A. NỘI DUNG TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Vật liệu – hóa chất – dụng cụ và thiết bị 1.1. Vật liệu: Dùng 4 ml dịch cấy khuẩn (chủng vi khuẩn E.coli mang plasmid) 1.2. Hóa chất: Môi trường Luriabertani (LB – gồm peptone, yeast extract, NaCl) có ampicillin 10µgml. Thạch vi sinh (bactor – agar). Dung dịch GTE (Glucose – Tris – EDTA) pH 8 (làm ấm trước khi sử dụng). Dung dịch SDS – kiềm 1%. Dung dịch KOAc 3M (pH 5.5). Ethanol tuyệt đối (lạnh). Ethanol 70%. Dung dịch TE (Tris – EDTA) pH 8 (làm ấm trước khi dùng). Nước cất 2 lần. Đệm TAE (Tris – Acetic acid – EDTA) 1X pha từ TAE 50X. Agarose tinh khiết dùng cho điện di. Dung dịch nạp mẫu có sẵn thuốc nhuộm DNA (dung dịch GelRed 6X). Thang chuẩn DNA 1 kb. 1.3. Dụng cụ và thiết bị: Dụng cụ Micropipette 10, 20, 200, 1000 µl. 5 bình tia đựng Ethanol 70%. 5 giá ống nghiệm và giá đựng eppendorf. Hộp đựng đá. Khuôn đổ gel agarose và lược. 5 hộp đựng rác y tế và hộp đựng dịch thải. 5 bút marker
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -o0o BÀI THU HOẠCH THỰC HÀNH TÁCH CHIẾT PLASMID DNA TỪ TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI Sinh viên thực hiện: Lớp: THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2023 BÀI TÁCH CHIẾT PLASMID DNA TỪ TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI Lớp: Nhóm: Buổi thực hành: Ngày nộp thu hoạch: Họ tên sinh viên nhóm: STT Họ tên MSSV Tổ A NỘI DUNG TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Vật liệu – hóa chất – dụng cụ thiết bị 1.1 Vật liệu: Dùng ml dịch cấy khuẩn (chủng vi khuẩn E.coli mang plasmid) 1.2 Hóa chất: - Mơi trường Luria-bertani (LB – gồm peptone, yeast extract, NaCl) có ampicillin 10µg/ml - Thạch vi sinh (bactor – agar) - Dung dịch GTE (Glucose – Tris – EDTA) pH (làm ấm trước sử dụng) - Dung dịch SDS – kiềm 1% - Dung dịch KOAc 3M (pH 5.5) - Ethanol tuyệt đối (lạnh) - Ethanol 70% - Dung dịch TE (Tris – EDTA) pH (làm ấm trước dùng) - Nước cất lần - Đệm TAE (Tris – Acetic acid – EDTA) 1X pha từ TAE 50X - Agarose tinh khiết dùng cho điện di - Dung dịch nạp mẫu có sẵn thuốc nhuộm DNA (dung dịch GelRed 6X) - Thang chuẩn DNA kb 1.3 Dụng cụ thiết bị: Dụng cụ - Micropipette 10, 20, 200, 1000 µl - bình tia đựng Ethanol 70% - giá ống nghiệm giá đựng eppendorf - Hộp đựng đá - Khuôn đổ gel agarose lược - hộp đựng rác y tế hộp đựng dịch thải - bút marker - Thiết bị Máy ly tâm lạnh tube 1,5ml Máy vortex Tủ sấy Lò vi sóng Bồn điện di DNA nằm ngang nguồn Bàn soi UV Máy ảnh Vật dụng tiêu hao - Tube ly tâm eppendorf 1,5ml - Đầu tip trắng, vàng, xanh - Giấy thấm không bụi - Găng tay cao su trang y tế Quy trình thực 2.1 Tách chiết plasmid DNA vi khuẩn Ngày 1: Nuôi cấy lắc khuẩn lạc 10ml mơi trường LB lỏng có ampicillin 37 0C, khoảng 12 – 16 (được chuẩn bị trước) Ngày 2: Thực tách chiết DNA theo bước sau: Bước 1: Dùng tube eppendorf loại 1,5ml Ghi kí hiệu tên lên nắp eppendorf theo hướng dẫn cán phụ trách Sau lấy 1ml dịch khuẩn cho vào eppendorf Ly tâm 13.000 rpm phút, đổ bỏ phần nước để lấy cặn vi khuẩn Bước 2: Hịa cặn vi khuẩn 100µl dung dịch GTE máy vortex Ủ phút nhiệt độ phòng Bước 3: Thêm 200µl dung dịch SDS – kiềm, trộn nhẹ nhàng, ủ đá phút Bước 4: Thêm 150µl dung dịch 3M KOAc pH 5,5 trộn nhẹ nhàng, ủ đá phút có kết tủa trắng Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 40C Bước 6: Chuyển phần nước sang eppendorf 1,5ml mới, tránh hút phần cặn Bước 7: Thêm ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn nhẹ Để tủa 20 – 30 phút 40C (trong thùng nước đá) Bước 8: Ly tâm 13.000 rpm 10 phút để làm lắng phần cặn plasmid DNA Bước 9: Đổ bỏ ethanol, tránh làm tróc plasmid DNA Bước 10: Thêm 100µl ethanol 70% vào cặn DNA Ly tâm 13.000 vòng/ phút phút 40C Bước 11: Đổ bỏ ethanol Úp ngược tube giấy thấm để thấm Để khơ cặn DNA khơng khí Bước 12: Hịa plasmid DNA 50µl TE 1X Bảo quản DNA 40C - 200C 2.2 Phân tích DNA phương pháp điện di - Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1% ▪ Hòa agarose với TAE 1X đun lị vi sóng cho agarose tan hết ▪ Chuẩn bị khuôn, lắp ngược đổ gel Để cho gel nguội đặc hoàn toàn ▪ Gỡ lược, lấy khuôn gel đặt vào máy điện di theo chiều quy định dòng điện Đổ TAE 1X cho ngập mặt gel - Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Pha 5µl mẫu DNA với 1µl dung dịch Gelred 6X - Bước 3: Dùng micropipette 10 20µl cho hết lượng mẫu chuẩn bị vào giếng (khơng để mẫu rơi ngồi giếng) - Bước 4: Chạy điện di điện không đổi 100V 40 phút - Bước 5: Lấy gel khỏi máy soi gel hộp UV - Bước 6: Quan sát vị trí diện băng đèn cực tím Chụp ảnh - Bước 7: Xác định kích thước plasmid DNA dựa vào thang DNA chuẩn B GIẢI THÍCH Q TRÌNH VÀ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Giải thích cơng dụng loại hóa chất sử dụng q trình tiến hành thí nghiệm a) Ni cấy vi khuẩn mơi trường LB lỏng có Ampicillin vì: + Do vi khuẩn E coli vi khuẩn kháng ampicillin nên cho Ampicillin vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng đến cấu trúc hoạt động sống vi khuẩn + Bên cạnh đó, Ampicillin penicillin bán tổng hợp nhóm A có phổ rộng với nhiều vi khuẩn gram dương (+) gram âm (-) → Khi bổ sung ampicillin vào môi trường nuôi cấy ngăn cản sinh sôi phát triển loại vi khuẩn khác, điều giúp q trình ni cấy E coli đạt hiệu suất cao lứa vi khuẩn thu mang tính chất đồng chủng loại vi khuẩn b) Vai trò GTE Trong thành phần GTE, Tris thành phần đệm pH kiềm tính (pH 8.0), pH EDTA tạo liên kết hóa trị II với ion liên kết lớp phospholipid màng, làm giảm tính bền vững màng → Hóa chất thêm vào nhằm làm giảm độ bền vững màng sinh chất, tạo điều kiện cho phá hủy màng tế bào c) Vai trò dung dịch SDS – kiềm: Nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào làm biến tính DNA gen, DNA Plasmid protein Ngun nhân SDS có tác dụng hịa tan thành phần lipid màng tế bào protein tế bào Kiềm (NaOH) lại có tác dụng biến đổi DNA thành chuỗi đơn, điều làm biến tính DNA NST DNA Plasmid → Vai trị SDS kiềm phá vỡ màng tế bào số thành phần bào quan tế bào làm biến tính DNA NST (tránh làm ảnh hưởng đến kết cần thu plasmid vi khuẩn) d) Vai trò KOAc (kali acetate/ potassium acetate) - Do mơi trường mang tính acid nhẹ, tạo nên cân động acetic acid, hoạt động chất mang tính acid làm trung hịa lại môi trường kiềm gốc OH- tạo từ kiềm cho vào bước 3, điều giúp ổn định cấu trúc DNA (hồi tính lại DNA vơ tình bị biến tính bước 3) - Là dung dịch trung hịa mơi trường kiềm e) Ethanol tuyệt đối lạnh: Mục đích kết tủa DNA, khơng cho DNA biến tính, thu DNA nhiều bảo vệ chúng khỏi phá hủy enzyme g) Ethanol 70%: Nhằm mục đích tinh plasmid DNA thu được, tách bỏ thành phần muối, SDS bám vào DNA h) Dung dịch TE 1X Nhằm mục đích bảo quản DNA TE 1X đóng vai trị hệ đệm cho DNA, trình bảo quản, nước dung dịch có pH xuống tới 5.0, điều tạo điều kiện cho trình khử purine, hoạt động hệ đệm ngăn chặn trình này, giúp bảo vệ DNA Mặt khác EDTA bảo vệ DNA khỏi hư hỏng hoạt động DNase → TE 1X giúp bảo quản DNA cách hoàn hảo trước tác động tác nhân khác i) Pha Agarose có sử dụng TAE Trong bước q trình phân tích DNA điện di, pha agarose có sử dụng TAE (Tris acetate EDTA), chất đóng vai trị hệ đệm, trì pH ổn định trình điện di Mặt khác EDTA cung cấp ion hóa trị II Mg2+ tạo nên độ dẫn cho di chuyển plasmid DNA giúp DNA di chuyển cự (+) bồn điện di j) Pha DNA với dung dịch Gelred 6X Trong bước q trình phân tích DNA điện di, pha mẫu DNA với dung dịch Gelred 6X (dung dịch nạp mẫu bao gồm chất có tỉ trọng cao, thuốc nhuộm theo dõi trình điện di thuốc nhuộm Gelred 6X) nhằm mục đích theo dõi trình điện di thu nhận kết điện di Phân tích kết điện di 2.1 Phân tích kết chạy điện di Hình Kết chạy điện di thu sau soi bàn UV (Mẫu nhóm mẫu 32) Hình Thang DNA dùng thực hành 2.2 Phân tích kết chạy điện di ❖ Kết điện di DNA: Dương tính ❖ Xác định vạch DNA: Kết xuất băng sáng ▪ Băng 1: Gồm có vạch sáng, mỏng, cực âm, miệng giếng, có vị trí cao nhiều so với vạch 10037 bp ▪ Băng 2: Gồm vạch sáng, rõ, dày Có kích thước từ 6000 bp đến 10037bp ▪ Băng 3: Vệt sáng dài cực dương, đậm màu, trải dài từ vạch DNA 4000bp 200bp ❖ Nhận xét đánh giá: Có vạch DNA vệt sáng rõ, dày, DNA chưa tinh cao, cịn lẫn DNA nhân (đó lý xuất vạch thứ với kích thước 10037bp) ❖ Biện luận xuất băng sáng: ▪ Sự xuất băng gần miệng giếng: + GTE eppendorf ban đầu khơng ức chế hồn tồn nuclease, dẫn tới việc DNA genome bị phân thành đoạn kích thước ~ 10000bp + Hoặc trình phá màng biến tính protein (SDS-kiềm) khơng hồn tồn nên cịn sót lại lượng protein kích thước lớn kẹt lại miệng giếng ▪ Sự xuất băng 2: • Vạch 1: Kích thước 10037bp Đó cịn lẫn DNA nhân, DNA nhân chưa tinh loại bỏ • Vạch 2: Kích thước từ 6000bp đến 8000bp, DNA plasmid vi khuẩn ▪ Băng sáng trải dài hình ảnh điện di RNA, protein kích thước nhỏ cịn sót lại Ngun nhân số sơ xuất bước quy trình loại bỏ phần tạp chất: protein, màng chưa hết, dẫn đến DNA chưa tinh làm xuất vạch kéo dài ❖ Khắc phục: ▪ Cần nắm chất quy trình thí nghiệm ▪ Cần sử dụng thành thạo dụng cụ thí nghiệm, thao tác chuẩn xác thời gian ủ hợp lí ▪ Cần trọng, cẩn thận q trình xử lí, loại bỏ tạp chất