Nghiên cứu bệnh virus trên cây họ đậu

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS TRÊN CÂY HỌ ĐẬU Người thực : VI THỊ HỒNG Mã SV : 632033 Lớp : K63BVTVA Người hướng dẫn : PGS.TS HÀ VIẾT CƯỜNG Bộ môn : BỆNH CÂY HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng báo cáo, luận án, luận văn, công trình nghiên cứu khoa học Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực đề tài cảm ơn thông tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Vi Thị Hồng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành báo cáo ngồi nỗ lực thân, tơi nhận giúp đỡ tận tình quý báu từ nhiều tập thể cá nhân Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy PGS TS Hà Viết Cường – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Bệnh Nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện để tơi hồn thành báo cáo Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán công nhân viên thuộc Trung tâm Nghiên cứu Bệnh Nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực tập Trung tâm Đồng thời tơi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo môn Bệnh Thầy cô khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhiệt tình dạy dỗ, bảo cho tơi suốt thời gian học tập trường Cuối xin chân thành cảm ơn người thân, gia đình, bạn bè hết lịng giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập hồn thành báo cáo Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Vi Thị Hồng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH .ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP x PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU .4 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 2.1 CÂY HỌ ĐẬU VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG TRONG SẢN XUẤT 2.1.1 Một số giống họ đậu 2.1.2 Tầm quan trọng 2.1.3 Thực trạng sản xuất họ đậu Việt Nam .7 2.2 POTYVIRUS GÂY BỆNH TRÊN ĐẬU ĐỖ 2.2.1 Thành phần potyvirus 2.2.2 Triệu chứng gây hại .12 2.2.3 Phổ ký chủ 12 2.2.4 Tầm quan trọng 12 2.2.5 Lan truyền 13 2.2.6 Phòng chống 13 2.2.7 Chẩn đoán 14 2.3 BEGOMOVIRUS GÂY BỆNH TRÊN ĐẬU ĐỖ 16 2.3.1 Thành phần Begomovirus 16 2.3.2 Triệu chứng gây hại .19 iii 2.3.3 Phổ ký chủ 19 2.3.4 Tầm quan trọng 19 2.3.5 Lan truyền 20 2.3.6 Phòng chống .20 2.3.7 Chẩn đoán .21 2.4 KỸ THUẬT LÂY NHIỄM BẰNG AGROINOCULATION 22 PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 3.1.1 Virus 24 3.1.2 Cây lây nhiễm 24 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24 3.2.1 Cây thí nghiệm 24 3.2.2 Các plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm KuMV, FbSLCV, MYMV .27 3.2.3 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 27 3.2.4 Mồi PCR phát virus .27 3.2.5 Các kít ELISA phát virus đậu đỗ 28 3.2.6 Vật liệu lây nhiễm nhân tạo 29 3.2.7 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Agrobacterium 29 3.2.8 Các dụng cụ, thiết bị 29 3.2.9 Hóa chất lây nhiễm nhân tạo .29 3.2.10 Các kháng sinh 29 3.2.11 Vật liệu kiểm tra PCR (đối với begomovirus), 30 3.2.12 Vật liệu ELISA 30 3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .31 3.3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.3.2 Thời gian nghiên cứu: 31 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 31 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng phương pháp thu thập, bảo quản mẫu bệnh .32 iv 3.5.2 Phương pháp lây nhiễm virus tiếp xúc học 33 3.5.3 Phương pháp biến nạp cấu trúc xâm nhiễm begomovirus vào tế bào Agrobacterium tumerfaciens xung điện .34 3.5.4 Phương pháp lây nhiễm KuMV, FbSLCV, MYMV Agroinoculation 35 3.5.5 Phương pháp ELISA phát virus 39 3.5.6 Phương pháp PCR phát virus 41 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 KẾT QUẢ ĐIỀU TRA BỆNH VIRUS HẠI CÂY ĐẬU XANH, ĐẬU ĐEN, ĐẬU TƯƠNG TẠI GIA LÂM (HÀ NỘI) NĂM 2022 .44 4.1.1 Triệu chứng bệnh quan sát 44 4.1.2 Điều tra tình hình nhiễm bệnh 48 4.1.3 Xác định thành phần potyvirus gây bệnh từ mẫu thu thập đồng ruộng phương pháp ELISA 51 4.1.4 Phát begomovirus từ mẫu thu thập đồng ruộng phương pháp PCR 58 4.2 LÂY NHIỄM NHÂN TẠO VIRUS ĐẬU ĐỖ BẰNG TIẾP XÚC CƠ HỌC TỪ CÁC MẪU THU THẬP ĐƯỢC NGOÀI ĐỒNG RUỘNG 61 4.2.1 Lây nhiễm nhân tạo virus đậu đỗ tiếp xúc học đậu tương .61 4.2.2 Lây nhiễm nhân tạo virus đậu đỗ tiếp xúc học đậu xanh 62 4.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH GÂY BỆNH CỦA MYMV, KUMV, FBSLCV BẰNG LÂY NHIỄM NHÂN TẠO DÙNG AGROINOCULATION 63 4.3.1 Chuẩn bị dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm KuMV, FbSLCV, MYMV 63 4.3.2 Kết đánh giá tính gây bệnh MYMV Agroinoculation .67 4.3.3 Kết đánh giá tính gây bệnh KuMV agroinoculation 72 4.3.4 Kết đánh giá tính gây bệnh FbSLCV agroinoculation .82 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 90 5.1 KẾT LUẬN .90 5.2 ĐỀ NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO .93 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens CP Capsid protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid GoTaq MM GoTaq® Master Mixes LB Luria and Bertani PBS Phosphate-buffered saline PBST Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 PCR Polymerase Chain Reaction Rep Replication associated protein ssDNA Singe strand DNA TAE Tris – acetate – EDTA Taq Thermus aquatic KuMV Kudzu mosaic virus FbSLCV French bean severe leaf curl virus MYMV Mungbean yellow mosaic virus Viện NCRHQ Viện nghiên cứu rau hoa vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Cây thí nghiệm 25 Bảng 3.2 Mồi PCR phát virus .27 Bảng 3.3 Các kít ELISA (viện DSMZ) sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 4.1 Triệu chứng bệnh virus đậu xanh 45 Bảng 4.2 Triệu chứng bệnh virus đậu tương 46 Bảng 4.3 Triệu chứng bệnh virus đậu đen 48 Bảng 4.4 Điều tra bệnh virus hại đậu xanh giai đoạn hoa – đậu Gia Lâm (Hà Nội) năm 2022 49 Bảng 4.5 Điều tra bệnh virus hại đậu tương giai đoạn hoa – đậu Gia Lâm (Hà Nội) năm 2022 50 Bảng 4.6 Điều tra bệnh virus hại đậu đen giai đoạn hoa – đậu Đặng xá – Gia Lâm (Hà Nội) ngày 2/6/2022 51 Bảng 4.7 Kiểm tra ELISA phát potyvirus đậu xanh biểu bệnh virus thu Gia Lâm – Hà Nội năm 2022 53 Bảng 4.8 Kiểm tra ELISA phát potyvirus đậu tương biểu bệnh virus thu Gia Lâm – Hà Nội năm 2022 55 Bảng 4.9 Kiểm tra ELISA phát potyvirus đậu đen biểu bệnh virus thu Đặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội năm 2022 57 Bảng 4.10 Kiểm tra PCR phát begomovirus đậu đen, đậu xanh, đậu tương biểu bệnh virus thu Gia Lâm – Hà Nội năm 2022 60 Bảng 4.11 Kết lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học ngày 14/5/2022 giống đậu tương ĐT84 62 Bảng 4.12 Kết lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học ngày 14/5/2022 đậu xanh 62 Bảng 4.13 Kết biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào vi khuẩn A tumerfaciens PCR khuẩn lạc .65 Bảng 4.14 Tính gây bệnh MYMV lây nhiễm agroinoculation đậu xan 69 Bảng 4.15 Tính gây bệnh MYMV lây nhiễm agroinoculation phương pháp tiêm thân, tiêm họ đậu thuốc .70 vii Bảng 4.16 Đánh giá phương pháp lây nhiễm agroinoculation KuMV giống đậu tương DT84 .74 Bảng 4.17 Tính gây bệnh KuMV giống đậu tương 75 Bảng 4.18 Tính gây bệnh KuMV loại khác 79 Bảng 4.19 Tính gây bệnh FbSLCV lây nhiễm agroinoculation đậu đỗ.84 Bảng 4.20 Tính gây bệnh FbSLCV lây nhiễm agroinoculation lạc thị .87 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các kỹ thuật kiểu ELISA khác (Koenig & Paul, 1982) .16 Hình 3.1 Phương pháp tiêm 37 Hình 3.2 Phương pháp châm hạt ủ qua đêm .38 Hình 4.1 Triệu chứng bệnh virus đậu xanh 45 Hình 4.2 Triệu chứng bệnh virus đậu tương thu Gia Lâm 47 Hình 4.3 Triệu chứng bệnh virus đậu đen 48 Hình 4.4 Kiểm tra ELISA phát potyvirus .58 Hình 4.5 PCR phát begomovirus 61 Hình 4.6 Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm virus KuMV, FbSLCV MYMV môi trường LB agar (A) Cấy trang vi khuẩn sau biến nạp xung điện; (B) Cấy đơn khuẩn lạc sang đĩa LB agar để kiểm tra PCR (C) Cấy ria dòng vi khuẩn kiểm tra PCR để lây nhiễm agroinoculation 66 Hình 4.7 PCR khuẩn lạc kiểm tra dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens biến nạp với cấu trúc xâm nhiễm KuMV (A), FbSLCV (B) MYMV (C) .67 Hình 4.8 Kết kiểm tra PCR MYMV sau lây nhiễm Agroinoculation 71 Hình 4.9 Đậu tương DT84 lây nhiễm Agroinoculation (A, biểu triệu chứng; B, không biểu triệu chứng) 76 Hình 4.10 So sánh đậu tương DT84 nhiễm bệnh (trái) khỏe (phải) 77 Hình 4.11 Biểu triệu chứng đậu tương DT 2000 Đ8 sau lây nhiễm tuần 77 Hình 4.12 Sắn dây biểu triệu chứng .80 Hình 4.13 Thuốc Sam sum gốc (A) K326 (B) .80 Hình 4.14 Kết kiểm tra PCR KuMV sau lây nhiễm Agroinoculation 81 Hình 4.15 Biểu triệu chứng đậu đỗ sau lây Agroinoculation tuần 86 Hình 4.16 Kết kiểm tra PCR FbSLCV sau lây nhiễm Agroinoculation 89 ix 4.3.4 Kết đánh giá tính gây bệnh FbSLCV agroinoculation Cây đậu đỗ biết đến khó lây nhiễm Agronoiculation so với loại khác Do FbSLCV lần phát Việt Nam tất thông tin đặc điểm sinh học virus chưa nghiên cứu công bố nên mục tiêu thí nghiệm xác nhận cấu trúc xâm nhiễm xây dựng sẵn có tính gây bệnh tìm hiểu phổ ký chủ virus, trước hết họ đậu 4.3.4.1 Đánh giá tính gây bệnh agroinoculation đậu đỗ Thí nghiệm thực giống đậu cove, đậu đen, đậu đũa (Bảng 4.19) Chúng sử dụng phương pháp lây nhiễm châm hạt, tiêm thân, tiêm Cây thí nghiệm (cây có 3-5 thật) hạt nảy mầm Sau lây nhiễm tiến hành chăm sóc theo dõi thường xuyên nhà lưới cách ly bọ phấn Sau tuần lây nhiễm, phương pháp lây kết hợp châm hạt, tiêm thân tiêm ngày 17/8 cho kết đậu cove N61, đậu đen TV số 1, đậu đen PN03, đậu đũa N66 có biểu triệu chứng xoăn dội giống với triệu chứng điển hình FbSLCV (Hình 4.15) Các lây trước phương pháp châm hạt tiêm thân, tiêm không biểu triệu chứng (Bảng 4.19) Kết PCR 31 mẫu đậu cove, đậu đũa, đậu đen với cặp mồi VNP 194 For3/Rev3 có phản ứng âm tính (Hình 4.16 A, C) Chứng tỏ, không bị nhiễm FbSLCV Kiểm tra PCR mẫu đậu cove N61, đậu đũa VA.009, đậu đũa N.66, đậu đen TV số 1, đậu đũa YL128 với cặp mồi VNP 194 For3/Rev3 có phản ứng dương trừ đậu đũa YL128 (Hình 4.16 D) Như vậy, ngoại trừ đậu đũa YL128, mẫu lại bị nhiễm FbSLCV Bên cạnh đó, tỉ lệ hạt sống phương pháp châm hạt thấp (có thể châm hạt làm tổn thương mạnh hạt) Đặc biệt giống cove hạt trắng (Cove nhật, PD262, N61) có tỉ lệ nảy mầm Giống cove 82 PD262 hạt bị thối tỉ lệ nảy mầm 0% sau đợt lây nhiễm 30 hạt phương pháp châm hạt Trong trình trồng lây nhiễm, nhận thấy giống cove hạt trắng có tỉ lệ nảy mầm lây nhiễm dễ bị chết so với giống cove hạt đen 83 Bảng 4.19 Tính gây bệnh FbSLCV lây nhiễm agroinoculation đậu đỗ Số biểu triệu chứng sau lây Số lây tuần tuần tuần tuần Số PCR (+)/ Số kiểm tra PCR Đợt lây Ngày trồng 19/4 18/4 Châm hạt 20 0 0 KKT 21/4 20/4 Châm hạt 40 0 0 0/2 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 2/5 31/4 Châm hạt 30 0 0 0/2 19/5 26/5/- 4/6 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 24/5 23/5 Châm hạt 30 0 0 0/2 Đậu cove bụi hạt trắng N.59 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 0 KKT Đậu cove vàng cao sản dạng bụi VA.007 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 0 KKT 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 1 1/1 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 KKT 2/5 31/4 Châm hạt 30 0 0 KKT 19/5 26/5/- 4/6 Tiêm thân, tiêm 0 0 KKT 24/5 23/5 Châm hạt 30 0 0 KKT 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 Giống Cove nhật, hạt trắng, dạng bụi Đậu Cove leo, hạt đen GS012 Đậu cove N61 Đậu Cove hạt trắng, dạng bụi PD262 Đậu đũa cao sản Ngày lây Phương pháp lây 84 số (N.66) Đậu đũa cao sản số (VA.009) Đậu đũa cao sản YL 128 Đậu đen PN 03 Đậu đen TV số 23/4 23-29/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 3 1/1 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 23/4 23-29/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 3 1/1 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 23/4 23-29/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/1 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 4 1/1 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 23/4 23-29/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 10 10 1/1 23/4 3-9/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 23/4 23-29/5 Tiêm thân, tiêm 0 0 0/2 18/6 17/6 Châm hạt 18/6 3/7 Tiêm thân 30 0 1 1/1 Ghi chú: KKT: Khơng kiểm tra 85 Hình 4.15 Biểu triệu chứng đậu đỗ sau lây Agroinoculation tuần 4.3.4.2 Đánh giá tính gây bệnh FbSLCV agroinoculation lạc thị Thí nghiệm thực giống lạc (lạc VL14, lạc Tiger, lạc đỏ) giống thuốc (N benthamiana, N tabacum cv Samsum, N tabacum cv K326 (bảng 4.20) Chúng sử dụng phương pháp lây nhiễm tiêm thân 86 tiêm Cây thí nghiệm (cây có 3-5 thật) Sau lây nhiễm tiến hành chăm sóc theo dõi thường xuyên nhà lưới cách ly bọ phấn Sau tuần lây nhiễm, khơng có biểu triệu chứng Kiểm tra PCR 11 mẫu gồm giống thuốc giống lạc với cặp mồi VNP 194 For3/Rev3 kích thước 368bp có phản ứng âm tính (Hình 4.16 B) Chứng tỏ, tất không bị nhiễm FbSLCV, khơng phải ký chủ phù hợp FbSLCV Bảng 4.20 Tính gây bệnh FbSLCV lây nhiễm agroinoculation lạc thị Số biểu triệu Số TT Cây thí nghiệm chứng sau lây Đợt Mẫu lây tuần tuần tuần tuần Thuốc cảnh (N benthamiana) Thuốc (N tabacum cv Samsum) Số PCR (+)/ Số kiểm tra 0 0 0/1 0 0 0/2 0 0 0/2 0 0 0/2 0 0 0/2 Thuốc (N tabacum cv K326) Lạc đỏ Lạc tiger 0 0 0/2 Lạc Vl14 0 0 0/2 87 A B C 88 D Hình 4.16 Kết kiểm tra PCR FbSLCV sau lây nhiễm Agroinoculation Chú thích: M Marker 89 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Điều tra đồng ruộng đậu đen, đậu tương, đậu xanh Gia Lâm – Hà Nội năm 2022 phát triệu chứng bệnh virus gồm khảm, khảm vàng, xoăn – khảm vàng, xoăn – biến dạng – khảm, xoăn – biến dạng – khảm vàng xoăn biến dạng – mép biến vàng-cong Điều tra mức độ nhiễm theo triệu chứng bệnh virus Gia Lâm năm 2022 cho thấy triệu chứng khảm vàng xoăn khảm vàng phố biến họ đậu Kiểm tra ELISA potyvirus BCMNV, BCMV, BYMV, BBWV-2, PSbMV SMV 18 mẫu họ đậu biểu tất triệu chứng bệnh virus thu thập Gia Lâm năm 2022 phát virus gồm BCMV, BBWV2, PSbMV SMV Kiểm tra PCR dùng mồi chung begomovirus 12 mẫu họ đậu biểu tất triệu chứng bệnh virus thu thập Gia Lâm năm 2022 cho thấy tất mẫu có phản ứng PCR âm tính, chứng tỏ chúng không nhiễm begomovirus Lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học 10 mẫu họ đậu biểu triệu chứng bệnh virus giống đậu xanh 208, đậu xanh sẻ giống đậu tương ĐT84 Sau lây nhiễm tuần, không thấy xuất triệu chứng bệnh tất lây chứng tỏ virus gây bệnh không truyền tiếp xúc học Đã biến nạp thành công cấu trúc xâm nhiễm begomovirus KuMV, FbSLCV MYMV vào tế bào vi khuẩn Agrobacterum tumerfaciens phương pháp xung điện Các dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm virus sử dụng để lây nhiễm phương pháp agroinoculation họ đậu thị virus Lây nhiễm nhân tạo MYMV agroinoculation giống đậu xanh 208, đậu xanh sẻ Sau tuần lây nhiễm, biểu triệu chứng, phát triển bình thường Kiểm tra PCR mẫu với cặp mồi MY-A 90 For1/Rev1 MY-B Seq F1/Seq R1 cho kết âm tính Chứng tỏ, MYMV khó lây agroinoculation giống đậu xanh Lây nhiễm nhân tạo MYMV agroinoculation giống thuốc (N tabacum cv Samsum; N tabacum cv K326), giống lạc (lạc VL14, lạc Tiger, lạc đỏ) muồng trâu Sau tuần lây nhiễm phương pháp tiêm thân, không có biểu triệu chứng Kiểm tra PCR với cặp mồi MY-A For1/Rev1 MY-B Seq F1/Seq R1, có lạc đỏ có phản ứng dương với cặp mồi MY-B Seq F1/Seq R1, ký chủ phù hợp lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens nên hiệu chuyển gen thấp Lây nhiễm nhân tạo KuMV agroinoculation giống đậu tương DT84, DT2000, Đ8 Sau lây nhiễm tuần, thấy có biểu triệu chứng bệnh tất giống lây nhiễm Cụ thể, giống DT84 (1/35 cây), giống DT2000 (2/5 cây), giống Đ8 (2/5 cây) Kiểm tra PCR mẫu đậu tương với cặp mồi KuA-3 For1/Rev1 KuB-7 For1/Rev1 cho kết quả: mẫu biểu triệu chứng có phản ứng dương tính, chứng tỏ chúng nhiễm KuMV 10 Lây nhiễm nhân tạo KuMV agroinoculation giống thuốc (N benthamiana, N tabacum cv Samsum, N tabacum cv K326), sắn dây xấu hổ Sau tuần lây nhiễm phương pháp tiêm thân, sắn dây có biểu triệu chứng Kiểm tra PCR mẫu với cặp mồi KuA-3 For1/Rev1 KuB-7 For1/Rev1, mẫu có phản ứng dương ngoại trừ xấu hổ Điều chứng tỏ xấu hổ khơng phải kí chủ KuMV 11 Lây nhiễm nhân tạo FbSLCV agroinoculation giống đậu cove, đậu đũa, đậu đen Sau tuần lây nhiễm, lây nhiễm ngày 17/8 (Đậu cove N61, đậu đen TV số 1, đậu đen PN03, đậu đũa N66) có biểu triệu chứng Kiểm tra PCR biểu triệu chứng với cặp mồi VNP 194 For3/Rev3 cho kết dương tính Tuy nhiên, tỉ lệ nhiễm bệnh họ đậu thấp (1/30 = 3.3%) chứng tỏ, FbSLCV khó lây phương pháp Agroinoculation 91 12 Lây nhiễm nhân tạo FbSLCV agroinoculation giống thuốc (N benthamiana; N tabacum cv Samsum; N tabacum cv K326) giống lạc (lạc VL14, lạc Tiger, lạc đỏ) Sau tuần lây nhiễm phương pháp tiêm thân, không có biểu triệu chứng Kiểm tra PCR với cặp mồi VNP194 For3/Rev3 cho phản ứng âm tính, khơng phải ký chủ phù hợp FbSLCV 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục lây nhiễm nhân tạo Agroinoculation với bệnh MYMV để đánh giá tính gây bệnh virus đậu xanh Tiếp tục lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn rầy xanh nhằm xác định vector tự nhiên virus Lây nhiễm nhân tạo dùng rệp đen nhằm xác định vector tự nhiên virus 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alabi O J., Lava Kumar P., Mgbechi-Ezeri J & Naidu R A (2010) Two new ‘legumoviruses’(genus Begomovirus) naturally infecting soybean in Nigeria Archives of virology 155(5): 643-656 Bashir M., Ahmad Z & Ghafoor A (2002) Cowpea aphid-borne mosaic potyvirus: a review International Journal of Pest Management 48(2): 155-168 Boulton G & Caban P (1995) Groundwater flow beneath ice sheets: part II—its impact on glacier tectonic structures and moraine formation Quaternary Science Reviews 14(6): 563-587 Brunt A., Crabtree K., Dallwitz M., Gibbs A & Watson L (1996) Viruses of plants Cabi (2007a) Bean golden mosaic virus CD Disk, Oxfrod, United Kingdom Cabi (2007b) Mungbean yellow mosaic virus CD Disk, Oxfrod, United Kingdom Cabi (2007c) Soybean crinkle virus CD Disk, Oxfrod, United Kingdom Cabi (2010b) Bean common mosaic virus Clark M F & Adams A J J o g v (1977) Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses 34(3): 475483 Cobley L S & Steele W M (1975) An Introduction to the Botany of Tropical Crops Longman, London.: 371 Edwardson J R & Christie R G (1986) Viruses infecting forage legumes Volume I Monograph-University of Florida Galvez G (1980) [Aphid-transmitted viruses [Phaseolus vulgaris]].[Spanish] Serie 09SB (CIAT) no Gibbs A J., Trueman J & Gibbs M J (2008) The bean common mosaic virus lineage of potyviruses: where did it arise and when? Archives of virology 153(12): 2177-2187 Gigante R (1951) Il mosaico del carciofo Bollettino della Stazione di Patologia Vegetale di Roma 177-181 Green S K & 15 T b n (1984) Guidelines for diagnostic work in plant virology (15) Asian Vegetable Research and Development Center trang trang Grimsley N., Hohn T., Davies J W & Hohn B (1987) Agrobacterium-mediated delivery of infectious maize streak virus into maize plants Nature 325(6100): 177-179 Ha C., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M & Dale J (2008) Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation Journal of General Virology 89(1): 312-326 93 Ha C V (2007) Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam, Queensland University of Technology, trang Hà V C 2012 Bài giảng Virus thực vật, phytoplasma viroid Đại học Nông nghiệp Hà Nội Hà Viết Cường (2010) Phát đặc trưng phân tử Kudzu mosaic virus gây bệnh khảm vàng đậu tương miền Bắc Tạp chí bảo vệ thực vật, số 5/2010 Hampton R (1975) The nature of bean yield reduction by bean yellow and bean common mosaic virus Phytopathology 65(12): 1342-1346 Hampton R O., Albrechtsen S & Mathur S (1992) Seed health (viruses) of Vigna unguiculata selections from developing countries Seed science and technology 20(1): 23-38 Hao N B., Albrechtsen S E & Nicolaisen M (2003) Detection and identification of the blackeye cowpea mosaic strain of Bean common mosaic virus in seeds of Vigna unguiculata sspp from North Vietnam Australasian Plant Pathology 32(4): 505-509 Hellens R P., Edwards E A., Leyland N R., Bean S & Mullineaux P M (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation Plant molecular biology 42(6): 819-832 Hull R (2013) Plant virology Academic press trang trang Hull R (2014) Plant virology Academic press trang trang Hussain M., Qazi J., Mansoor S., Iram S., Bashir M & Zafar Y (2004) First report of Mungbean yellow mosaic India virus on mungbean in Pakistan Plant Pathology 53(4): 518-518 Ictv (2013) Virus taxonomy: 2013 release Ivanov K I., Bašić M., Varjosalo M & Mäkinen K (2014) One-step purification of twinstrep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) JoVE (Journal of Visualized Experiments) (86): e51536 Karthikeyan A., Shobhana V., Sudha M., Raveendran M., Senthil N., Pandiyan M & Nagarajan P (2014) Mungbean yellow mosaic virus (MYMV): a threat to green gram (Vigna radiata) production in Asia International Journal of Pest Management 60(4): 314-324 Li K., Yang Q., Zhi H & Gai J (2010) Identification and distribution of soybean mosaic virus strains in southern China Plant Disease 94(3): 351-357 94 Lima J., Nascimento A., Radaelli P & Purcifull D J I h d o (2012) Serology applied to plant virology Serological diagnosis of certain human, animal and plant diseases Rijeka Croácia Maesen & Vander L J G (1996) Tài nguyên thực vật Đông Nam Á tập 1, Các đậu ăn hạt (Dương Đức Huyến dịch), NXB khoa học kỹ thuật Mandal B., Varma A & Malathi V (1997) Systemic infection of Vigna mungo using the cloned DNAs of the blackgram isolate of mungbean yellow mosaic geminivirus through agroinoculation and transmission of the progeny virus by whiteflies Journal of Phytopathology 145(11‐12): 505-510 Migliori A & Gourret J.-P (1987) Cytopathologie ultrastructurale du virus latent de l'artichaut chez Nicotiana benthamiana Agronomie 7(2): 87-94 Migliori A., Rana G., Piazzolla P., Gourret J & Rubino L (1988) Characterization of a new strain of broad bean wilt virus isolated from globe artichoke in France Mittal R., Fisher M., Mccallum R., Rochester D., Dent J & Sluss J (1990) Human lower esophageal sphincter pressure response to increased intra-abdominal pressure American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 258(4): G624G630 Mowat W & Dawson S J J o V M (1987) Detection and identification of plant viruses by ELISA using crude sap extracts and unfractionated antisera 15(3): 233-247 Pant V., Gupta D., Choudhury N R., Malathi V., Varma A & Mukherjee S (2001) Molecular characterization of the Rep protein of the blackgram isolate of Indian mungbean yellow mosaic virus Journal of General Virology 82(10): 2559-2567 Rachie K & Roberts L (1974) Grain legumes of the lowland tropics Advances in agronomy 26: 1-132 Rana G & Kyriakopoulou P (1981) Bean yellow mosaic virus in artichokes in Greece Proceedings of the Fifth Congress of the Mediterranean Phytopathological Union, Patras, Greece, 21-27 September 1980 Hellenic Phytopathological Society 38-40 Russo M & Rana G L (1978) Occurrence of two legume viruses in artichoke Phytopathologia Mediterranea 17(3): 212-216 Sinclair J (1982) Compendium of soybean diseases American Phytopathol Society 4: 2728 To J (1989) Effect of different strains of soybean mosaic virus on growth, maturity, yield, seed mottling and seed transmission in several soybean cultivars Journal of Phytopathology 126(3): 231-236 95 Tsai W., Shih S., Rauf A., Safitri R., Hidayati N., Huyen B & Kenyon L (2013) Genetic diversity of legume yellow mosaic begomoviruses in Indonesia and Vietnam Annals of applied biology 163(3): 367-377 Vaghchhipawala Z E & Mysore K S (2008) Agroinoculation: a simple procedure for systemic infection of plants with viruses Trong: Plant Virology Protocols Springer: 555-562 trang Wang H., Qi M & Cutler A J (1993) A simple method of preparing plant samples for PCR Nucleic acids research 21(17): 4153 Worrall E A., Wamonje F O., Mukeshimana G., Harvey J J., Carr J P & Mitter N (2015) Bean common mosaic virus and Bean common mosaic necrosis virus: relationships, biology, and prospects for control Advances in Virus Research 93: 1-46 96