnh virus cà chua vụ Xuân Hè Văn Đức 2022 36 Bảng 4.3 Mức độ nhiễm bệnh virus cà chua vụ Xuân Hè Cổ Bi 2022 37 Bảng 4.4 Mức độ nhiễm bệnh virus cà chua vụ Xuân Hè Đặng Xá 2022 38 Bảng 4.5 Lây nhiễm nhân tạo begomovirus cà chua hồng đào thuốc cv Samsum vi khuẩn Agrobacterium (agroinoculation) 45 Bảng 4.6 Kết kiểm tra PCR mẫu lây nhiễm 48 Bảng 4.7 Kết lây tiếp xúc học Tobamovirus Tospovirus 52 Bảng 4.8 Kiểm tra ELISA phát tospovirus cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus 55 Bảng 4.9 Kiểm tra ELISA phát tobamovirus cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus 58 Bảng 4.10 Kết kiểm tra PCR phát begomovirus mẫu cà chua, ớt thu thập 60 Bảng 4.11 Kiểm tra ELISA phát TBSV cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus 63 Bảng 4.12 Kiểm tra ELISA phát potyvirus cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus 65 xvii Bảng 4.13 Kiểm tra ELISA phát CMV cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus 67 Bảng 4.14 Kết kiểm tra RT- PCR phát tobamovirus mẫu cà chua, ớt thu thập 69 xviii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các kỹ thuật kiểu ELISA khác (Koenig & Paul, 1982) 10 Hình 2.2 Phát virus kỹ thuật dot blot miễn dịch (western blot, trái; Hull, 2002) dot blot lai DNA (southern blot, phải; Hsu et al , 2005) 11 Hình 2.3 Cà chua ớt bị nhiễm Begomovirus 13 Hình 4.1 Mẫu cà chua bị đốm đen vi khuẩn chụp Cổ Bi-Gia Lâm - Hà Nội tác nhân gây bệnh (dịch vi khuẩn Xanthomonas vesicatoria) 33 Hình 4.2 Mẫu cà chua bị đốm vòng chụp Văn Đức – Gia Lâm tác nhân gây bệnh (nấm Alternaria solani) 34 Hình 4.3 Cây cà chua bị bệnh xoăn vàng (Đặng Xá-Gia Lâm, 2022) 34 Hình 4.4 Mẫu cà chua bị đốm hình nhẫn chết hoại Văn Đức - 35 Gia Lâm - Hà Nội (2022) 35 Hình 4.5 Bệnh mốc sương cà chua Đặng Xá - Gia Lâm - Hà Nội (nấm Phytophthora infestans) vụ đông năm 2022 36 Hình 4.6 Ruộng cà chua Văn Đức vụ Xuân Hè 2022 37 Hình 4.7 Ruộng cà chua Cổ Bi vụ Xuân Hè 2022 38 Hình 4.8 Ruộng cà chua Đặng Xá vụ Xuân Hè 2022 39 Hình 4.9a Phục hồi dịng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV, ToLCuCNV, TYLCKaV ToLCuVV môi trường LB agar 40 Hình 4.9b Phục hồi dịng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc xâm nhiễm TYLCVNV, AYVV, ToLCHnV, MiYLCV ToLCHanV môi trường LB agar 41 Hình 4.10 Phương pháp tiêm thân, chồi bên (bên trái) tiêm thẩm thấu (bên phải) 42 Hình 4.11 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus ToLCuVV, TYLCVNV, ToLCHanV, ToLCHnV, ToLCuCNV, xix MiYLCV, AYVV, PepYLCVN, Hình 4.21 Kết ELISA phát TBSV mẫu cà chua ớt ngày 04/08/2022 4.4.5 Kiểm tra ELISA phát Potyvirus mẫu cà chua ớt thu Chi Potyvirus chi lớn họ Potyviridae với khoảng 200 loài Như vậy, với chi Begomovirus (họ Geminiviridae), Potyirus chi virus thực vật lớn nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật Nhiều potyvirus tác nhân gây bệnh có ý nghĩa kinh tế có Potato virus Y (PVY) đặc biêt nguy hiểm họ cà Qua q trình điều tra chúng tơi phát số mẫu có triệu chứng nghi ngờ nhiễm ptyvirus khảm lá.Vì chúng tơi tiến hành kiểm tra ELISA mẫu, sử dụng kháng thể đặc hiệu chung cho chi Potyvirus Kết thể bảng 4.12 hình 4.22 Kết cho thấy có tới 7/12 mẫu cho kết ELISA +, có mẫu có giá trị OD từ 5.23 đến 7.66, cao nhiều so với ngưỡng (OD = 0.374).Đáng ý mẫu To20 To21 hai cà chua không mang triệu chứng bệnh thu Viện Rau-Gia Lâm-Hà Nội để làm đối chứng,tuy nhiên 64 sau kiểm tra ELISA lại cho kết dương tính.Kết ELISA chứng tỏ potyvirus xuất phổ biến địa điểm điều tra Gia Lâm-Hà Nội Bảng 4.12 Kiểm tra ELISA phát potyvirus cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus Mẫu To1 Cây Cà chua Ngày thu thập Địa điểm thu thập Triệu chứng 22/03/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Đốm chết hoại hình nhẫn 0,569 + To10 Cà chua 23/05/2022 To11 Cà chua 23/05/2022 To2 Cà chua 22/03/2022 To3 Cà chua 8/4/2022 To4 Cà chua 8/4/2022 To5 Cà chua 8/4/2022 To6 Cà chua 8/4/2022 To7 Cà chua 18/05/2022 To9 Cà chua 18/05/2022 To20 Cà chua 08/2022 To21 Cà chua 08/2022 Potyviruses OD Kết luận Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội khảm 0,184 - khảm, cong mép 0,246 - khảm 0,523 + Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Khảm 0,475 + khảm 0,251 - xoăn 0,284 - xoăn 0,766 + khảm 0,394 + 0,201 - 0,473 + 0,532 + Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Viện Rau-Gia Lâm Viện Rau - Gia Lâm Ngưỡng Đốm chết hoại hình nhẫn Cây 4-5 thật Cây 4-5 thật 0,374 65 Hình 4.22 Kết ELISA phát Potyviruses mẫu cà chua ớt ngày 04/08/2022 4.4.6.Kiểm tra ELISA phát CMV (chi Cucumovirus) mẫu cà chua ớt thu Qua điều tra chúng tơi có nhiều mẫu mang triệu chứng khảm , nghi ngờ có xuất CMV virus có phổ kí chủ rộng có gây hại cà chua.Do chúng tơi tiến hành kiểm tra ELISA với kháng thể/kháng huyết Cucumber mosaic virus(CMV) để kiểm tra virus Chỉ có 2/12 mẫu cho phản ứng ELISA + với giá trị OD 0,385 0,554 không cao so với ngưỡng (0,347) màu sắc hiển thị ELISA mẫu cho phản ứng + mờ nhạt.Từ thấy mức độ phổ biến CMV khu vực điều tra thấp khơng có.Kết thể bảng 4.13 hình 4.23 66 Bảng 4.13 Kiểm tra ELISA phát CMV cà chua ớt biểu triệu chứng bệnh virus Mẫu To1 Cây Cà chua CMV Ngày thu thập Địa điểm thu thập Triệu chứng 22/03/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội OD Kết luận Đốm chết hoại hình nhẫn 0,385 + Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội khảm 0,319 - khảm, cong mép 0,187 - khảm 0,291 - To10 Cà chua 23/05/2022 To11 Cà chua 23/05/2022 To2 Cà chua 22/03/2022 To3 Cà chua 8/4/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Khảm 0,274 - To4 Cà chua 8/4/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội khảm 0,194 - To5 Cà chua 8/4/2022 xoăn 0,197 - To6 Cà chua 8/4/2022 xoăn 0,189 - To7 Cà chua 18/05/2022 khảm 0,231 - 0,180 - 0,554 + 0,222 - Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội To9 Cà chua 18/05/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội Pep1 Ớt 2021 Đức Trọng Lâm Đồng Pep3 Ớt 2021 Đức Trọng Lâm Đồng Ngưỡng 67 Đốm chết hoại hình nhẫn Đốm chết hoại hình nhẫn 0,347 Hình 4.23 Kết ELISA phát CMV mẫu cà chua ớt ngày 04/08/2022 4.4.7 Kiểm tra RT- PCR phát tobamovirus mẫu cà chua ớt thu Các tobamovirus virus lan truyền dễ dàng qua tiếp xúc học qua hạt giống Đối với họ cà, hai tobamovirus hiên gây quan ngại lớn cho sản xuất ngành BVTV Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) virus khắc phục tính kháng ToMV Ở thí nghiệm 4.4.2 tiến hành kiểm tra ELISA tobamovirus ToMV TMV Mặc dù có mẫu có phản ứng dương với TMV mẫu phản ứng dương với ToMV kết không chắn giá trị OD chúng thấp Do chúng triệu chứng khảm rõ rệt nên nghi ngờ nồng độ virus mẫu chưa đủ cao để hiển thị kết rõ rệt ELISA Để chắn có mặt tobamovirus mẫu, tiến hành phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi chung phát tobamovirus TobRT up1 TobRT do2 Chúng lựa chọn mẫu với triệu chứng điển hình cho xét nghiệm RT-PCR 68 Kết kiểm tra RT-PCR (Bảng 4.14, Hình 4.24) cho thấy tất mẫu kiểm tra cho kết âm tính Như vậy, chúng tơi kết luận tất mẫu thu không bị nhiễm tobamovirus Bảng 4.14 Kết kiểm tra RT- PCR phát tobamovirus mẫu cà chua, ớt thu thập đƣợc Thứ tự bảng điện di STT Mã Ngày thu thập Địa điểm thu thập Triệu chứng Kết PCR To2 22/03/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội khảm - To7 18/05/2022 Văn Đức - Gia Lâm - Hà Nội khảm - 23/05/2022 Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh khảm - khảm,cong mép - - - - To10 To11 23/05/2022 Hịa Đình - Võ Cường - Bắc Ninh Pep1 2021 Lâm Đồng Pep4 17/8/2022 Lâm Đồng Khảm,biến vàng,ringsp ot Pep5 18/08/2022 Lâm Đồng Biến vàng,nhăn 69 Hình 4.24 Kết điện di sản phẩm RT-PCR phát tobamovirus mẫu cà chua, ớt thu thập đƣợc 70 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: Điều tra đồng ruộng địa điểm Văn Đức – Hưng yên, Cổ bi-Gia Lâm Đặng Xá-Gia Lâm phát bệnh hại cà chua đốm vi khuẩn, đốm vòng, mốc sương, đốm chết hoại hình nhẫn xoăn vàng lá, phổ biến xoăn vàng lá, mốc sương Triệu chứng bênh xoăn, vàng có mức độ phổ biến cao khu vực Gia Lâm, nhiên không xuất nhiều khu vưc Văn Đức –Gia Lâm, triệu chứng khảm đốm hình nhẫn có mức độ phổ biến cao khu vực Các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo agroinoculation cấu trúc xâm nhiễm begomovirus gồm công thức cà chua giống Hồng Đào thuốc giống cv Samsum cho thấy thuốc biểu triệu chứng virus lây nhiễm Các cà chua lây nhiễm không biểu triệu chứng sau lây nhiễm tháng mặc d phản ứng ELISA dương tính Kết lây nhiễm chứng tỏ thuốc mẫn cảm với nhiều virus có begomovirus họ cà Việt Nam điều kiện ngoại cảnh đặc biệt nhiệt độ cao thời gian thí nghiệm ảnh hưởng lớn tới biểu triêu chứng lây nhiễm Đã kiểm tra ELISA, PCR RT-PCR mẫu cà chua ớt thu đồng ruộng khu vực Gia Lâm-Hà Nội số mẫu thu thập từ trước Kết kiểm tra cho thấy (i) TSWV TNRV hai tospovirus phổ biến nhất, (ii) potyvirus phổ biến khu vực điều tra, (iii) có mặt TBSV CMV dường thấp khơng có, (iv) khơng có xuất tobamovirus khu vực điều tra địa bàn Gia Lâm-Hà Nội 5.2 Đề nghị Đề tài thực thời gian ngắn , kết điều tra cịn hạn chế, nên đề nghị cần tiếp tục nghiên cứu số 71 vấn đề sau: Tiếp tục nghiên cứu bệnh virus gây hại họ cà, nhiều loại trồng thuộc nhiều v ng sinh thái khác nước Tìm biện pháp phịng trừ bệnh virus gây cà chua số loài trồng khác 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arous S., Harmon C., Capobianco H & Polston J (2018) Comparison of genusspecific primers in RT-PCR for the broad-spectrum detection of viruses in the genus Potyvirus by plant diagnostic laboratories Journal of virological methods 258: 29-34 Chiemsombat P., Sharman M., Srivilai K., Campbell P., Persley D & Attathom S (2010) A new tospovirus species infecting Solanum esculentum and Capsicum annuum in Thailand Australasian Plant Disease Notes 5(1): 75-78 Clark M F & Adams A (1977) Characteristics of the microplate method of enzymelinked immunosorbent assay for the detection of plant viruses Journal of general virology 34(3): 475-483 Cortez I., Saaijer J., Wongjkaew K., Pereira A.-M., Goldbach R., Peters D & Kormelink R (2001) Identification and characterization of a novel tospovirus species using a new RT-PCR approach Archives of Virology 146(2): 265-278 Coutts B & Jones R (2015) Potato virus Y: Contact transmission, stability, inactivation, and infection sources Plant disease 99(3): 387-394 Coutts B., Kehoe M & Jones R (2013) Zucchini yellow mosaic virus: Contact transmission, stability on surfaces, and inactivation with disinfectants Plant disease 97(6): 765-771 Cường H V (2012) Bài giảng Virus thực vật,Phytoplasma Viroid Đại học Nông nghiệp Hà Nội pages pages Czosnek H., Ghanim M & Ghanim M (2002) The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus Annals of Applied Biology 140(3): 215231 Dong J.-H., Cheng X.-F., Yin Y.-Y., Fang Q., Ding M., Li T.-T., Zhang L.-Z., Su X.X., McBeath J H & Zhang Z.-K (2008) Characterization of tomato zonate spot virus, a new tospovirus in China Archives of Virology 153(5): 855-864 73 Dovas C I., Efthimiou K & Katis N I (2004) Generic detection and differentiation of tobamoviruses by a spot nested RT-PCR-RFLP using dI-containing primers along with homologous dG-containing primers Journal of virological methods 117(2): 137-144 Dương Kim Thoa & Thi T K (2007) Kết chọn tạo giống cà chua ưu lai phục vụ chế biến pages pages Fauquet C., Briddon R., Brown J., Moriones E., Stanley J., Zerbini M & Zhou X (2008) Geminivirus strain demarcation and nomenclature Archives of Virology 153(4): 783-821 Green S., Tsai W., Shih S., Black L., Rezaian A., Rashid M., Roff M., Myint Y & Hong L (2001) Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam Plant disease 85(12): 1286-1286 Green S K & Kim J (1991) Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review (18) Asian Vegetable Research and Development Center Shanhua, Taiwan pages pages Grimsley N., Hohn B., Hohn T & Walden R (1986) ―Agroinfection,‖ an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid Proceedings of the National Academy of Sciences 83(10): 3282-3286 Ha C., Revill P., Harding R., Vu M & Dale J (2008) Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam Archives of Virology 153(1): 45-60 Ha Viet Cuong, Nguyen Minh Thuy & Hoa N T T a T T N (2019) DETECTION AND IDENTIFICATION OF TOSPOVIRUSES IN VIETNAM Hassani-Mehraban A., Cheewachaiwit S., Relevante C., Kormelink R & Peters D (2011) Tomato necrotic ring virus (TNRV), a recently described tospovirus species infecting tomato and pepper in Thailand European journal of plant pathology 130(4): 449-456 74 Lima J., Nascimento A., Radaelli P & Purcifull D (2012) Serology applied to plant virology Serological diagnosis of certain human, animal and plant diseases Rijeka Croácia InTech https://doi org/10.5772/3803 Moriones E & Navas-Castillo J (2000) Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide Virus research 71(1-2): 123-134 Moyer, J G., T S., J & Ullman & D (1999) An update on tomato spotted wilt virus and related tospoviruses Pappu H., Jones R & Jain R (2009) Global status of tospovirus epidemics in diverse cropping systems: successes achieved and challenges ahead Virus research 141(2): 219-236 Rahman M., Su X., Zheng K., Cheng X., Li T., Zhao L., Dong J & Zhang Z (2020) Characterization of a New Isolate of Chilli ringspot virus in Yunnan, China Journal of Crop Science and Biotechnology 23(1): 57-63 Sui X., Zheng Y., Li R., Padmanabhan C., Tian T., Groth-Helms D., Keinath A P., Fei Z., Wu Z & Ling K.-S (2017) Molecular and Biological Characterization of Tomato mottle mosaic virus and Development of RT-PCR Detection Plant disease 101(5): 704-711 Tran T., Pham L., Ng H., Hart S & Nicetic O (2008) Good Agricultural Practices for tomato and cucumber production in Vietnam GAP Workshop 21-22 Hull R (2013) Plant virology Academic press pages pages Gadhave K R., Gautam S., Rasmussen D A & Srinivasan R J V (2020) Aphid transmission of Potyvirus: the largest plant-infecting RNA virus genus 12(7): 773 Mowat W & Dawson S J J o V M (1987) Detection and identification of plant viruses by ELISA using crude sap extracts and unfractionated antisera 15(3): 233-247 75 Phụ Lục PHỤ LỤC Kiểm tra ELISA phát tobamovirus tospovirus Bảng giá trị OD kiểm tra TSWV TNRV 10 11 12 A 0.0347 0.1203 0.1418 0.1337 1.3028 0.8427 0.9016 0.1571 0.1646 0.1638 0.1756 0.045 B 0.0373 0.1465 0.1503 0.1743 0.6824 0.8404 0.8546 0.2179 0.2168 0.211 0.1662 0.038 C 0.0363 0.12 0.1418 0.1619 0.4853 0.8251 0.9812 0.1913 0.1787 0.163 0.1663 0.0385 D 0.0341 0.114 0.1453 0.1441 0.38 0.9167 0.8037 0.167 0.1695 0.1562 0.209 0.0367 E 0.0397 0.1496 0.1297 0.1492 0.9404 1.0536 0.7971 0.1774 0.1706 0.1868 0.1578 0.0439 F 0.0356 0.1154 0.1311 0.1618 0.6192 0.9304 0.7546 0.2049 0.1658 0.2875 0.1996 0.0356 G 0.0384 0.1232 0.1295 0.1756 0.5486 0.952 0.8718 0.1594 0.172 0.2031 0.1992 0.037 H 0.0399 0.1245 0.114 0.1548 0.1755 0.1526 0.1427 0.1918 0.1371 0.2481 0.1524 0.0365 Sơ đồ ELISA phát TSWV TNRV TSWV 10 11 A To1 To2 To1 To2 B To3 To4 To3 To4 C To5 To6 To5 To6 D To7 To9 To7 To9 E To10 To11 To10 To11 F Pep1 Pep3 Pep1 Pep3 G đc1 đc2 đc1 đc2 H đc3 76 TNRSV đc3 12 Bảng giá trị OD kiểm tra CACV,TMV,ToMV,ToCV 10 11 12 A 0.0575 0.2852 0.2412 0.1722 0.2264 0.1893 0.1973 0.2111 0.2098 0.0387 0.0527 0.0506 B 0.0513 0.4105 0.2217 0.2833 0.204 0.2036 0.1861 0.2543 0.2631 0.0419 0.0403 0.0525 C 0.0472 0.2236 0.1797 0.1873 0.1737 0.1649 0.1555 0.1783 0.1893 0.0559 0.0573 0.049 D 0.0493 0.2386 0.1937 0.2054 0.1886 0.1656 0.1613 0.1643 0.1966 0.0551 0.0503 0.0445 E 0.0575 0.278 0.2 0.1969 0.176 0.1533 0.147 0.1713 0.1607 0.0448 0.0469 0.0516 F 0.0667 0.4791 0.2336 0.2628 0.2065 0.2228 0.1701 0.2327 0.2197 0.0417 0.0461 0.0452 G 0.0543 0.2925 0.2111 0.1944 0.2295 0.1946 0.1835 0.3258 0.2826 0.0635 0.0608 0.0612 H 0.0841 1.1965 0.1547 0.2199 0.1685 0.5573 0.1954 1.0611 0.1724 0.0502 0.047 0.0738 10 11 Sơ đồ ELISA phát CACV,TMV,ToMV,ToCV CACV TMV ToMV ToCV A To1 To2 To1 To2 To1 To2 To1 To2 B To3 To4 To3 To4 To3 To4 To3 To4 C To5 To6 To5 To6 To5 To6 To5 To6 D To7 To9 To7 To9 To7 To9 To7 To9 E To10 To11 To10 To11 To10 To11 To10 To11 F Pep1 Pep3 Pep1 Pep3 Pep1 Pep3 Pep1 Pep3 G đc1 đc2 đc1 đc2 đc1 đc2 đc1 đc2 H đc3 đc3 đc3 77 đc3 12 PHỤ LỤC Kiểm tra ELISA phát Potyviruses,CMV TBSV Bảng giá trị OD kiểm tra Potyviruses,CMV TBSV 10 11 12 A 0.0477 0.0456 0.0362 0.0373 0.0391 0.0334 0.0343 0.0347 0.0368 0.0397 0.0386 0.0508 B 0.0454 0.5693 0.5299 0.475 0.385 0.291 0.274 0.220 0.217 0.246 0.0323 0.0409 C 0.0379 0.2507 0.2839 0.7657 0.194 0.197 0.189 0.175 0.180 0.186 0.0359 0.0337 D 0.0313 0.3935 0.2006 0.1836 0.231 0.180 0.319 0.172 0.174 0.200 0.0398 0.0347 E 0.0391 0.2458 0.1949 0.182 0.187 0.554 0.222 0.172 0.174 0.200 0.0418 0.0368 F 0.0364 0.473 0.5323 0.1899 0.239 0.372 0.328 0.184 0.186 0.195 0.0319 0.0443 G 0.0376 0.1779 0.1716 0.1668 0.1699 0.1576 0.1767 0.1798 0.1773 0.1644 0.0377 0.0397 H 0.0347 0.0269 0.0269 0.0281 0.0363 0.0362 0.0382 0.0369 0.0357 0.0383 0.0364 0.0376 11 12 Sơ đồ ELISA phát Potyviruses,CMV TBSV POTY CMV TBSV 10 B To1 To2 To3 To1 To2 To3 To1 To2 To3 C To4 To5 To6 To4 To5 To6 To4 To5 To6 D To7 To9 To10 To7 To9 To10 To7 To9 To10 E To11 Pep1 Pep3 To11 Pep1 Pep3 To11 Pep1 Pep3 F Đ/c1 Đ/c2 Đ/c3 Đ/c1 Đ/c2 Đ/c3 Đ/c1 Đ/c2 Đ/c3 A G H 78