Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu begomovirus gây hại cây cà chua tại việt nam

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BEGOMOVIRUS GÂY HẠI CÂY CÀ CHUA TẠI VIỆT NAM Người thực : NGUYỄN THỊ THANH THẮNG MSV : 610102 Lớp : K61BVTVB Người hướng dẫn : TS.TRẦN NGUYỄN HÀ Bộ môn : BỆNH CÂY HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, tồn số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thắng i LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Nguyễn Hà, người tận tình hướng dẫn, bảo, khuyến khích em nỗ lực suốt q trình thực đề tài Em xin chân thành cám ơn PGS.TS Hà Viết Cường, người tạo điều kiện hướng dẫn em trình thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, khích lệ, tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành đề tài Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thắng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii DNH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT xi PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY CÀ CHUA 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Giá trị dinh dưỡng 2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGỒI NƯỚC 2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 2.4 BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA DO BEGOMOVIRUS GÂY RA 11 2.4.1 Triệu chứng 12 2.4.2 Tác nhân gây bệnh 13 2.4.3 Hình thái begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua 15 2.4.4 Đặc điểm gien begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua 16 2.4.5 Cấu trúc phân tử DNA-A 16 2.4.6 Cấu trúc phân tử DNA-B 17 2.4.7 Đặc điểm vùng IR 18 2.4.8 Phân loại begomovirus 18 iii 2.4.9 Tái sinh begomovirus 20 2.4.10 Môi giới lan truyền begomovirus 21 2.4.11 Thiệt hại begomovirus gây 23 2.4.12 Phòng trừ begomovirus 24 2.5 Bệnh xoăn vàng cà chua Tomato yellow leaf - curl Kachanaburi virus gây 27 2.6 Bệnh héo xoăn cà chua Tomato leaf curl Hainan virus gây 28 2.7 kỹ thuật chẩn đoán pcr 28 2.8 kĩ thuật agroinoculation 29 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 3.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 31 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 31 3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31 3.3.1 Các giống thí nghiệm 31 3.3.2 Dụng cụ thí nghiệm 31 3.3.3 Các đệm ELISA 31 3.3.4 Đệm điện di phản ứng PCR 32 3.3.5 Các cấu trúc xâm nhiễm begomovirus 32 3.3.6 Mồi PCR phát begomovirus xác định 33 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.4.1 Chuẩn bị khuôn DNA cho phản ứng PCR 35 3.4.2 Phản ứng PCR 35 3.4.3 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào A.tumefaciens khả biến phương pháp xung điện 37 3.4.4 Lây nhiễm Agroinoculation 37 3.4.5 Phương pháp kiểm tra ELISA (Enzyme linked immune sorbent asay) 38 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 BIẾN NẠP CẤU TRÚC XÂM NHIỄM CỦA BEGOMOVIRUS VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMERFACIENS 39 4.1.1 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm begomovirus vào tế bào A tumerfaciens xung điện chọn lọc vi khuẩn môi trường 40 4.1.2 Kiểm tra PCR dòng vi khuẩn A tumerfaciens biến nạp 43 iv 4.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA CÁC CẶP MỒI THIẾT KẾ ĐỐI VỚI CÁC BEGOMOVIRUS GÂY HẠI TRÊN CÂY HỌ CÀ 47 4.3 LÂY NHIỄM NHÂN TẠO CÁC BEGOMOVIRUS BẰNG AGROINOCULATION 54 4.3.1 Kết lây nhiễm bệnh xoăn vàng cà chua gây Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) 56 4.3.2 Kết lây nhiễm bệnh xoăn cà chua gây Tomato leaf curl Vietam virus (ToLCuVV) 59 4.3.3 Kết lây nhiễm bệnh xoăn cà chua gây Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) 62 4.3.4 Kết lây nhiễm bệnh xoăn cà chua gây Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV) 66 4.3.5 Kết lây nhiễm bệnh xoăn cà chua gây Tomato leaf curl China virus (ToLCCNV) 69 4.3.6 Kết lây nhiễm bệnh xoăn vàng trinh nữ gây Mimosa yellow leaf curl virus (MiYLCV) 73 4.3.7 Kết lây nhiễm bệnh vàng gân hoa ngũ vị gây Ageratum yellow vein virus (AYVV) 76 4.3.8 Kết lây nhiễm bệnh xoăn vàng ớt gây Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) 79 4.3.9 Kết lây nhiễm bệnh xoăn vàng cà chua gây Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) 83 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 5.1 KẾT LUẬN 89 5.2 ĐỀ NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Triệu chứng begomovirus gây 13 Hình 2.2 Hình thái Begomovirus 15 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B begomovirus (Ha, 2007) 16 Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-A begomovirus (Ha, 2007) 17 Hình 2.5 Cấu trúc phân tử DNA-B begomovirus (Ha, Coombs et al., 2008) 18 Hình 4.1 Kết biến nạp xung điện plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm begomovirus cà chua ớt phân lập Việt Nam vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens (chủng LBA4404) 43 Hình 4.2 Kết PCR kiểm tra dòng vi khuẩn chứa cấu trúc A tumerfaciens 46 Hình 4.3 Kết PCR kiểm tra dịng vi khuẩn chứa cấu trúc A tumerfaciens 46 Hình 4.4 Kết PCR kiểm tra dòng vi khuẩn chứa cấu trúc A tumerfaciens 47 Hình 4.5 Kết PCR kiểm tra dòng vi khuẩn chứa cấu trúc A tumerfaciens 47 Hình 4.6 Kết PCR với cặp mồi TYLCVNV F2/ TYLCVNV R2 51 Hình 4.7 Kết PCR với mồi ToLCVV F2/ ToLCVV R2 51 Hình 4.8 Kết PCR với mồi To 100 F1/ To 100 F2 51 Hình 4.9 Kết PCR với mồi ToLCHnV F1/ ToLCHnV R1 52 Hình 4.10 Kết PCR với mồi TB101 F1/ TB101 R1 52 Hình 4.11 Kết PCR với mồi BegoA F1/ BegoA R1 52 Hình 4.12 Kết PCR với mồi VB65 F1/ VB65 R1 53 Hình 4.13 Kết PCR với mồi VNP93A F1/ VNP93A R1 53 Hình 4.14 Kết PCR với mồi TYKaA F1/ TYKaA R1 53 Hình 4.15 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus ToLCuVV, TYLCVNV, ToLCHanV, ToLCHnV, ToLCuCNV, MiYLCV, AYVV, PepYLCVN, TYLCKaV DNA-β cà chua vô hạn,cà chua Hồng Đào, cà pháo, ớt chuông, thuốc cảnh thuốc K326 vi khuẩn Agrobacterium (agroinoculation) 56 Hình 4.16 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus TYLCVNV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 58 Hình 4.17 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus ToLCuVV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 61 Hình 4.18 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus ToLCHanV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 64 vi Hình 4.19 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus ToLCHnV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 68 Hình 4.20 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus ToLCCNV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 71 Hình 4.21 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus MiYLCV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 75 Hình 4.22 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus AYVV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 78 Hình 4.23 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus PepYLCVNV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 81 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các begomovirus hại trồng phát Việt Nam 12 Bảng 4.1 Kết biến nạp cấu trúc vào vi khuẩn vi khuẩn A.tumefaciens chủng LBA4404 kĩ thuật xung điện lần 40 Bảng 4.2 Kết biến nạp xung điện plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm begomovirus cà chua ớt phân lập Việt Nam vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens (chủng LBA4404) 41 Bảng 4.3 Kết PCR kiểm tra dòng vi khuẩn A tumefaciens biến nạp với plamid mang cấu trúc xâm nhiễm begomovirus mồi đặc hiệu 44 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tính đặc hiệu mồi 49 Bảng 4.5 Kết lây nhiễm Agroinoculation virus TYLCVNV 57 Bảng 4.6 kết lây nhiễm Agroinoculation virus ToLCuVV 60 Bảng 4.7 Kết lây nhiễm Agroinoculation virus ToLCHanV 63 Bảng 4.8 kết lây nhiễm Agroinoculation virus ToLCHnV 66 Bảng 4.9 Kết lây nhiễm Agroinoculation virus ToLCCNV 69 Bảng 4.10 Kết lây nhiễm Agroinoculation virus MiYLCV 73 Bảng 4.11 kết lây nhiễm Agroinoculation virus AYVV 76 Bảng 4.12 Kết lây nhiễm Agroinoculation virus PepYLCVNV 79 Bảng 4.13 kết lây nhiễm Agroinoculation virus TYLCKaV 83 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AT A.tumefaciens AVRDC Trung tâm nghiên cứu phát triển rau Châu Á AYVV Ageratum yellow vein virus BVTV Bảo vệ thực vật CNSH Công nghệ sinh học CMV Cytomegalo virus CR Commom region CTAB Cetryl Ammonium Bromide CR Common Region DNA Deoxyribonucleic acid ĐHNN Đại học Nông Nghiệp ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay ICTV Uỷ ban phân loại virus Quốc tế (International committee on Taxonomy of Virus) IR Intergenic region LB Lysogeny Broth MiYLCV Mimosa yellow leaf curl virus MP Movement protein NCBI National Center for Biotechnology Information NSP Nuclear shuttle protein ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction PepYLCVNV Pepper yellow leaf curl Vietnam virus pRBR Plant retino blastoma – related protein PVA Potato virus A PVX Potato virus X PVY Potato virus Y ix Hình 4.23 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus PepYLCVNV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 81 Kết theo dõi sau lây nhiễm PepYLCVNV cho thấy, tuần đầu, lây nhiễm có vết biến vàng mặt vị trí tiêm dịch vi khuẩn vào Sau tuần, triệu chứng biểu rõ rệt điển hình thuốc cảnh N benthamiana: xoăn, cuộn vào trong, gân phồng lên Các thuốc K326, cà pháo, cà chua vô hạn, cà chua Hồng Đào, ớt chưa có triệu chứng sau tuần lây nhiễm Kết thí nghiệm ELISA thể qua bảng 4.5 hình 4.16 giúp tơi đưa kết luận sau: Với cơng thức lây nhiễm dịng VNP1500-1(DNA-A) cho kết sau: + 3/3 thuốc cảnh cho kết dương với ELISA + 3/3 thuốc K326 cho kết dương với ELISA + 1/3 cà chua Hồng Đào cho kết dương với ELISA + 0/2 cà chua vô hạn cho kết dương với ELISA + 2/2 cà pháo cho kết dương với ELISA + 1/3 ớt cho kết dương với ELISA Với công thức lây nhiễm hỗn hợp dòng vi khuẩn VNP1500-1(DNA-A) VNP1500-20(DNA-B) cho kết sau: + 3/3 thuốc cảnh cho kết dương với ELISA + 3/3 thuốc K326 cho kết dương với ELISA + 0/3 cà chua Hồng Đào cho kết dương với ELISA + 0/2 cà chua vô hạn cho kết dương với ELISA + 2/2 cà pháo cho kết dương với ELISA + 2/3 ớt cho kết dương với ELISA Kết chứng tỏ DNA-A PepYLCVNV có tính gây bệnh quan trọng biểu triệu chứng điển hình thuốc cảnh 82 Kết lây nhiễm bệnh xoăn vàng cà chua gây Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) begomovirus có gen kép gồm DNA-A DNA-B xác định tỉnh Kanchanaburi, Thái Lan TYLCVNV virus phổ biến cà chua họ cà khác cà bát, cà pháo miền Nam Việt Nam Để kiểm chứng tính gây bệnh dòng vi khuẩn VNP843-4 (DNA-A) tổ hợp dòng vi khuẩn VNP843-4 (DNA-A) + VNP843-6(DNA-B), thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo phương pháp Agroinoculation với công thức lây sau thực hiện: 1- Chỉ lây nhiễm dịng VNP843-4 (DNA-A) 2- Lây nhiễm hỗn hợp dòng vi khuẩn: VNP843-4 (DNA-A) VNP8436 (DNA-B) 3- Đối chứng: không tiêm Kết lây nhiễm TTYLCKaV phương pháp Agroinoculation thể bảng 4.13 hình 4.24: Bảng 4.13 kết lây nhiễm Agroinoculation virus TYLCKaV Giá trị OD 405 nm Công thức lây nhiễm 843-4 (DNA-A) 843-4 (DNA-A) + 843-6 (DNA-B) Số biểu triệu chứng cây cây3 Số ELISA (+) N benthamiana 0,4122 0,3414 0,294 3/3 3/3 K326 0,3211 0,3732 0,3562 3/3 0/3 Hồng Đào 0,5635 0,395 x 2/2 0/2 Cà chua vô hạn 0,2773 0,3314 x 0/2 0/2 Cà pháo 0,5973 0,4901 x 2/2 0/2 Ớt 0,2922 0,2241 0,245 1/3 0/3 N benthamiana 0,3469 0,3677 0,3629 3/3 3/3 K326 0,3292 0,3274 0,346 3/3 0/3 Hồng Đào 0,4665 0,5471 0,3665 3/3 0/3 Giống 83 Đối chứng Cà chua vô hạn 0,2447 0,2793 x 0/2 0/2 Cà pháo 0,3126 0,304 x 2/2 0/2 Ớt 0,2271 0,2398 0,233 0/3 0/3 N benthamiana 0,2555 0,2653 0,2461 K326 0,2894 0,2624 0,2981 Ngưỡng 0,274 83 0,32053 Hồng Đào 0,2573 0,2419 0,302 0,3295 Cà chua vô hạn 0,3433 0,2688 0,2626 0,38139 Cà pháo 0,2378 0,236 0,2042 0,2638 Ớt 0,2034 0,2378 0,2266 0,25769 Triệu chứng kiểm tra ELISA đánh giá tuần sau lây nhiễm; giá trị OD đo sau ủ qua đêm Hình 4.24 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus TYLCKaV cà chua (giống cà chua vô hạn, Hồng Đào), thuốc K326, thuốc cảnh N.benthamiana, ớt chuông, cà pháo xanh vi khuẩn Agrobacteium (agroinoculation) 84 Kết theo dõi sau lây nhiễm TYLCKaV cho thấy, tuần đầu, lây nhiễm có vết biến vàng mặt vị trí tiêm dịch vi khuẩn vào Sau tuần, triệu chứng xoăn nhẹ quan sát thấy thuốc cảnh N benthamiana Tất lại không biểu triệu chứng sau lây nhiễm tuần Kết thí nghiệm ELISA thể qua bảng 4.5 hình 4.16 giúp đưa kết luận sau: Với cơng thức lây nhiễm dịng VNP843-4(DNA-A) cho kết sau: + 3/3 thuốc cảnh cho kết dương với ELISA + 3/3 thuốc K326 cho kết dương với ELISA + 2/2 cà chua Hồng Đào cho kết dương với ELISA + 0/2 cà chua vô hạn cho kết dương với ELISA + 2/2 cà pháo cho kết dương với ELISA + 1/3 ớt cho kết dương với ELISA Với công thức lây nhiễm hỗn hợp dòng vi khuẩn VNP843-4 (DNA-A) VNP843-6(DNA-B) cho kết sau: + 3/3 thuốc cảnh cho kết dương với ELISA + 3/3 thuốc K326 cho kết dương với ELISA + 3/3 cà chua Hồng Đào cho kết dương với ELISA + 0/2 cà chua vô hạn cho kết dương với ELISA 85 + 2/2 cà pháo cho kết dương với ELISA + 0/3 ớt cho kết dương với ELISA Nhận xét kết lây nhiễm nhân tạo begomovirus agroinoculation Trên thí nghiệm, chúng tơi sử dụng phương pháp để lây nhiễm khuẩn vào Tiêm trực tiếp: Dịch vi khuẩn tiêm trực tiếp nách xi lanh y tế loại mL Thẩm thấu trực tiếp: Tiếp theo, dùng xy lanh tháo kim bơm dịch vi khuẩn vào mặt để vi khuẩn xâm nhập vào mơ qua khí khổng Các công thức lây nhiễm (18 công thức) bao gồm: - Cơng thức 1: dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm TYLCVNV - Công thức 2: hỗn hợp dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm TYLCVNV DNA-β - Cơng thức 3: dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCuVV - Công thức 4: hỗn hợp dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCuVV DNA-β - Cơng thức 5: dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCHanV - Cơng thức 6: hỗn hợp dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCHanV DNA-β - Công thức 7: dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV - Cơng thức 8: hỗn hợp dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV DNA-β - Cơng thức 9: dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCuCNV - Công thức 10: hỗn hợp dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm ToLCuCNV DNA-β - Cơng thức 11: dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm MiYLCV - Công thức 12: hỗn hợp dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm MiYLCV DNA-β 86 - Công thức 13: dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm AYVV - Cơng thức 14: hỗn hợp dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm AYVV DNA-β - Cơng thức 15: dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV ( DNA – A) - Cơng thức 16: hỗn hợp dịng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV ( DNA – A) PepYLCVNV ( DNA – B) - Công thức 17: dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm TYLCKaV (DNA – A) - Công thức 18: hỗn hợp dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm TYLCKaV ( DNA – A) TYLCKaV ( DNA – B) Mỗi công thức thực loại cây, loại cây, tiêm trực tiếp mũi nách tính từ xuống, bơm vết khác với ba tiêm vào nách Vì nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn A tumefeciens chuyển gien 28ºC – 30ºC nên thí nghiệm chuyển vào phòng điều hòa nhiệt độ 28ºC trước, sau suốt trình lây nhiễm nhân tạo để tạo điệu kiện cho vi khuẩn hoạt động thuận lợi Sau thí nghiệm chuyển ngồi đề đảm bảo cho bọ phấn (môi giới truyền Begomovirus), để cách mặt đất xấp xỉ 30m (nhà lưới tầng – Trung tâm Bệnh Nhiệt đới) Sau 10 ngày quan sát (26/6/2021-6/7/2021) lây nhiễm chưa biểu triệu chứng nhiễm hệ thống Tuy nhiên xuất vết chết hoại giống phản ứng siêu nhạy thuốc K326 cà pháo xanh, cà chua vô hạn, ớt chuông vết lây nhiễm (Hình 4.25) Phản ứng siêu nhạy biết phản ứng tự chết tế bào mô nhằm chống lại công tác nhân gây bệnh Chính vậy, phản ứng siêu nhạy khơng có lợi cho q trình chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens tế bào lây nhiễm Đây nguyên nhân dẫn tới làm chậm trình xâm nhiễm biểu triệu chứng virus 87 Hình 4.25 Phản ứng giống phản ứng siêu nhạy (mũi tên đỏ) lây nhiễm agroinoculation cà chua, thuốc giống K326, cà pháo ớt Sau 2-3 tuần, thuốc cảnh N benthamiana công thức lây lên biểu triệu chứng hầu hết công thức Trên giống thuốc K326, cà chua vô hạn Cà chua Hồng Đào, cà pháo xanh, ớt chuông biểu triệu chứng nhiễm virus hệ thống Kết theo dõi biểu triệu chứng lây nhiễm cho thấy tượng chết hoại giống phản ứng siêu nhạy xuất gần 100% vết lây nhiễm bơm trực tiếp thuốc K326, cà pháo xanh, ớt chuông Tỉ lệ vết biến vàng chết hoại giống khác khác 88 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình thực đề tài, thu số kết sau: Đã biến nạp thành công 12 cấu trúc xâm nhiễm begomovirus DNA vệ tinh (DNA-beta) gồm PepYLCVNV, TYLCKaV, TYLCVNV, ToLCuVV, TLCHnV, TLCHanV, ToLCCNV, AYVV, MiYLCV DNA vệ tinh (DNA-beta) vào tế bào vi khuẩn A tumerfaciens chủng LBA4404 phương pháp xung điện Các dòng vi khuẩn biến nạp chọn lọc môi trường LB agar chứa kháng sinh Streptomycin, Rifampicin Kanamycin Các dòng vi khuẩn biến nạp mang cấu trúc kiểm tra PCR khuẩn lạc Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm làm khn, tính đặc hiệu cặp mồi chẩn đoán begomovirus đánh giá PCR Kết đánh giá cho thấy 6/8 cặp mồi có tính đặc hiệu cao gồm cặp mồi thiết kế phát TYLCVNV, ToLCVV, ToLCHanV, AYVV, TYLCKanV PepYLCVNV; 2/8 cặp mồi có tính đặc hiệu thấp gồm cặp mồi thiết kế phát ToLCHnV, TYLCuCNV Các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo agroinoculation cấu trúc xâm nhiễm begomovirus gồm 18 công thức họ cà gồm giống cà chua, cà pháo, ớt, thuốc giống K326 thuốc cảnh (N benthamiana) cho thấy thuốc cảnh biểu triệu chứng virus lây nhiễm Tất lây nhiễm cịn lại khơng biểu triệu chứng sau lây nhiễm tháng phản ứng ELISA dương tính Kết lây nhiễm chứng tỏ thuốc cảnh thị mẫn cảm với nhiều virus có begomovirus họ cà Việt Nam điều kiện ngoại cảnh đặc biệt nhiệt độ cao thời gian thí nghiệm ảnh hưởng lớn tới biểu triêu chứng lây nhiễm 89 5.2 Đề nghị Đề tài thực thời gian ngắn , kết điều tra cịn hạn chế, nên chúng tơi đề nghị cần tiếp tục nghiên cứu số vấn đề sau: Tiếp tục nghiên cứu bệnh begomovirus gây hại cà chua, nhiều loại trồng thuộc nhiều vùng sinh thái khác nước Tìm biện pháp phịng trừ bệnh virus gây cà chua số loài trồng khác 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abhary, M., et al (2007) Molecular biodiversity, taxonomy, and nomenclature of tomato yellow leaf curl-like viruses Tomato yellow leaf curl virus disease, Springer: 85-118 Boulton, M I (1995) "Agrobacterium-mediated transfer of geminiviruses to plant tissues." Plant Gene Transfer and Expression Protocols: 77-93 Briddon (2003) "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex." Molecular plant pathology 4(6): 427-434 Brown, J K., et al (2015) "Revision of Begomovirus taxonomy based on pairwise sequence comparisons." Archives of virology 160(6): 1593-1619 Chakraborty, S., et al (2003) "Tomato leaf curl Gujarat virus, a new begomovirus species causing a severe leaf curl disease of tomato in Varanasi, India." Phytopathology 93(12): 1485-1495 Chen, С and M Chen (1983) "Electron microscopy of rice ragged stunt and Echinochloa ragged stunt." Plant Prot Bull.(Taiwan) 25: 310-311 Cohen, S and I Harpaz (1964) "PERIODIC, RATHER THAN CONTINUAL ACQUISITION OF A NEW TOMATO VIRUS BY ITS VECTOR, THE TOBACCO WHITEFLY (BEMISIA TABACI GENNADIUS) 1." Entomología experimentalis et applicata 7(2): 155-166 Czosnek, H., et al (2002) "The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus." Annals of Applied Biology 140(3): 215-231 Czosnek, H and H Laterrot (1997) "A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses." Archives of virology 142(7): 1391-1406 10 DÍAZ‐PENDĨN, J A., et al (2010) "Tomato yellow leaf curl viruses: ménage trois between the virus complex, the plant and the whitefly vector." Molecular plant pathology 11(4): 441-450 11 Fauquet, C., et al (2008) "Geminivirus strain demarcation and nomenclature." Archives of virology 153(4): 783-821 12 Fauquet, C and J Stanley (2005) "Revising the way we conceive and name viruses below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for 91 new standardized isolate descriptors." Archives of virology 150(10): 21512179 13 Green, S., et al (2001) "Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam." Plant Disease 85(12): 1286-1286 14 Gutierrez, et al (2004) "Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111-119 15 Ha (2007) "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam." 16 Ha (2008) "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation." Journal of General Virology 89(1): 312-326 17 Ha, et al (2008) "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation." Journal of General Virology 89(1): 312-326 18 Harrison and Robinson (2005) "Another quarter century of great progress in understanding the biological properties of plant viruses." Annals of applied biology 146(1): 15-37 19 Hellens, R., et al (2000) "Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors." Trends in plant science 5(10): 446-451 20 Moriones and Navas-Castillo (2000) "Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide." Virus Research 71(1): 123-134 21 Moriones, E and J Navas-Castillo (2000) "Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide." Virus research 71(1-2): 123-134 22 Mound, L A (1962) "Studies on the olfaction and colour sensitivity of Bemisia tabaci (Genn.)(Homoptera, Aleyrodidae)." Entomología experimentalis et applicata 5(2): 99-104 92 23 Navot, N., et al (1991) "Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1): 151-161 24 Padidam, et al (1999) "Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination." Virology 265(2): 218-225 25 Picó, B., et al (1996) "Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop II The Tomato yellow leaf curl virus—A review." Scientia Horticulturae 67(3-4): 151-196 26 Rochester, D E., et al (1990) "Systemic movement and symptom production following agroinoculation with a single DNA of tomato yellow leaf curl geminivirus (Thailand)." Virology 178(2): 520-526 27 Rybicki (1994) "A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae." Archives of virology 139(1-2): 49-77 28 Stanley, J., et al (2005) "Family geminiviridae." Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses: 301-326 29 Stonor, J., et al (2003) "Tomato leaf curl geminivirus in Australia: occurrence, detection, sequence diversity and host range." Plant Pathology 52(3): 379-388 30 Zhang, H., et al (2010) "Molecular characterization of Tomato leaf curl Hainan virus, a new begomovirus, and evidence for recombination." Journal of Phytopathology 158(11‐12): 829-832 31 Rivany T and Gerling D (1987), Aphelinidae parasitoids (Hymenoptera: Chalcidoidea) of Whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae) in Israel, withdescription of three new species, Entomophaga 32(5), p TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn – Viện Bảo vệ thực vật (2000), Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, tập III NXB Nông nghiệp Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn (2003) Phương pháp điều tra phát sinh vật hại trồng”, tiêu chuẩn ngành 910 TCN 224 – 2003 Bộ mơn trùng (2004), Giáo trình Cơn trùng chuyên khoa NXB Nông nghiệp Cục Bảo vệ thực vật (1995), Phương pháp điều tra phát sâu bệnh hại trồng NXB Nông nghiệp 93 Tạ Thu Cúc cộng (1983), “Kỹ thuật trồng cà chua”, NXB Nông nghiệp Hà Nội Trang 1-50 Tạ Thu Cúc, Hồ Hữu An, Nghiêm Thị Bích Hà (2000), “Giáo trình rau”, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Trang 117 - 145 PGS TS Tạ Thu Cúc (2008), Kỹ thuật trồng cà chua, NXB Nông nghiệp Phạm Tiến Dũng (2003), Xử lý kết thí nghiệm máy vi tính IRRISTAT 4.0 Windows NXB Nơng nghiệp Nguyễn Văn Đĩnh (chủ biên) (2007), Giáo trình Biện pháp sinh học bảo vệ thực vật NXB Nông nghiệp 10 Hà Quang Hùng, Nguyễn Thị Kim Oanh (2007), Đặc điểm sinh học, sinh thái bọ phấn (Bemisia tabaci Gennadiius) hại dưa chuột Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, 5/2007 11 Lê Thị Liễu (2004), “Nghiên cứu đặc điểm sinh học biện pháp hố học phịng trừ bọ phấn Bemisia tabaci Genn hại cà chua vùng Gia Lâm, Hà Nội”, 12 Vũ Triệu Mân, Nguyễn Kim Oanh (1993), Nghiên cứu biện pháp sử dụng thuốc hợp lý để phòng trừ bệnh xoăn cà chua Tạp chí BVTV số 127/1/1993, tr – 13 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1999), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng NXB Giáo dục, tr 182 14 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (2001), Giáo trình bệnh nông nghiệp.NXB Nông nghiệp, tr 240 – 241 15 Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 16 Phạm Chí Thành (1998), Giáo trình phương pháp thí nghiệm đồng ruộng NXB Nông nghiệp 17 Nguyễn Thơ (1984), Điều tra, nghiên cứu số bệnh virus chủ yếu ba trồng họ cà (Solanaceae) có ý nghĩa kinh tế: Thuốc lá, cà chua, khoai tây Luận án Phó tiến sĩ khoa học Nơng nghiệp, Hà Nội 18 Nguyễn Đình Thơng (2006), Nghiên cứu đánh giá mức độ mẫn cảm với số loại thuốc trừ sâu bọ phấn (Bemisia tabaci Gennadius) vùng trồng rau Hà Nội phụ cận Luận án Thạc sĩ Nông nghiệp, Hà Nội 94 19 Tổ nghiên cứu bệnh cà chua – Viện Bảo vệ thực vật (1970), Một số kết nghiên cứu bước đầu bệnh xoăn cà chua Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, số 98, 8/1970, tr 457 – 463 20 Nguyễn Văn Viên (1994), Điều tra bệnh xoăn lá, mốc sương, héo rũ cà chua, héo rũ thuốc nghiên cứu khả phòng trừ bệnh biện pháp hóa học Gia Lâm – Hà Nội, Ba Vì – Hà Tây Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp – Hà Nội, tr 15, 60,63 21 Nguyễn Văn Viên (1999), Nghiên cứu tình hình phát sinh, phát triển biện pháp phòng trừ số bệnh nấm bệnh xoăn hại cà chua vùng Hà Nội phụ cận Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp 22 Ngô Thị Xuyên, Nguyễn Văn Đĩnh (2003), Nghiên cứu tình hình bệnh hạicà chua nhà lưới ồng ruộng năm 2003 – 2005 Hà Nội.Tạp chí Bảo vệ thực vật 95