Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của vật liệu nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp hóa học với chất khử glucose

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC ĐƯỢC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC VỚI CHẤT KHỬ GLUCOSE” Hà Nội – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC ĐƯỢC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC VỚI CHẤT KHỬ GLUCOSE” Người thực : Nguyễn Văn Bình Lớp : KHMTA Khóa : 63 Ngành : Khoa học Môi Trường Giáo viên hướng dẫn : ThS Hồ Thị Thúy Hằng Hà Nội – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu thực khóa luận tốt nghiệp ngồi cố gắng nỗ lực thân mình, em cịn nhận nhiều giúp đỡ thầy cô giáo, gia đình bạn bè Nhân dịp em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc Đề tài khóa luận em thực với giúp đỡ tạo điều kiện Bộ môn Công nghệ Môi trường – Khoa Tài nguyên Môi trường Khoa Thủy sản, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới cô ThS Hồ Thị Thúy Hằng người tận tình bảo, truyền đạt cho em nhiều kiến thức, kỹ làm việc, giúp đỡ em học tập, nghiên cứu theo sát em suốt q trình thực khóa luận Và đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn tới Thầy Cô giáo bạn kỹ thuật phịng thí nghiệm Môi trường bệnh học Thủy sản – khoa Thủy sản, tận tình giúp đỡ hướng dẫn em suốt q trình làm thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ mình, tồn thể bạn bè người ln bên em suốt thời gian học tập rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, ngày … tháng … năm 20… Người thực Nguyễn Văn Bình i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nano bạc phương pháp tổng hợp 1.1.2 Đặc điểm tính chất hạt nano bạc 1.1.3 Các phương pháp tổng hợp nano bạc 1.2 Một số nghiên cứu ứng dụng nano bạc 17 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Phạm vi nghiên cứu 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu nano bạc phương pháp khử hóa học dung dịch nước với chất khử glucose 24 2.4.2 Phương pháp đánh giá hiệu kháng khuẩn vật liệu nano bạc tạo thành 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 ii 3.1 Đặc tính dung dịch nano bạc tạo thành từ trình tổng hợp hóa học với chất khử glucose 29 3.2 Đánh giá hiệu kháng khuẩn dung dịch nano bạc tổng hợp phương pháp hóa học với chất khử glucose 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận 42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp quan trọng để ổn định tổng hợp nano bạc 12 Bảng 1.2 Chế tạo nano kim loại bạc vàng vi sinh vật đặc thù 15 Bảng 1.3 Dịch chiết số loài thực vật sử dụng điều chế nano kim loại 16 Bảng 1.4 Vật liệu nano bạc ứng dụng loại bỏ vi khuẩn nước 22 Bảng 2.1 Các công thức tổng hợp AgNPs 25 Bảng 3.1 Kiểm tra khả diệt khuẩn nano bạc 33 Bảng 3.2 Bán kính vòng kháng khuẩn nano bạc 36 Bảng 3.3 Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc nồng độ khác 39 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ảnh hưởng pH đến hình dạng hạt nano bạc tạo thành với chất khử Natri citrat Hình 1.2 Ảnh TEM AgNPs tổng hợp pH 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 10,5 cách sử dụng ascorbate làm chất khử Hình 1.3 Ảnh TEM nano bạc với hình dạng (A) hạt cầu, hình (B) nanoprisms, (C) nano (D) dây nano, (E) ống nano, (F) kim tự tháp, (G) nanorice (H) nanoflowers Hình 1.4 Hiệu xúc tác cho trình xử lý khí thải AgNPs Hình 1.5 Ion bạc vơ hiệu gốc SH chuyển hố O enzyme vi khuẩn Hình 1.6 Cơ chế tương tác Ag+ từ AgNPs lên tế bào vi khuẩn Hình 1.7 Ion bạc liên kết với bazơ DNA – vi khuẩn Hình 1.8 Sự hình thành nano bạc dung dịch 11 Hình 1.9 Số lượng ấn phẩm nghiên cứu ứng dụng nano Bạc năm 2011 – 2021 18 Hình 2.1 Chế phẩm nano bạc diệt khuẩn công ty TNHH trung tâm chế phẩm sinh học 28 Hình 3.1 Hình ảnh mẫu dung dịch bạc tạo thành nồng độ chất khử glucose khác 29 Hình 3.2 Phổ UV – Vis dung dịch nano bạc tổng hợp nồng độ chất khử glucose khác 30 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Glucose tới độ hấp phụ dung dịch nano bạc tạo thành 30 Hình 3.4 Hình thái cấu trúc hạt nano bạc dung dịch tổng hợp 31 Hình 3.5 Phân bố kích thước hạt dung dịch nano bạc tạo thành 31 Hình 3.6 Mẫu XRD hạt nano bạc tạo thành 32 v Hình 3.7a Hình ảnh mẫu đối chứng khả diệt khuẩn nano bạc với E.Coli 34 Hình 3.7b Hình ảnh mẫu thí nghiệm khả diệt khuẩn nano bạc với E.Coli 34 Hình 3.7c Hình ảnh mẫu đối chứng khả diệt khuẩn nano bạc với Salmonella 35 Hình 3.7d Hình ảnh mẫu thí nghiệm khả diệt khuẩn nano bạc với Salmonella 35 Hình 3.8 Sự hình thành vịng kháng khuẩn nano bạc với E.coli 37 Hình 3.9 Sự hình thành vịng kháng khuẩn nano bạc với Salmonella 37 Hình 3.10 Sự hình thành vịng kháng khuẩn nano bạc với S aureus 38 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AgNPs Các hạt nano bạc MIC Nồng độ ức chế tối thiểu MBC Nồng độ gây chết tối thiểu SEM Scanning Electron Microscope TEM Tunnelling Electron Microscope UV-Vis UV-Vis spectroscopy vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nghiên cứu tổng hợp dung dịch nano bạc với chất khử glucose thân thiện với môi trường Tỷ lệ chất khử glucose 5% khối lượng, tiền chất AgNO /NaAgl, gia nhiệt 80oC liên tục 10h điều điện tối ưu tạo dung dịch nano bạc với hạt có dạng hình cầu, kích thước trung bình 12-15 nm, phân bố đồng dung dịch Dung dịch nano bạc tổng hợp có khả ức chế vi phát triển vi khuẩn nồng độ thấp Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) nano bạc tổng hợp E coli, Salmonella typhimurium S aureus 0,156 µg/mL, 3,125 µg/mL 6,25 µg/mL Hiệu diệt khuẩn tương đương với với nhiều sản phẩm tổng hợp với chất khử hóa học mạnh khác tiền đề cho phát triển phương pháp tổng hợp xanh nano bạc từ hợp chất thân thiện độc hại với mơi trường viii KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu tổng hợp dung dịch nano bạc với chất khử glucose thân thiện với môi trường Với tỷ lệ chất khử 5% khối lượng, gia nhiệt 80oC liên tục 10h tạo dung dịch nano bạc với hạt có dạng hình cầu, kích thước trung bình 12-15 nm, phân bố đồng dung dịch Kết khảo sát khả diệt khuẩn gây hại môi trường nuôi cá cho thấy, dung dịch nano bạc tổng hợp có khả ức chế phát triển vi khuẩn nồng độ thấp Kích thước vịng kháng khuẩn dao động từ 6,5 -10,2 mm E.Coli, 4,6-8,8 mm Salmonella typhimurium 3,5 – 6,6 mm S aureus khoảng nồng độ thử nghiệm từ – 40 µg/mL Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) nano bạc tổng hợp với chất khử glucose E coli, Salmonella typhimurium S aureus 0,156 µg/mL, 3,125 µg/mL 6,25 µg/mL Hiệu diệt khuẩn dung dịch nano bạc tổng hợp chất khử glucose tương đương với nhiều sản phẩm tổng hợp với chất khử hóa học mạnh khác tiền đề cho phát triển phương pháp tổng hợp xanh nano bạc từ hợp chất thân thiện độc hại với môi trường Kiến nghị Nghiên cứu cần tiếp tục thực khảo sát khả kháng khuẩn mơi trường thực tế tính bền vật liệu nano bạc môi trường nước ứng dụng thực tế để kiểm soát dịch bệnh 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Mai Ngọc Tuấn Anh, Trần Thị Lệ Khanh & Nguyễn Thị Phương Phong, (2017), Tổng hợp khảo sát khả kháng khuẩn vật liệu nano bạc dạng phiến chế tạp phương pháp khử trực tiếp, Tạp chí hóa học, số 55(3e12), 70-74 Trần Thị Ngọc Dung, Lê Tự Hải, Nguyễn Đức Hùng (2019), Nano bạc điều chế, đạc tính ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên & công nghệ Trần Thị Ngọc Dung, Nguyễn Mạnh Tưởng & Nguyễn Thị Thủy Linh (2015), Nghiên cứu tạo xốp cho mảng gốm lọc nước phủ nano bạc, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, T 53(6A), 237–244 Nguyễn Đức Hùng, “Vật liệu nano từ công nghệ chế tạo đến khả ứng dụng”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học & Công nghệ QS, T 10(3), 121-131, 2005 Đỗ Thị Huế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trần Khắc Khôi (2020), Tổng hợp hạt nano bạc với hình dạng cấu trúc khác nhau, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Đại học Thái Ngun, số 225(16), 106-112 Nguyễn Thế Hữu, Trần Quang Hải, Nguyễn Văn Mạnh, Nguyễn Đức Hải & Vũ Tiến Việt (2018), Nghiên cứu tổng hợp dung dịch hạt nano bạc sử dụng tác nhân khử đường glucozo NaBH4, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, số 45, 82-85 Trịnh Đình Khá, Lý A Hù, Đặng Duy Phong, Nguyễn Hữu Quyền, Hoàng THị Thiên Hương (2017), Tổng hợp nano bạc dịch chiết đào Prunus persica hoạt tính kháng khuẩn nó, Tạp chí Khoa học công nghệ Đại học Thái nguyên, 164 (04), 153-156 Võ Thị Quý Vĩnh & Lê Quốc Chơn (2019), Nghiên cứu tổng quan nano bạc: Từ tổng hợp đến ứng dụng, NXB Đại học Duy Tân,01(32), 30-39 43 Tài liệu tiếng Anh Alagumuthu, G and Kirubha, R., (2012), Synthesis and Characterisation of Silver Nanoparticles in Different Medium, Open Journal of Synthesis Theory and Applications 1(2): 13-17 Agnihotri, S., Mukherji, S and Mukherji, S., (2014), Size-controlled silver nanoparticles synthesized over the range 5–100 nm using the same protocol and their antibacterial efficacy, Advances, 4(8): 3974-3983 Ameen, F., Srinivasan, P., Selvankumar T et al., (2019) Phytosynthesis of silver nanoparticles using Mangifera indica flower extract as bioreductant and its broad-spectrum antibacterial activity, Bioorganic Chemistry, 88: 102970102971 Behravan, M., Panahi, A H., Naghizadeh, A., Ziaee, M., Mahdavi R and Mirzapour, A., (2019) Facile green synthesis of silver nanoparticles using Berberis vulgaris leaf and root aqueous extract and its antibacterial activity International Journal of Biological Macromolecules, 124:148-154 Chen, D., Qiao, X and Chen, J., 2011 Morphology- controlled synthesis of silver nanostructures via a solvothermal method Journal of Materials Science: Materials in Electronics 22: 1335-1339 Choi, O and Hu, Z., (2008), Size Dependent and Reactive Oxygen Species Related Nanosilver Toxicity to Nitrifying Bacteria Environmental Science & Technology 42(12): 4583-4588 Fievet, F., Ammar-Merah, S., Brayner, R et al., (2018) The polyol process: a unique method for easy access to metal nanoparticles with tailored sizes, shapes and compositions Chemical Society Reviews 47: 5187-5233 Khodashenas, B and Ghorbani, H R., (2019), Synthesis of silver nanoparticles with different shapes, Arabian Journal of Chemistry, 12(8): 1823-1838 Kim, D., Jeong, S and Moon, J., 2006 Synthesis of silver nanoparticles using the polyol process and the influence of precursor injection, 44 Nanotechnology 17: 4019-4024 10.Helmlinger, J., Sengstock, C., Groß-Heitfeld C et al., 2016 Silver nanoparticles with different size and shape: equal cytotoxicity, but different antibacterial effects Advances 6: 18490-18501 11.Yang Y S and Chen, Y B., (2009) Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli, Appl Microbiol Biotechnol 85: 1115-1122 12 Meléndrez, M.F., Medina, C., Solis-Pomar, F., Flores, P., Paulraj, M and PérezTijerina, E., (2015) Quality and high yield synthesis of Ag nanowires by microwave-assisted hydrothermal method Nanoscale Research Letters 10: 48-57 13.Pal, S., Tak, Y K and Song, J M., 2007 Does the Antibacterial Activity of Silver Nanoparticles Depend on the Shape of the Nanoparticle? A Study of the Gram-Negative Bacterium Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology 73(6): 1712-1720 14.Qing, Y., Cheng, L., Li R et al., 2018, Potential antibacterial mechanism of silver nanoparticles and the optimization of orthopedic implants by advanced modification technologies, International journal of nanomedicine 13: 3311-3327 15.Raza, M.A., Kanwal, Z., Rauf, A., Sabri, A.N., Riaz, S and Naseem, S., 2016, Size- and Shape- Dependent Antibacterial Studies of Silver Nanoparticles Synthesized by Wet Chemical Routes, Nanomaterials, 6(4): 7489 16.Zhao, T., Sun, R., Yua, S et al., 2010 Size- controlled preparation of silver nanoparticles by a modified polyol method, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 23(366), 197– 202 45 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN & MÔI TRƯỜNG - - ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC ĐƯỢC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC VỚI CHẤT KHỬ GLUCOSE” Người thực : NGUYỄN VĂN BÌNH Lớp : KHMTA Khóa : 63 Ngành : KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG Giáo viên hướng dẫn : ThS HỒ THỊ THÚY HẰNG Hà Nội - 2022 46 ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: NGUYỄN VĂN BÌNH Mã sinh viên: 639706 Tel: 0333663997 Mail: vanbinh9099@gmail.com Chuyên ngành: Khoa học mơi trường Lớp: KHMTA Khố: 63 Giáo viên hướng dẫn: ThS HỒ THỊ THÚY HẰNG Tel: 0985643819 Mail: htthanghp@gmail.com Tên đề tài: “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC ĐƯỢC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC VỚI CHẤT KHỬ GLUCOSE” Loại đề tài: Đề tài điều tra Đề tài khoa học thực nghiệm Địa điểm thực hiện: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, ngày … tháng … năm……… Sinh viên thực Giảng viên hướng dẫn Xác nhận Bộ mơn Nguyễn Văn Bình ThS Hồ Thị Thúy Hằng ThS Nguyễn Ngọc Tú 47 PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Các hạt nano kim loại thu hút ý nhiều thập kỷ qua tính chất vật lý hóa học đặc biệt ứng dụng tiềm chúng Trong số hạt nano kim loại, nano bạc quan tâm chúng có nhiều ứng dụng làm vật liệu xúc tác, chất kháng khuẩn, lớp phủ dẫn điện cảm biến, đặc biệt nhờ vào đặc tính kháng khuẩn ưu việt, hạt nano bạc ngày nghiên cứu ứng dụng rộng rãi y tế, nông – lâm – thủy sản xử lý môi trường Nhiều phương pháp phát triển để tổng hợp hạt nano phương pháp mixen đảo, phương pháp khử hóa học, phương pháp điện hóa, phương pháp bay – ngưng tụ (evaporationcondensation), phương pháp laser (laser ablation), vi sóng, khử quang hóa sử dụng vi khuẩn, nấm để tổng hợp hạt nano bạc Trong số phương pháp này, phương pháp khử hóa học dung dịch nước sử dụng sớm rộng rãi tính đơn giản, chi phí thấp dễ dàng kiểm sốt kích thước hình dạng hạt nano bạc Natri borohydride (NaBH ), natri citrate, hydrazine hydrate, anilin dimethylformamide thường sử dụng chất khử trình tổng hợp nano bạc Ưu điểm chất khử mạnh có khuynh hướng tạo hạt nano nhỏ đồng Tuy nhiên, chất khử gây bất lợi cho mơi trường, ảnh hưởng tới khả ứng dụng sản phẩm lĩnh vực môi trường y sinh nông – lâm – thủy sản Chính vậy, ngày có nhu cầu phát triển phương pháp thân thiện với môi trường để tổng hợp hạt nano bạc, q trình khơng liên quan đến hóa chất độc hại Phương pháp tổng hợp xanh sử dụng vi sinh vật nguồn tự nhiên lên giải pháp thay thân thiện với môi trường đơn giản hiệu chi phí cho quy trình tổng hợp hóa học Việc sử dụng nguồn tự nhiên để tổng hợp hạt nano bạc thuận lợi khơng có 48 mối nguy sinh học Các hạt nano bạc tổng hợp nhiều nguồn tự nhiên khác polysaccharide, maltose, chitosan,… dịch chiết xuất thực vật Khan cộng (2013) tổng hợp xanh hạt nano bạc sử dụng tinh bột làm chất ổn định tính tương thích sinh học tốt khả phân hủy sinh học Venkatpurwar cộng (2011) tổng hợp xanh hạt nano bạc sử dụng polysaccharide sulfat hóa làm chất ổn định Tại Việt Nam, số dịch chiết thực vật sử dụng cho tổng hợp nano kim loại bạc bước đầu thu thực dịch chiết nước sầu đâu, húng quế, rau mùi, nha đam, sả,lá chè xanh,….Tuy nhiên, hạn chế lớn từ dịch chiết thực vật tính khơng ổn định sản phẩm tạo thành, độ tinh khiết không cao thời gian tổng hợp dài so với sử dụng tác nhân hóa học Oluwafemi cộng (2013) 42 để thực trình tổng hợp xanh hạt nano bạc sử dụng gelatin làm chất ổn định maltose làm chất khử điều kiện không sử dụng chất xúc tác Do đó, mong muốn kỹ thuật dễ khả thi để tổng hợp hạt nano bạc để vừa đảm bảo thân thiện với môi trường, vừa đảm bảo thời gian ngắn độ tinh khiết cao hơn, thời gian gần nhà khoa học quan tâm nhiều đến việc sử dụng chất khử thân thiện với môi trường glucose, acid acrobic, amino axit polymer tự nhiên Xuất phát từ thực tiễn trên, thực nghiên cứu “Đánh giá hiệu kháng khuẩn vật liệu nano bạc tổng hợp phương pháp hóa học với chất khử glucose” Mục tiêu nghiên cứu - Chế tạo đánh giá đặc tính vật liệu nano bạc tổng hợp phương pháp hóa học với chất khử glucose; - Đánh giá hiệu kháng khuẩn vật liệu nano bạc tổng hợpbằng phương pháp hóa học với chất khử glucose 49 PHẦN NỘI DUNG THỰC HIỆN Chương Tổng quan nghiên cứu 1.1 Tổng quan nano bạc phương pháp tổng hợp 1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc hạt nano bạc 1.1.2 Đặc điểm tính chất hạt nano bạc 1.1.3 Các phương pháp tổng hợp nano bạc 1.2 Một số nghiên cứu ứng dụng nano bạc 1.2.1 Ứng dụng diệt khuẩn 1.2.2 Ứng dụng làm chất xúc tác 1.2.3 Ứng dụng xử lý môi trường 1.2.4 Ứng dụng kiểm soát dịch bệnh 50 Chương Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Vật liệu nano bạc dạng dung dịch - Vi khuẩn Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028) Staphylococcus aureus (ATCC 25923) 2.2 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi không gian: Vật liệu nano bạc tổng hợp phịng thí nghiệm vật liệu, Viện Khoa học vật liệu, viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam; Các vi khuẩn thí nghiệm đặc tính kháng khuẩn nano bạc với vi khuẩn đánh giá Phịng thí nghiệm Mơi trường bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản - Phạm vi thời gian: 3/2022 – 8/2022 2.3 Nội dung nghiên cứu - Chế tạo đánh giá đặc tính dung dịch nano bạc tổng hợp phương pháp hóa học với chất khử glucose - Đánh giá hiệu kháng khuẩn dung dịch nano bạc tổng hợp phương pháp hóa học với chất khử glucose 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu nano bạc phương pháp khử hóa học dung dịch nước với chất khử glucose *) Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm Vật liệu nano bạc điều chế phương pháp khử hóa học dung dịch nước với - Tiền chất : AgNO - Chất khử : Glucose - Chất ổn định : Natri alginate - Nước cất hai lần Dụng cụ thí nghiệm : 51 - Máy khuấy IKA RW 20 digital (IKA - Đức); - Máy ly tâm Universal 32R D- 78523 (Germany); - Tủ sấy chân không Vacucell MMM Madcenter Einrich (Germany); - Cân phân tích Precisa số lẻ, - Và dụng cụ thủy tinh khác Tất dụng cụ thủy tinh dùng thí nghiệm làm dung dịch HNO3 / HCl (3: 1, tỷ lệ thể tích), rửa kỹ nước cất hai lần làm khơ trước sử dụng *) Tiến hành thí nghiệm + Cân xác g Natri alginat, thêm vào 50 mL nước cất bình khuấy gia nhiệt dung dịch 50 ° C đến thu dung dịch + Thêm 10 mL dung dịch AgNO (0,005 mol /L) vào dung dịch natri alginat khuấy liên tục để thu dung dịch Ag + / NaAlg + Sau thêm 40 mL dung dịch glucose có nồng độ thay đổi từ 0,5%, 1,25%, 2,5%, 5% 10% trọng lượng, khuấy liên tục, trì 80 ° C để phản ứng 10 Bảng 2.1 Các công thức tổng hợp AgNPs CT CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 % KL 0,5 1,25 2,5 10 glucose Mẫu dung dịch thu sau thí nghiệm mang xác định đặc tính nano bạc kỹ thuật đo hiểu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt hạt nano Ag (UV-Vis) xác định hình thái kích thước hình dáng hạt nano tạo thành (SEM) 2.4.2 Phương pháp đánh giá hiệu kháng khuẩn vật liệu nano bạc tạo thành - Vật liệu : Vi khuẩn Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028) Staphylococcus aureus (ATCC 25923)  Dung dịch nano có đặc tính tốt tổng hợp từ Thí nghiệm 52  Mơi trường Brain heart broth (BHB): môi trường tăng sinh vi khuẩn  Môi trường Nutrient Agar (NA): môi trường cấy đếm số lượng khuẩn lạc  Nước cất vô trùng  Ống Eppendorf 1.5ml, ống Falcon 15ml  Pipet 100µl, 1000 µl, 10ml  Đầu Tuýp 100µl, 1000 µl, 10ml  Đĩa lồng, que cấy láng, đèn Gas, cồn 70°  Găng tay, trang - Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm : Hút 100µl canh khuẩn gốc + ml Môi trường BHB Votex đều, nuôi cấy Sau nuôi cấy giờ, đem li tâm 5000 rpm/5 phút Bỏ dịch nổi, thu lấy cặn Sau hồn ngun nước cất vơ trùng - Tiến hành thí nghiệm 2: Bước 1: Chuẩn bị ống eppendorft 1,5ml + Ống ký hiệu 100 dãy: Hút vào ống 500µl canh khuẩn vi khuẩn E coli chuẩn bị, votex + Ống ký hiệu 10-1 đến 10-8 Tiến hành pha loãng ống theo số 10 từ nồng độ 10-1 đến 10-8 nước cất vô trùng Riêng ống 10-8 sau pha loãng xong tiến hành hút bỏ 50µl - Bước 2: + Dãy thí nghiệm Nano: Bổ sung thêm hợp chất Nano bạc theo tỷ lệ 1:1 Để yên nhiệt độ phòng 30 phút, 10 phút lắc nhẹ lần Tiến hành hút 100µl nồng độ pha lỗng 100 đến 10-8 cấy láng nồng độ/1 đĩa NA + Dãy đối chứng: Hút 100µl nồng độ pha lỗng 10-3 đến 10-8 cấy láng nồng độ/1 đĩa NA Nuôi cấy 24 giờ/37°C tủ ấm đếm số lượng khuẩn lạc đĩa thạch 53 Xác định số lượng vi khuẩn cách áp dụng công thức sau: N = ∑C V (n1 + 0,1n2 )d Trong đó: N: Tổng số vi khuẩn (CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn độ pha lỗng liên tiếp V: thể tích mẫu cấy đĩa (ml) n : số đĩa độ pha loãng thứ chọn để đếm số khuẩn lạc n : số đĩa độ pha loãng thứ hai chọn để đếm số khuẩn lạc d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha lỗng thứ Thí nghiệm : Xác định hoạt tính kháng khuẩn nano bạc phương pháp khuếch tán qua thạch nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) - Hoạt tính kháng khuẩn nano bạc phương pháp khuếch tán qua thạch xác định thông qua kích thước vịng kháng khuẩn hình thành : Thí nghiệm tiến hành sau : Bước : Dịch vi khuẩn thử nghiệm (nồng độ 106 cfu/mL) trải môi trường MHA Bước : Trên đĩa thạch mơi trường chun tính cho loại vi khuẩn hút 100 µL mẫu dung dịch nano bạc nồng độ ppm ; ppm, 16 ppm, 40 ppm cho vào giếng giếng đối chứng với 100 µL nước cất vơ trùng (4 giếng/đĩa) Bước : Ủ đĩa 37oC, sau 24 Bước : Ghi nhận kết vòng kháng khuẩn đĩa - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Hiệu ức chế vi khuẩn nano bạc kiểm tra phương pháp MIC.MIC xác định mơi trường LB sử dụng pha lỗng bậc 54 AgNPs với nồng độ từ 200µg/ml đến 0,195µg/ml với nồng độ vi khuẩn điều chỉnh máy đo quang phổ (BioSpectrometer basic, Eppendorf) bước sóng 625 nm 0,1 (1x108 CFU/ml; tiêu chuẩn 0,5 McFarland) Dung dịch nano bạc theo nồng độ tương ứng môi trường canh LB với nồng độ vi khuẩn cuối đạt 5x105 CFU/ml; đối chứng thay dung dịch nano bạc nước muối sinh lý thời gian nhiệt độ ủ 370C MIC nồng độ thấp nano bạc ức chế phát triển vi sinh vật 99% MIC ghi nhận độ đục ống trước sau ủ với vi khuẩn.Sau xác định MIC AgNPs, 100 μl mẫu không cho thấy phát triển vi khuẩn cấy trải vào đĩa thạch tương ứng loài vi khuẩn, ủ 24 37ºC Chương Dự kiến kết nghiên cứu 3.1 Đặc điểm dung dịch nano bạc tổng hợp 3.2 Hiệu kháng khuẩn dụng dịch nano bạc tổng hợp 55 PHẦN KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU STT Nội dung công việc Thời gian thực Chuẩn bị thông qua đề cương nghiên cứu Từ 3/2022 đến 4/2022 Báo cáo đề cương 3/2022 Bố trí thí nghiệm 4-6/2022 Theo dõi thí nghiệm 4-6/2022 Xử lý, phân tích số liệu, viết báo cáo 5-6/2022 Hồn thiện khóa luận 7/2022 Nộp bảo vệ khóa luận 8/2022 56