Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (sugarcane mosaic virus scmv) tại vùng chương mỹ, đan phượng (hà nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  TRẦN THỊ THANH BÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS KHẢM LÙN NGƠ (SUGARCANE MOSAIC VIRUS - SCMV) TẠI VÙNG CHƯƠNG MỸ, ðAN PHƯỢNG (HÀ NỘI) VÀ SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ðOÁN BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số : 62.62.10.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS VŨ TRIỆU MÂN Hà Nội, 2012 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Kết nghiên cứu luận án kết lao động tác giả Các số liệu kết trình bày luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam ñoan giúp ñỡ cho việc thực luận án ñã ñược cảm ơn thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Tác giả luận án Trần Thị Thanh Bình Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… i LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành đề tài luận án tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình quan, thầy cơ, bạn bè người thân Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy GS.TS Vũ Triệu Mân ñã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn TS Hà Viết Cường, ThS Trần Thị Như Hoa, Trung tâm Bệnh nhiệt đới - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội cán Trung tâm ñã hướng dẫn, hỗ trợ phương tiện kỹ thuật, tạo ñiều kiện thuận lợi q trình thực thí nghiệm Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới TS Trần Nguyễn Hà, PGS.TS Ngơ Bích Hảo thầy cô giáo Bộ môn Bệnh Khoa Nông học đóng góp nhiều ý kiến q báu để luận án hồn thiện Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn đến thầy Ban giám hiệu, Viện ðào tạo Sau ñại học ñã tận tình giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục bảo vệ luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện nghiên cứu ngơ, TS Lê Văn Hải, KS Nguyễn Văn Vượng cán nhân viên môn Hệ thống canh tác môn Bảo vệ thực vật Viện Nghiên cứu ngơ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực thí nghiệm ñồng ruộng suốt thời gian thực ñề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, NGUT.TS Phạm Thanh Hải – Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Nơng nghiệp PTNT Bắc Bộ, đồng nghiệp, tất người thân, bạn bè người bên cạnh động viên giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận án Trần Thị Thanh Bình Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH xi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xiv MỞ ðẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích u cầu 2.1 Mục đích 2.2 Yêu cầu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Những ñóng góp ñề tài ðối tượng phạm vi nghiên cứu 5.1 ðối tượng nghiên cứu 5.2 Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học ñề tài 1.2 Những nghiên cứu nước 1.2.1 Tình hình sản xuất ngơ giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô giới 1.2.3 Giới thiệu chung chi Potyvirus 24 1.2.4 Phương pháp hiển vi ñiện tử 27 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… iii 1.2.5 Phương pháp kháng huyết 27 1.2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 31 1.2.7 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 31 1.3 Những nghiên cứu nước 32 1.3.1 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam 32 1.3.2 Những nghiên cứu bệnh virus hại ngô Việt Nam 34 1.3.3 Phân loại SCMV Việt Nam 37 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.1.1 Mẫu giống ngô, thí nghiệm trùng mơi giới 39 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hoá chất nghiên cứu 40 2.2 Thời gian ñịa ñiểm nghiên cứu 40 2.2.1 Thời gian 40 2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 41 2.3 Nội dung nghiên cứu 41 2.4 Phương pháp nghiên cứu 41 2.4.1 Phương pháp hiển vi ñiện tử 41 2.4.2 Phương pháp kháng huyết 41 2.4.3 Phương pháp xác ñịnh virus RT-PCR 43 2.4.4 Phương pháp làm tinh khiết virus SCMV 45 2.4.5 Phương pháp điều tra ngồi đồng 48 2.4.6 Phương pháp xác ñịnh lan truyền virus khảm lùn ngô (SCMV) tiếp xúc học 49 2.4.7 Phương pháp xác ñịnh lan truyền virus khảm ngô (SCMV) côn trùng môi giới 51 2.4.8 Phương pháp ñánh giá ảnh hưởng virus khảm lùn ngơ (SCMV) đến số tiêu sinh trưởng phát triển ngô 52 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… iv 2.4.9 Phương pháp sản xuất thử nghiệm kháng huyết virus SCMV 53 2.4.10 Phương pháp tính xử lý số liệu 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô 56 3.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh virus khảm lùn ngô 56 3.1.2 Phương pháp hiển vi ñiện tử 60 3.1.3 Kiểm tra số loại virus gây hại ngơ ngồi đồng vùng khác nhau, vụ xuân 2009 - 2010 phương pháp ELISA gián tiếp 63 3.1.4 Kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) vụ xuân 2010 - 2011 phương pháp RT- PCR 65 3.2 Kết nghiên cứu ñặc ñiểm lan truyền virus SCMV 66 3.2.1 Khả lan truyền virus SCMV phương pháp tiếp xúc học 66 3.2.2 Khả lan truyền virus SCMV côn trùng môi giới (rệp cờ ngô Rhopalosiphum maidis) 68 3.2.3 Khả lan truyền virus SCMV qua tiếp xúc học từ nguồn hạt nhiễm bệnh 70 3.3 ðiều tra bệnh virus khảm lùn ngơ ngồi đồng ðan Phượng Chương Mỹ (Hà Nội) 73 3.3.1 ðiều tra bệnh khảm lùn ngơ ngồi đồng 73 3.3.2 Ảnh hưởng bệnh ñến tiêu sinh trưởng suất ngô 95 3.3.3 Ảnh hưởng bệnh virus tới hàm lượng diệp lục thành phần hố sinh hạt ngơ 100 3.3.4 Ảnh hưởng bệnh ñến yếu tố cấu thành suất ngô .101 3.4 Thử nghiệm tạo kháng huyết ñặc hiệu virus SCMV 105 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… v 3.4.1 Giới thiệu 105 3.4.2 Tinh chiết virus .106 3.4.3 Kiểm tra có mặt kháng thể SCMV thể thỏ thí nghiệm sau tuần tiêm 108 3.4.4 Thực ñiều kiện phản ứng với kháng huyết virus SCMV ñã tạo ñược 111 3.4.5 Kiểm tra có mặt virus SCMV gây hại phận ngô thu thập vụ xuân 2011 phương pháp ELISA 119 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 126 4.1 Kết luận 126 4.2 ðề nghị 127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ðà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC 138 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số TT Tên ñề mục Trang 1.1 Diện tích, suất, sản lượng ngơ giới từ năm 1961-2010 1.2 Phân loại họ Potyviridae (Berger et al 2005) 25 1.3 Diện tích, suất, sản lượng ngơ Việt Nam từ năm 1961 - 2010 33 3.1 Kết kiểm tra virus SCMV gây hại ngô ký chủ ngồi đồng, vụ xn 2009 - 2010 phương pháp ELISA gián tiếp 64 3.2 Kết kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) phương pháp RT-PCR 65 3.3 Kết lây nhiễm virus SCMV lên thị, trồng cỏ dại phương pháp tiếp xúc học 67 3.4 Kết xác ñịnh khả lan truyền virus SCMV qua rệp cờ ngô Rhopalosiphum maidis 69 3.5 Kết xác ñịnh khả lan truyền virus SCMV phương pháp tiếp xúc học từ nguồn hạt nhiễm bệnh 70 3.6 Tình hình bệnh virus SCMV hại ngô giống ngô LVN – xã Thủy Xuân Tiên – Chương Mỹ - Hà Nội vụ xuân năm 2007 ñến 2010 74 3.7 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô giống ngô LVN – xã ðồng Tháp - ðan Phượng - Hà Nội vụ xuân năm 2007 ñến 2010 76 3.8 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô giống trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2007) 78 3.9 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô giống trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2008) 80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… vii 3.10 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô giống trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2009) 82 3.11 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô giống trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2010) 84 3.12 Tình hình bệnh khảm lùn ngơ SCMV hại ngơ giống trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2007) 86 3.13 Tình hình bệnh khảm lùn ngô giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2008 88 3.14 Tình hình bệnh virus hại ngơ giống trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2009) 90 3.15 Tình hình bệnh khảm lùn ngô SCMV hại ngô giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2010 92 3.16 Tình hình bị rệp tỷ lệ bệnh virus Chương Mỹ ðan Phượng (Hà Nội) vụ xuân 2008 94 3.17 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngơ (SCMV) đến khả sinh trưởng giống ngô LVN 10 96 3.18 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngô (SCMV) ñến khả sinh trưởng giống ngô LVN 14 97 3.19 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngơ (SCMV) đến khả sinh trưởng giống ngô LVN 99 98 3.20 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngơ (SCMV) đến khả sinh trưởng giống ngô KK 159 99 3.21 Ảnh hưởng bệnh khảm ngô (SCMV) tới hàm lượng diệp lục thành phần hố sinh hạt ngơ LVN 10 100 3.22 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngô SCMV tới tiêu cấu thành suất giống ngô LVN 10 102 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… viii 3.23 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngô SCMV tới tiêu cấu thành suất giống ngô LVN 14 103 3.24 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngô SCMV tới tiêu cấu thành suất giống ngô LVN 99 104 3.25 Ảnh hưởng bệnh khảm lùn ngô SCMV tới tiêu cấu thành suất giống ngô KK 159 105 3.26 Kiểm tra ELISA hàm lượng virus SCMV sản phẩm thu ñược trình tinh chiết virus (Tại phịng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu Bệnh Nhiệt đới – Trường ðH Nơng nghiệp Hà Nội) 107 3.27 Kiểm tra có mặt kháng thể SCMV thể thỏ thí nghiệm sau tuần tiêm khu thí nghiệm nhà lưới Trung tâm nghiên cứu Bệnh nhiệt ñới 109 3.28 Kết xác ñịnh ngưỡng pha loãng dịch với kháng huyết virus SCMV phịng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu bệnh Nhiệt ñới 111 3.29 Kết xác ñịnh ngưỡng pha loãng kháng huyết virus SCMV 114 3.30 Kết thử nghiệm dùng dịch khoẻ hấp phụ chéo không dùng dịch khoẻ hấp phụ chéo 115 3.31 Kết thử nghiệm dùng dịch khoẻ hấp phụ chéo có ly tâm dùng dịch khoẻ hấp phụ chéo không ly tâm 117 3.32 Kết thử nghiệm dùng mẫu tươi, mẫu khô với kháng huyết virus SCMV 118 3.33 Kiểm tra nồng ñộ virus SCMV phận ngô non 3-4 119 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… ix ... suất sản lượng ngơ Xuất phát từ tình hình trên, thực ñề tài: ? ?Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus SCMV), vùng Chương Mỹ, ðan Phượng (Hà Nội) sản xuất kháng huyết chẩn đốn bệnh? ??... virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV) ðối tượng phạm vi nghiên cứu 5.1 ðối tượng nghiên cứu - Bệnh virus khảm lùn ngô vùng Chương Mỹ ðan Phượng (Hà Nội) 5.2 Phạm vi nghiên cứu - ðề... giống ngô bệnh, kháng bệnh virus khảm lùn ngô gây Những ñóng góp ñề tài Bổ sung thêm kết nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngơ Việt Nam Lần sản xuất kháng huyết chẩn đốn nhanh bệnh virus khảm