Xây dựng thử nghiệm AMES và thử ứng dụng để phát hiện các tác chất gây đột biến ung thư

aa

yu vu) ot

SỞ KHOA HỌC & CONG NGHE MOI TRUGNG TP.HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VUON UOM SANG TAO KHKT TRE

cic Tic GIẾT Gly SỘI NẾN GE TH

Cơ quan chủ trì : Sở KHCN & Môi Trường

Năm 2001

Lời cảm ơn

Chúng tôi xin chân thành cám ơn Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường và Trung Tâm Phát Triển Khoa Học Công Nghệ Trẻ TĐ, Trung Tâm

Khoa Học và Công Nghệ Sinh học Trường ĐHKH TN, Tp HCM đã giúp đỡ về

kinh phí và tạo diéu kiện thuận lợi cho chúng tôi thực hiện để tài này

Chúng em xin bày tố lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước đã

cho chúng em nhiều lời khuyên quí báu trong suốt quá trình thực hiện để tài

Xin cảm ơn anh Đình Minh Hiệp, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên chúng tôi hoàn tất để tài.

Đặt vấn để -cccecerrer

Tổng quan tài liệu

Chương 1: Độc chất hiện diện trong môi trường, phân loại & các c phương pháp phát hiện

1 Độc chất hiện diện trong môi trường

2 Phân loại và đặc tính các chất thải có độc tính

2.1 Phân loại dựa theo mức gây độc

2.2 Phân loại dựa theo độ bền vững

2.3 Phân loại dựa theo cách quản lý chất thải

2.4 Phân loại dựa theo tính chất -

3 Ảnh hưởng của độc chất đến sức khỏe của con người và môi trường

4 Quan hệ giữa tính gây ung thư và tính gây đột biển

5 Ảnh hưởng của S9 trong thử nghiệm Ames

6 Ảnh hưởng của nồng độ hóa chất kiểm tra

7 Phạm vi sử dụng của thử nghiệm Ames 8 Qui trình cơ bản của thử nghiệm Ames Vật liệu phương pháp

1.- Giống vi sinh vật

2 Dụng cụ, thiết bị

3 Hỏa chất và môi trường

4 Phương phấp

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào

4.2 Khảo sát thời gian cho phép lưu giữ giống dạng dich huyền phù tế bào

1.1 Ảnh hưởng giai đoạn tăng trưởng của giống lên tân số hồi biến 26

1.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên tần số hồi biến 1.3 Ảnh hưởng của thời gian lưu trữ huyển phù giống ở 4C 1.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý hóa chất lên tần số hôi biến

2 Để xuất qui trình thử nghiệm Ames và kiểm tra qui trình

2.1 Để xuất qui trình thao tác thử nghiệm để phát hiện tác chất gây đột biến

4.1 Ứng dụng qui trình thử nghiệm Ames kiểm tra độc tính gây đột biến trong mẫu nước ô nhiễm

42 Ứng dụng qui trình thử nghiệm Ames kiểm tra độc tính gây đột biến

trong mẫu phụ gia thực phẩm

Pat van dé

Như các nước khác trong khu vực, trong những năm gần đây, Việt Nam

chú trọng phát triển các ngành công nghiệp khác nhau nhằm đáp ứng nhu cau tiêu đùng trong nước và xuất khẩu Công nghiệp Việt Nam có qui mô vừa và nhỏ với công nghệ không tiên tiến thường được hình thành theo các cụm, khu

công nghiệp gần với thành phố lửn như TP Hồ Chí Minh, Biên Hòa, Việt Tủ,

Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lào Cai Ngoài các khu công nghiệp tập trung còn

có các nhà máy , xí nghiệp riêng lẻ, các xưởng sản xuất tiến thủ công nghiệp xen lẫn trong khu dân cư ở các thành phố lên Điều đáng lo lắng là từ bạn đầu, do chưa có sự guan tâm và đầu tư đúng mức đến mối quan hệ giữa phái triển và! báo vệ môi trường nên sự phát triển sản xuất đã làm ö nhiễm đăng kế đến môi

trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của công đồng {1} Nhiều cơ sở công nghiệp đã gây 6 nhiễm nghiêm trọng môi trường vì không cổ biện pháp xử lý 6

nhiễm và mọi chất thấi đếu xả thẳng vào môi trường, Số lượng và chất lượng của chất thải công nghiệp phụ thuộc vào các yếu tố như: nguyên liễu, công nghệ sẵn xuất và sản phẩm Tính chất và mức độ của chất thải công nghiệp thay đối không chỉ từ các nhà máy khác nhau mã ngay cả đối với những nhà

mẩy có cùng nguyên liệu, cũng sản phẩm {1}

Bến cạnh nguồn chất thải từ các ngành công nghiệp, các nguồn chất thải

gây độc hai từ các hoại động sản xuất nông nghiệp, các hoại động xã hội, dịch vụ, thương mại, bệnh viện cũng là vấn để cần lưu ý Ở nước ta, nông nghiệp là ngành sẵn xuất chủ yếu Ngoài việc cung cấp đủ lượng lương thực, thực

phẩm cho thị ưỡng trong nước, ching ta côn phải phẩn đấu để tầng xuất khẩu ra thị trường thế giới, Để đạt được sản lượng Cao trong nông nghiệp, ngoài

những điểu kiện khác như giống, thời tiết, phân bón thì việc sử dụng có hiệu quả các loại hóa chất báo vệ thực vật (HCBVTV) là một trong những vấn để rất nghiêm trọng, Trong những năm gắn đây, lượng HCBVTV được sử dụng Ở

nước ta đã tăng lên nhiều cả về số lượng lẫn ching loại Vào cuối thập ký 89, lượng HCBVTTV được sử dụng là 10.000 tấn/năm nhưng bước sang đầu thập ký

90 đã tăng đến 20.000 tấn năm Ngoài các nhóm hóa chất lân hữu cơ (HCLHC), cacbamat, hiện nay một số nơi vẫn sử dụng nhóm hoá chất clo hữu cd (HCCHC) nhy DDT, 666, Gamatox mà Bộ Nông nghiệp và Công nghiệp

thực phẩm đã cấm sử đụng Mặt khác, việc nhập khẩu, lưu thông và bảo quản, sử dụng HCBVTV vẫn chưa được quán lý tất dẫn đến tình trang gây ô nhiễm

mỗi trường sinh thái và có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người (21.

Đặt vấn đề

Như các nước khác trong khu vực, trong những năm gần đây, Việt Nam chú trọng phải triển các ngành công nghiệp khác nhau nhằm dap ứng nhu cậu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu Công nghiệp Việt Nam có qui mô vừa và nhỏ với công nghệ không tiên tiến thường được hình thành theo các cụm, khu công nghiệp gần với thành phố lớn như TP Hỗ Chí Minh, Biên Hòa, Việt T0, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lào Cai Ngoài các khu công nghiệp lập trung con có các nhà máy , xí nghiệp riêng lẻ, các xưởng sẵn xuất tiểu thủ công nghiệp

xen lẫn trong khu dân cư ở các thành phố lớn, Điễu đáng lọ lắng là từ bạn đẫu,

do chưa có sự quan tâm và đầu tự đúng mức đến mỗi quan hệ giữa phái triển và

báo vẽ môi trường nên sự phát triển sẵn xuất đã làm ô nhiễm đáng kể đến mỗi trường và ảnh hướng xấu đến sức khỏe của cộng đồng {1}, Nhiều cơ sở công

nghiệp đã gây ô nhiềm nghiêm trọng môi trưởng vì không có biện pháp xu ly 4

nhiễm vã mọi chất thải đều xã thẳng vào môi trường Số lượng và chất lượng của chất thái công nghiệp phụ thuộc vào các yếu tố như: nguyên liệu, công

nghệ sản xuất và sẵn phẩm Tính chất và mức độ của chất thải công nghiệp thay đối không chỉ từ cde nha máy khác nhau mà ngay cả đối với những nhà

máy có cùng nguyên liệu, cùng sẵn phẩm Ít}

Bên cạnh nguần chất thải từ các ngành công nghiệp, các nguồn chat thai

gây độc hại từ các hoạt động sẵn xuất nông nghiệp, các hoạt động xã hội, địch

vụ thương mại, bệnh viện cũng là vấn để cần lưu ý Ở nước ta, nông nghiệp

là ngành sản xuất chủ yếu Ngoài việc cụng cấp đủ lượng lương thực, tực

phẩm cho thị trường trong nước, chúng ta côn phải phấn đấu để tăng xuất khẩu

ta thị trường thế giới ĐỂ đại được sản lượng cao trong nông nghiệp , ngoài những điều kiện khác như giống, thời tiết, phân bón „ thì việc sử dụng có hiện quả các loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTTV) là một trong những van dé rất nghiêm trọng, Trong những năm gần đây, lượng HCBVTV được sử dụng ở

nước ta đã tăng lên nhiều cả về số lượng lẫn chúng loại, Vào cuối thập kỷ 80,

lượng HCBVTV được sử dụng là 10.000 tấn/nầm nhưng bước sang đầu thập ky 9Ö đã tăng đến 20,000 tấn nằm Ngoài các nhóm hóa chất lân hữu cơ (HCLHC), cacbamat, hiện nay một số nơi vẫn sử dụng nhóm hoá chất cÍlo hữu cơ (HCCHC) như DDT, 666, Gamatox mà Bộ Nông nghiệp và Công nghiệp

thực phẩm đã cấm sử dụng Mật khác, việc nhập khẩu, lưu thông và bảo quản, sử dụng HCBVTV vẫn chưa được quản lý tốt dẫn đến tình trạng gẫấy ô nhiễm

tuôi trường sinh thái và có ảnh hưởng xấu đến sức khốe con người {2},

Nhu vay, su phat trién về sẵn xuất công, nông nghiệp cũng như tốc độ đô thị hóa nhanh đã có tác động lớn đến môi trường và hệ sinh thái Các chất thải đo sẵn xuất, do sinh hoại thường ngày chứa hầm lượng lớn các "chất hữu cơ làm vạn kiệt nâng độ oxy fan trong nude ảnh hưởng nghiêm trạng đến khu hệ sinh vật có tắc dụng phân hủy các chất hữu cơ, làm sạch nguồn nước Mặt khác, „, nước thải còa chứa nhiều kia loại nặng hoặc các chất đị sinh cổ độc tỉnh cao đối với sức khốc vọn người, có thể gã y đột biến, ung thư,

Mặc dù tình trang 6 nhiễm môi trường do chất thái từ nhiều lĩnh vực khác

nhau là một thực trạng đáng quan tam nhưng hiện nay trong công tắc giầm sat và quần lý môi trường, chúng ta thường quan tâm nhiều đến sự ô nhiễm hữu cơ thong qua cde chi sé BOB, COD, sv hién điện vượt mức cho phép của các kim loại nặng có độc tỉnh cao, hoặc một số chất hữu cơ có độc tính khác Tuy nhiền, chưa cỏ phương pháp hữu hiệu để đánh giá độc tính của các kim loại hoặc các chất dị sinh này, nhất ia khả nâng cam ứng sự thay đổi của gen và cảm ứng ung thư

Để tài này nhằm xây dựng một phượng phấp sinh học nhanh, nhạy để phát hiện độc chất gây đột biến, ung thư trên môi trường dựa trên khả năng gầy

hai biến đạng đội hiến dị đường của vì khuẩn Salmonelia His, déng gdp mot

công cụ mới hữu hiệu trong công tac giám sát và quản lý môi trường nhằm

phát hiện sự hiện diện của độc chất gãy đột biến, uag thự trong một sô khu vực

ô nhiễm Khác nhau như nước, đất

Các nỗi dung thực nghiệm được thực hiện trong để tài gốm:

+ Khảo sát các yếu tế ảnh hướng đến tấn số hồi biến của chẳng ỨA /B0 {agar, tuổi của giống, thối gian giữ huyễn phù tế bào, mật độ tế bảo thời

+ Nghiên cứu và thiết lập qui trình cảm ứng và chiết dung dich 59 từ gan chuột và sử đụng trong thử nghiệm Ames

+ Ứng dụng qui trính xác định tinh gay đột biển, ung thư trong việc kiểm định độc tính gây đột biến, ung thư của một số ï mẫu nước thải, mẫu phụ gia thực phẩm.

nw ° ` @ nf

Tổng quan tài liệu

Chương 1: Độc chất hiện điện trong môi trường, phân loại & các phương pháp phát hiện

Môi trường xung quanh chúng ta luôn hiện diện những chất cỏ khá năng

gãy đột biển, ung thư như tía UV, chất thải công nghiệp, thuốc trừ sầu, chất phụ

gia trong thực phẩm và những sản phẩm từ các nhà mẫy thuốc lá, Các loại hóa chất này có khả năng gây ra bệnh ung thư bởi vì chúng là các tác nhân gây đội

biến lâm thay đổi tình tự các nucleic acid của DNA Theo tổ chức Y tế thể

giới, mỗi năm có khoảng 5 triệu người chết vì ung thơ, mỗi năm có thêm Ï

triệu ca ung thư phổi mới, Nói chung là bệnh ung thư đang phải triển và đang

dẫn có nguy cơ chuyển thành nguyên nhân gầy tử vong số một của toàn cầu

Cũng vì thế mà cần thiết phải có một thử nghiệm nhanh, rẻ tiễn cho việc kiểm tra những hóa chất nghí ngờ là chất gây ung thư, cũng như để kiểm tra nhiền

loại hóa chất tổng hợp mới được tùng ra thị trường mỗi nấm

Theo “Cơ quan đăng ký hóa chất độc hại tiểm tầng”, độc chất là các chất

gây tác động xấu cấp tính và mãn tính, tác động lâu đài và tức thời đến sức khúc con người và các đốt tượng mỗi trường xung quanh Theo định nghĩa này, mọi chất thải khi hàm lượng đạt tới mức giới hạoa nhất định nào đồ sẽ gây độc hại đến mỗi trường xung quanh Tuy nhiên, có thể nói rằng các chất thai gay nguy bại chủ yếu được phát sinh ra từ các hoạt động công nghiệp [ãì Mỗi dạng

công nghiệp thái ra những chất ô nhiễm đặc trưng, có thể nêu một vài ví dụ:

+ Nước thải của nhà máy giấy có hầm lượng lignin cao (20.000 - 27.000 mg/Ð), Trong khí thải của nhà máy giấy có các khí độc đáng lưu ý như Hạ, H„S, SƠ:, bụi Na;SO,, Na;CO;, CH:CH CH;:SCH: với hàm lượng lồn hơn nhiều lần so với gui định [1]

+_ Nhà máy đường có đặc điểm là COD của nước thải rất lớn 140.000 —

170.000 mgiI do hầm lượng đường còn lại sau khi ly tâm Ở nhiễm không khí của nhà máy đường chủ yếu là do quá trình đốt nhiên liệu [1],

+ Nhà mấy sơ chế mũ cao su xã ra một lượng nước thải lớn có hàm

lượng chất hữu cơ cao: 1.600 — 17.000 mgi làm ô nhiễm môi trường tạo môi

thối nẵng nặc do sự phân huỷ acelc acid và các hợp chất chứa nhợ {H.

men

+ Nhà máy thuộc da gầy 6 nhiễm nặng do các acid vớ cơ, mỡ Ham lượng chat hifu cd cao 1.800 ~ 2.000 mg/l, $5 2,800 — 3.000 mg/l, cd madi rai khó chịu và đặc trưng của hợp chất luu huyoh va amonium [1]-

+ Trọng ngành công nghiệp tẩy nhuộm, nước thải chứa tỉnh bột xá ra tử khẩu hồ sợi lâm giảm nông độ oxy hòa tan trọng nước, ảnh hưởng đến quá trình hồ hấp của các loài động vật thủy sinh Khi môi trường trở nên yếm khí, quá trình phân hủy yếm khí gây ra mùi hồi thối (do CHạ, CÒa, NHà, H;Ä), Các

hóa chất như H:SO,, CH:COOH được thải ra từ khâu giật, CÁC chất làm mềm,

chất nhũ hóa, chất tạo phức tử khâu hoàn tất đã gây ảnh hưởng rãi lớn đến quả trính phân hủy của các vị sinh vật trong nước, ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của thực vài thủy sinh gây sự thiếu hụt oxy hòa tan trong nước, Các ion kim loại tham gia vào chuối thực phẩm gãy Ảnh hưởng cho sức khóe con người Clor hoạt tinh trong nude thar s€ kết hựp với các chất hữu củ vòng thơm tạo thành những hợp chất gây ung thư như 3,3 đichlorocatecholt, 3,34 6- trichloro phenol Gần đây người ta còn phát hiện ra độc tỉnh gây ung thư của

thuốc nhuôm hữu cơ chứa benzidm (Hhữ - NHà) dùng trong ngành tay có

khả năng gây ung thư chủ người [4|

+ GO ngành chế biến thực phẩm tiểu thủ công nghiệp thủ công, nước thất chứa nhiều chất rắn lơ lững, chất béo, đấu mỡ; BOD, COD khá cao lðÌ

+ Dạng ô nhiễm rất ngay hiểm đối với môi trường và sức khỏe cộng

đồng là nước thải chứa kim loại nặng như chỉ (pin, Ac qui), Cr (thude da), Hạ

(tữ một số ngành công nghiệp) Nước thải của các nhà máy bột giặt chữa các

chất hoạt tính bể mặt với hàm lượng cao và khó phân hủy,

Nguồn chất thải gây độc hại còa từ các hoại động sáo xuất nông nghiệp

công nghiệp, bệnh viện, các hoạt động xã hội, dịch vụ, thương mại (Bảng i}

ĐH

Các chất thái Các phòng nghiên cứu y ~ sinh học, các phòng chữa rấng, phóng Xã các bệnh viên, nhà máy năng lượng nguyên tử

Các độc tố hóa học | Các công ty hóa chất, nhà máy hóa chất, sản xuất pin,

Ì nhà máy sơn, trạm chữa chay, tram xá, bệnh viện, nhà Im, cửa hàng rửa ảnh, nhà máy năng lượng nguyên tử

2.1 Phân loai dưa theo mức gây độc

Dựa vào chỉ số Tụ (lượng độc tế gây tử vong 50% động vật thí nghiệm sau 96 giờ nhiễm độc) người tá phân chia độc chất theo các mức độ độc như Ở Bảng 2

Bảng 2: Nhám các độc tổ phần laaqi theo mức độ sây độc

- 2Ö Phủan loại tha theo độ hên vững

Nhiều loại độc tố thường lưu đọng một thời gian đài trong mối trưởng (đất, nước, không khí) và trong cơ thể động, thực vật Những chất này sẽ gẫy ra tác động trực tiếp hoặc gián tiếp Dựa vào tính chất hển vững, độc tố có thể được phần chia thành 4 nhóm (Bằng 3)

Nhóm độc tổ Thời gian tần tại trong môi trường

Không bến Tổn tại | ~ 2 tuần (các hợp chất phospho hữu cơ, carbonate) Bên trang bình | Tổn tại] - I8 tháng (24-D)

Bén Tổn tại 2 ~ 5 nim (DDT, Aldrin, Chlordane, Heptachlof Rất hến Cac kim loại nặng (Hg, Pg, Pb, Cđ, Às ) tổn tại rất lâu trong

cơ thể sinh vật |

2.3 Phân loại dựa theo cách quản lý chút thải

Chủ yếu dựa theo mục đích bảo quản, kiểm tra, thanh soát khi vận

chuyển (Bảng 4)

g

&

Bảng 4: Các chất nguy hiểm, nguồn nhát sinh va ddc tinh ngay hiểm

Thải tuy hiểm 314! 1617 1® ;9:18|11; À |BỊC |:ĐIF )ÌGijRHỊÍ

1/ Chất thôi vô cơ

Acid và kiểm x xix i xix: x

Chita CN ; x

xì chứa kừan loại X XY EX x |

hồi trưn, cặn dầu

Sơn, keo, mầu vẽ ị

(thường chứa dụng XNERERES x X x mội và các kửữn - ị

loại độc J

Bã thải hữu cơ isixi [x x

4) Chat thai phân wwư x vẻ

(li Gỗ, du dệt: (Ø), Sẵn xuất giấy, in, ấn phẩm, (10), Dick vs y tế báo vệ sức khỏe; tÌÌ) Dịch vụ phục vụ và thương mại Đặc th nguy hiểm: (À) Ấn mòn) (BỊ, Cháy: (C] Mã; (DỊ Độc; (ẾL Tích tạ sinh học; (G| Bến trong mÙi trường; (H), Gdy ung thức is) Cây viêm

nhiềm; +KỊ Gây quái thai: (L4, Gây bệnh thần kính

lỗ

2.4 Phân logi dựa theo tính chất

Dựa theo tính chất, có thể phân độc chất thành 5 loại như sau:

- Chất phóng xự: là những chất bền vững phát sinh ra bức xạ iơn, có tinh bến vững trong mdi trường, Khái niệm °thời gian bán hủy” là thời gian để cho

một lượng chất phóng xạ nào đó tự phân hủy nửa lượng bạn đầu Vĩ dụ:

Uranium có thời gian bán hủy khoảng 72 năm, còn đối với Ú”” là 23.426.000

năm

- Múa chất độc hai: bao gdm kim loại, thuốc trừ sâu điệt có, các chất

được liệu, Hóa chất độc hại còn có thể được phân thành các nhầm nhỏ khác:

- Chất gây chúy: hầu hết các chất thải gây cháy đều là hóa chất Việc đặt chất thấi gãy cháy vào một nhóm riêng là cần thiết vị nó phức tạp về bảo

quản, thu gom và để thải, Chất gầy cháy có thể ở dạng lổng, dạng khí hoặc rắn, thống thưỡng, chúng ở dạng lông (dung môi, đầu) hoặc có tính chất của chất dẻo, bàn hữu cơ, |

- Chất gây nổ: bạo gầm các chất ở dang ran, long va khí Những chất

gây chấy, nổ không những nguy hiểm khi sử dụng mà còn nguy hiểm ngay cả chí để tập trung trong kho chứa, khi văn chuyển Vì vậy, cần phân tách

những chất này ra theo những qui định riêng

trường [31 "TT

Các chất thải độc hại tác động đến cơ thể con người thông qua đường hồ hấp, tiêu hóa và tiếp xúc trực tiếp, Các độc chất có thể hòa tan hoặc tích đọng trong nước, đất, không khi gãy tác động xấu như làm nhiễm bấn môi trường,

gây nên hiệu ứng nhà kinh, phá hủy tầng ozon, di chuyển vào cấc động vat,

thực vật là thức ấn cho người, gia súc Trong quá trình chuyển hóa sinh hóa

trong chuỗi thức ấn đó, độ độc có khi gia tầng gấp bội (như trường hợp các hợp chất hữu cơ thủy ngân và nhiều kim loại nặng khác, các chất khó phân giải như clo hữu cơ.)

Sự ô nhiễm nước do các tác nhần sinh hoc da gdy ra cde va dich ta, ly, thương hàn và phỏ thương hân, viêm gan do virus, HCBVTTV khi xâm nhập vào

cơ thể có thể phá hủy nghiệm trọng các chức năng của cơ thể hoặc làm cho cứ

thể bị chết

Tùy vào mục địch yêu cầu mà người ta có thể sử đụng nhiều phương pháp đánh giá độc tính khấu nhau,

- Đăng động oật, thực vật để tuứ nghiệm độc ti, Sinh vật thường được

dũng để thử nghiệm độc tính là thỏ, chó khi, chuột trắng, chuột lang, bè sắt,

- Xác định cáu chất cả khả năng gây đột biến, gây tnạ thứ bằng phường

pháp dịch tế học, Phương pháp này có điểm hạn chế là thời gian tiểm tầng kéo dài (từ khi cơ thể bị tác đông của hóa chất gây ung thư cho đến khi cơ thể

biểu hiện ra bệnh kếo đãi khoảng 2Ö ~.30 năm) [?}

- BDdnk giả khả năng cần: ứng gây ttạ thứ của hóa chất bằng mà hình động vật tuệ nghiệm, Ttong trường hợp nầy, người ta sử dụng chuột công và chuột nhất Trong đa số trường hợp, với điều kiện thí nghiệm phù hợp thì những hợp chất hữu cơ đã được xác định là có khả nắng gây ung thd che con

người đều cho kết quả đương tính trong mô hình thử nghiệm trên động vật, Ứu

điểm của mỗ hình thử nghiềm trên đồng vật là có thể giúp chúng tả ngăn ngừa bệnh uoe thư nhữ khá nãng phái hiện ra những chất cổ khả năng cam ứng gầy ung thư của no {7{ Tuy nhién, phudag phap nay cũng có một số hạn chế như sau:

+ Rất tốn kém về tiền bạc và thời gián: để thử nghiệm cho một hóa chất `

vẫn tiêu tốn khoảng 250,000 USD trong thối gian khoảng 3 năm/ Như vậy, để có thể ứng dụng thử nghiệm nãy vào việc kiểm tra hàng ngần loại hóa chất nghí ngờ mà con người vẫn phải tiếp xúc hàng ngày thì cần phải bỗ ra một số tiễn khá lớn cùng một thời gian rất đãi |7],

+ Cần số lượng lớn động vật thử nghiệm ; chất có khả năng gay đột

biến, øng thư trong môi trường thường chỉ gây bệnh với tý lệ là 1% (nghĩa là trong 100 triệu người thì sẽ có Í triệu người bị bệnh), Như vậy, để sử dụng mô

hình thử nghiệm này cấn phải dùng một số lượng động vật rất lớn [7]

- Sử dụng ví khuẩn trong việc phát hiện các chất gây đột biển, Phương

pháp đông vì khuẩn để phải hiện các chất có khả năng gây đội biến : đây là

một phương pháp có tính ưu việt vượi tội so với các phương pháp khác vì

tính đơn giản, tính kinh tế, tính nhạy cảm đối với phản ứng cũng như phạm vì

phẩt hiện các chất của nó [8}

+ Đơn giản: thử nghiệm này có thể được thực hiện mội cách định tính,

đơn giản bằng cách đặt một lượng nhỏ (1mg) của hóa chất bị nghĩ ngờ lên

vùng trung tâm của đĩa petri cấy ví khuẩn Vĩ khuẩn này là một dạng đột biến

không thể mọc được trên môi trường này Nếu hóa chất kiểm tra có kha nang

gầy đột biển thì nó có thé fAm cho vị khuẩn hồi biển trở lại trổ nên có khả

năng mọc trên môi trưỡng làm xuất hiện các khuẩn lạc xung quanh vị trí cô

hóa chất kiểm tra [8]

+ Độ nhạy cau: phương phấp này cho phép thực hiện với một số lượng

lớn vi khuẩn nên có thể phát hiện được đột biến mặc dù đột biển có tân số

Chương 2: Thử nghiệm Ames để phát hiện

các chất gây đột biến

Do các chất gầy đột biến đều tác động lên DNA nền một chất gây đột

biến Ởở cấu cơ thể sinh vật bậc cao căng chính là chất gây đột biển cho vị sinh vật[8] Do vậy, từ những năm 7Ú, Bruce Ames cũng các cộng sự của ông Ở trưởng đại học Caliormia-Berkeley đã để ra một thứ nghiệm nhanh, đơu giản, rẻ tiền để phát hiện các bóa chất gây đột biến bằng cách sử dụng đang đột

biến khuyết dưỡng histidine (Hìs ) của Sabnonela typhùmurban, Thể đột biến

này vô cùng nhạy cẩm với các hoá chất gây đột biến [9|

Trên cơ sở các nghiên cứu nhiều năm về quá trình sinh tổng hợp

hisHdine ở § ryehbnurbdn, Adnes đã thiết lập thành công một thử nghiệm in

vitro có hiệu quả cho việc phát hiện các chất gây đột biến vào năm 1971 được

đãi tên là thử nghiệm Ams Sau đồ thử nghiệm Ames di giúp phát hiện và xác định nhiều chất gây đột biến có cấu trúc heterocycHc auuine từ các loại

thực phẩm được chế biến trong điều kiện thông thường Mật khác bằng cách

cho chuỗi uống các bóa chất thử nghiệm trong mội thời gian đài, người ta cũng

chứng mình được rằng rất nhiều hợp chất gây đột biến này cũng gây ung thư, Các khối u gây ra do các loại beterocyclic amine là đo sự biển đối di truyền

[1ÔI

thư nghiêm Ames [11]

Thử nghiệm Ames được xây dựng dựa trên cơ sở sự hồi biến của cdc

chủng đội biến của các chúng § @pBipuuiam bạn đầu có khá nâng sinh tổng

hợp histidine, Ames cũng các cộng sự đã tiến hành gây đột biến làm mất khả năng sinh tổng hợp histidine, Ngoài ra, ông còn tạo ra đột bién S npAimurium Hiš mất khả năng tự sửa chữa và tăng tính thấm qua mâng Tất cả những đặc

điểm kể trên giúp cho các chẳng $, /yphinuruem HíS trồ nên nhạy cẩm hơn với

các tắc nhãn gãy đột biến và làm tăng tần số hồi biến từ His thành His”,

Thử nghiệm Arnes thường được thực hiện với một bộ năm chúng đội

biến chuẩn IA TA 98, TA 100, TA £535, TA 1537, TA 1538 [LE] Nam ching này cỏ đặc điểm di tuyển như sau Mỗi chủng đột biến có chứa † trong 4 kiểu

đột biển ở operon hisddine lầm vi khuẩn mất khả năng tự dưỡng hishdine, Đột

biến mất vũng ¡z trên nhiễm sắc thể làm mất khả năng tự sửa chữa những

đội biển trên DNA của chúng Đột biển gai và sa làm mất chuối

polysaccharise bao phủ bể mặt ví khuẩn, nhờ vậy làm gia tăng tính thẩm của ví khuẩn đối với hóa chất và làm vị khuẩn không còn khả năng gấy bệnh Các

chủng đội biến gồm TA 1535, TA 1537, TA 1528 chửa các gen đột biến zƒữ và

t8 [ÕÔI Ching vi khudn TA 1535 chifa dét bién histidine dang AisG4é, 1a

một đột biến nhằm nghĩa, Đột biến này dễ bị hếi biển dưới tác dụng của nhiều loại chất gây ra sự thay thế một cặp base nhưng lại không bị hồi biến dưới tác

dụng của các chất gây đột biến chuyển khung Chúng TẢ 1537 chứa đột biến

hị C3076 do sự thêm vào một cặp baae G-C, chủng TẠ 1538 chứa đột biển

chuyển khung Ais D3052 Hai ching TA 98 va TA LÔO là hai chúng được tạo ra

từ hai ching TA 1535 va TA 1538 bằng cách chuyển nhân tế R vào hai chúng

chuẩn này Hai chủng vị khuẩn mới này vô cùng hiệu quả trong việc phát hiện

tắc chất gây ung thư, và rất nhạy cam đối với một số hỏa chất mã trước kia

không thể phát hiện đốc tính bằng các chúng nguyên thủy { D3]

Nhiều chất gây đột biến từ môi trường ( bao gồm những chất có nguồn

gốc tự nhiễn và chất nhãn tạo} gây nên bệnh ung thư, bệnh có liên quan đến

vấn để di truyền, bệnh tia mạch, bệnh lão hóa Hàng ngàn lơại hóa chất tổng

hợp đã được đưa vào mỗi trường trong thời gian TÔ thập kỷ vừa qua cần được kiếm tra khả năng gây ảnh hướng đến DNA Các mô hình thí nghiệm trên động vật, những nghiên cứu dịch tế học không thể giúp thực thí nhiệm vụ này vì trở

ngại về vấn để thời gian, giá cả cũng như khó khăn khi phải đối diện với các

hợp chất phức tạp, ThỮ nghiệm Ames khắc phục được nhược điểm của cấc phương pháp dịch tế học, mô hình thử nghiệm trên động vật nhờ những tĩnh chat du việt như sau;

+ Ré tién

Tính nhạy cao đối với phần tng

+_ Đề thực hiện,

+ Kết quả thu nhận được trong thời gian ngắn,

+ Phổ hoạt động rộng (có thể kiểm tra nhiều loại hóa chất thuộc nbiểu nhóm khác nhau) ƒI l]

Hiện nay, cơ quan quần lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ FDA chấp thuận

sử dụng thổ nghiệm Ames để phát hiện nhiều loại hóa chất gây đột biến Hầu

hết các loại hóa chất gây truc thư ở động vật đều cho thấy kha nang pay đội biển trong thử nghiệm Ames Admies cũng đã sử dụng phương phấp này để

chứng mình rằng khoáng 90% các hóa chất hữu cơ gây ung thư cũng gây đột biển Với các kết quả từ các thử nghiệm khác, kết quả này đã góp phan xac

we Ur

nhận giả thuyết rằng hẳu hết chất gây ung thư thể hiện tác động của nó thông qua việc gây tổn thương DNA Thứ nghiệm Ames đang được ứng dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm của các trường đại học, viện, cơ quan nhà nước, các

công ty trên khấp thế giới Tuy nhiên, vì không phải tất cả các chất gây đội

biển đếu dẫn đến bệnh ung thư cho nên thử nghiệm Ames được sử dụng như lâ

một kỹ thuật dé sang loc, phái hiện những hợp chất bị nghỉ ngữ có tính rấi ro

cao Sau đó những hợp chất này sẽ được kiểm tra tính năng gây ung thư,

Đặc tính nầy vô cùng quan trọng và hữu ích trong việc ứng dụng thử nghiệm Ames Nhờ đặc điểm này, ngoài việc kiểm tra, phát hiển hóa chất bi nghị ngờ là chất nấy đột biến, thử nghiệm này côn giúp phần loại hóa chất hay

chất thải trong môi trưởng,

Khi tiến hành thử nghiệm Ames, hóa chất được thử nghiệm trên năm chúng đột biển chuẩn khác nhau, Những chúng đột biển đo chuyên khung như | TA 1536, TẠ 1537, TẠ 1538 bị hỗi biển khi chịu tác động của các loại hóa chất

gây ra đột biến chuyển khung khác nhau Mỗi hóa chất như vậy tác động lên

một trình tự lấp lại đặc hiệu trong trình tự ÔNÀ, sự tương thích đặc hiệu này có

thé dude mình họa bằng Bảng 5 |14J,

Bảne Š- Bảng kết quả hồi biển của các chủng tì khuẩn dưới tác động của hộa Š f ` : TS

chất

Số Hóa chất Hg/đa Sỡ khuẩn lạc hồi hiến ¿ đĩa TT S-9 | YA 4935 | TA 1536 | TA 1537 | TA 1538

2 + 318 Lt 180) 11200 Ì 2- Aminoanthracene 20 ¡ - Zi Q 1? 27

lÔ | + 77 2 121 11300 2 2-Aminotinorene ig i - 21 Ộ id 39

50 | + | 117 2 92 Ì 13600

3 | 2-Acetylaminofluorene | 50 | - 86 Ụ it 2l 8 | + 118 Ũ 12 4ö 350 | + 34 i 29 265

4 Benzidine 50; - 38 1! Ô ¡Q 16

Ũ i+ 38 0) 22 36 LOO } + 143 4 108 980 5 4-Aminobiphenyl JOO | - 92 2 8 2

1 + 18 6 127 ¡ 638

0 | + I4 2 18 46 5 + 46 4 148 505

L4 Benzo(ä)pyrene 5Ì - 77 i 16 34

QO | + 48 i 28 44 SQ | + 22 5 88 510 15) 3-Methyl-cholanthrene | 50 | - 13 Q 2 2]

50 1 +4 25 L 225 8ã

Ames và những nhà nghiên cứu khác đã tiên hành thứ nghiệm Ames trên khoảng 20 chất gây nng thư thuộc dang vòng thơm, Trong số đó, l8 loại là những chất gã y đội biến chuyển khung đã cho kết quả đương tính (Bảng 3) Hai chất còn lại không cho kết quá đương tính là aumarine vA N.N-dimethyl-p- (phenyiazo}- -anine Cả hai chất này đều có chuối đìmethylamino ở bể mặt nên có thể cần có sự oxy hóa trong quá trình kích hoạt,

Người tả biết rằng có nhiều loại hóa chất gây bệnh ung thư là các chất gây đột biến và khung 90% các chất gây ung thư cũng chính là các chất gây đột biển, Ngay từ năm 1957, Sukimura đã phát hiện khả năng cảm ứng bệnh ung thư ở chất gây đột biến đ-nitroguinoline-l oxide Năm 1966, ông nhận thấy khi tiếm N-methyl-N'-nitrosoguanlidine (MNNG) là một chất gây đột biến khác vào dưới da của chuột thì sẽ làm phát triển u xơ Đến 1967, ông đã thành công trong việc gây ra bệnh ung thự da day ở chuột bằng cách cho chuột uống MINNO Sukimura và Ames đã làm việc độc lập với nhau trong việc chứng mình rằng chất gầy ung thư cũng chính là chất gây đội biến.

Nhiễu loại hóa chất gây ang thu 1A tac nhan alkyl hda, ching gây ra các đột biến lâm thay đổi một cặp base và như thể làm cho ching TA 1535 bị hồi

biến, Một số hóa chất lại cần phải được kích hoạt để trở thành một tác nhân

alkyl héa như trường hợp của dunethyÍnitrosamine

Các dữ liệu trong bảng kết quả hồi biển của các chủng vì khuẩn dudi tic động của hóa chất còn cho thấy mối liên hệ giữa nồng độ hỗn hợp $9 va sé

khuẩn lạc hỗi biến trong thử nghiệm, Thử nghiệm Ames không chỉ IA một thử

nghiém enzyme dup giản, ngoài những yếu tổ trên đấy còn có rấi nhiều nhân

tế phức tạp khác có ánh hưởng đến sự hổi biến của chủng vị khuẩn kiểm tra

như khả năng hoại húa hay bất hoại hóa của hóa chất kiểm tra, sự mat hoại tính của hẳn hợp S9 theo thời gian,

Có thể chuẩn bị hỗn hợp 59 dùng cho thử nghiệm từ gan chuột hay gan

người, Tuy nhiên, bốn hợp S9 tha nhận được từ san người tô ra có hoại tỉnh

không mạnh bằng hỗn hợp SỞ thu được từ gán chuột, Nguyên nhân chính của sự khác nhau này là do sự khác nhau về hầm lượng protein có trong hẳn hợp

Hơn nữa, nếu như gan chuột được thu nhận ngay sau khi mổ chuột xơng và còn rất tươi thì gan tử ti của người đã cô mội sự thay đổi lớn trong hoạt tĩnh do sự kém tươi của nó Ngoài ra, ứ rưỡng hợp gan chuột có thể cảm ứng chuột bằng hồa chất như phenolbarbinal trước khi tiến hành thụ nhận S9 từ gan,

Như đã để cập đến ở mục trên, có một sổ hỏa chất cần phải được kích

hoạt thì mới thể hiện được khá năng gây đội biến Các hợp chất này có thể được sử dụng để cảm ứng sự tạo nền mội lượng enzyme tham gia vào quá trình ỒXt hỗa trong san, Người ta thường sử dụng phenolbarbital để cảm ứng các enzyrae này Khi so sánh hỗn hợp Š-9 thụ nhận đượu từ con chuột bình thường và chuột thí nghiệm có bố sung phenolbarbital trong nước uống thị Š9 thu nhận

được từ chuột thí nghiệm có khả năng kích hoạt đối với bai loại hóa chất 2-

acetylamiaolluorene' và 4-aminobiphenyl, 5-9 thu nhận được do sự cảm tng bằng 3-methyl-cholanthrene thì cố hoạt tính mạnh gấp 3 lần so với S-9 thu

nhân được do cảm ứng bằng phenolbarbital,

nhận được từ gan người Khi sử dụng nồng độ cao của AAN thì số lượng hồi

biến giảm ởi rõ rệt, Hiện tượng này được giải thích là do hóa chất gây đột biển đã giết chết nhiều vì khuẩn bằng cách làm bất hoạt hóa những gen chủ yếu nằm trên nhiễm sắc thể, Ngoài ra, có thể đã gấy ra những đội biển chuyến khủng trong chúng vì khuẩn thử nghiệm

Thường hóa chất được kích hoạt có khả năng gây đột biến rất mạnh, chí một lượng rất nhỏ đã có thể gây hếi biến, Ví dụ: Ing AAN được kích hoạt bởi

SÒ thư nhận từ gan người có khả năng làm tăng số khuẩn lạc hãi biến ngẫu

nhiên lên gấp đôi (khoảng 2Ö khuẩn lạc), và cử 0,5hg hóa chất sẽ chờ 11.000

khuẩn lạc do hỗi biến

động lên tính chất đi tuyển ở mức độ cập base Phương phấp này có thể được

sử dụng để đánh giá nhiều loại hợp chất khác nhau như đạng chat long, dang

rắn, đang khí hay cả các hợp chất có độc tính cao Ví dụ: nhiều hóa chất dùng

trong công nghiệp, nông nghiệp cho kết quả dương tính trong thử nghiệm Ames nhu ethylene dibromide; mot vat loai thuốc (như isoniazid lá chất ngăn ngừa

bệnh lao) cũng là tác nhân gây đột biến trong thử nghiệm này, Nhiều hợp chất

cố nguồn gốc từ tự nhiên (như safrole) lại được chứng mính là chất có kha nang gay tìng thư,

8 Oui tri

Trung thử nghiệm Ames, mot lugng nhé héa chất kiểm tra được bổ sung vào mối trường agar lông không có chứa histidine, con dich nudi cấy chủng đột

biến S yphimuriam Hịc được cổ định trên mỗi trường tốt thiểu hay tại vị trí

trung lâm cua mdi trường tối thiểu, mội lượng histdine nhỏ còn sót lại trong mỗi trường agar chủ phép tẤt cả các tế bào của vì khuẩn có thể trải qua một vài lấn phân chia Nếu như hóa chất có tác động gây đột biến thi vị khuẩn khả

năng hồi biến và quay về đạng tự dưỡng nên có thể mọc được trên mỗi trường

tối thiểu thành những khuẩn lạc, Chỉ có những khuẩn lạc nào chịu tác động của hóa chất gãy đột biến và bị hồi biến thì mới mọc thành khuẩn lạc rõ rằng Trong khi đó, các tế bào chỉ có vài lẫn phân chia đo sự hiện điện của histidine đạng vết trong mỗi trường thì biểu hiện thành rất nhiều khuẩn lạc nhỏ b tì được gọi tì khuẩn lạc nền Trình tự qui trình thao tác cơ bản là như sau!

BỔ sung cdc chiing ddt bi€n S.typhimurium His (TA 98, TA 100, TA

1535, TA 1537, TA 1538) vao môi trường nutữient broth nuôi ủ qua đêm Việc

đò tìm một ngưỡng nông độ phù hợp cho loại hóa chất cân kiểm tra được tiến

hành trên chủng TA 100, với một khoảng nẵng độ rộng Dịch nuôi cấy vì

khuẩn, hóa chất kiếm tra và hỗn hợp Š-9 hay hỗn hợp co-factor được hòa trộn cùng với soft agar rồi đem bổ sung vào môi trường tối thiểu, Đĩa thạch sau đó

đem lật ngược, ủ Ấm trong khoảng từ 48 ~ 72 giờ, Sau khoảng thời gian nuôi ú

này, kết quả thu được bằng cách đếm những khuẩn lạc hồi biến mọc trên môi trường Có thể thực hiện thêm hai thí nghiệm nữa với nống độ hóa chất được

chọn dựa trên cự sở của nông độ cơ bản Kết quả thu nhận được từ các thí nghiệm kháu nhau cho mỗi loại nắng độ hóa chất được sử đụng sau để sẽ được dem phân tích và tổng hợp lại từ đó sẽ đánh gía được tiểm nầng gây đột biếu vữa hóa chấi khiếm tra.

Collection of Microorganism, JCM)

Các thiết bị cần thiết cho thao tác trên vị sinh như: tủ ấm 37'C, dia petri,

tủ cấy vô trùng, nổi hấp, bể ổn nhiệt, que cấy, đèn côn, ổng nghiệm cối, chây

vô trùng và các vật dụng khác Miột số thiết bị khác như: máy đo QD, máy khuấy từ, buông chiểu ÚV

Äđôi trường nuôi cấy và idng sink

- Môi trường nutrient lỏng có thành phần như sau:

Cao thị : 3% Pepton > 0,5 %

Mai truéng ding trong th nghiém Ames

-_ Môi trường tối thiểu có thành phần như sau:

K;HPO, :Ũ,? #6 KH;PO, :02% Na;-citrate — :0 05%

(NH2;SO, - :01%

22

chấy và chờ khi nhiệt độ xuống 45C

+ Việc chuẩn bị dịch huyển phù tế bão cho thứ nghiệm đòi hỏi mức độ

cẩn thận cao vì người ta nhận thấy rằng kết quả thử nghiệm có sự thay đổi do

ảnh hướng của chất lượng môi trường sử dụng cũng như nhiều yếu tổ khác,

+ Dịch nuôi cấy ví khuẩn dùng cho thứ nghiệm phải được kiếm tra tỉnh

khuyết dưỡng hisudine bằng cách nuõi cấy trên mỗi trường tối thiểu có vã

khong hổ sung histdine Môi trường được bố sung bioun bởi vì ở các dạng đột biến Hix gen tang hợp của bio0n bị mất, Lượng bổ sung là hisddtne 0 ImUdia va biotin O, bmil/dfa

+ Qui trình kiểm tra nhự sau: dùng quc cấy vòng cấy vị khuẩn lên môi trường không bổ sung histidine sau đó lại tiếp thạc cấy lên mỗi trường có

hisidine, ủ ở 37C Kết quá kiểm tra dựa vào sự mọc của ví khuẩn kiểm tra: không được có ví khuẩn mọc trên đĩa đối chứng

Các chủng đột biến được tăng sính bang mdi truting nutrient long Vi khuẩn

được lắc trong khoáng 10 giờ, nhiệt độ 377C cho đến khi mật độ tế bào đạt đến

1-2, 1Ú? tb/ml t xác định bằng phương pháp đo ỚD tại bước sống 65a) Tác chất gây đội biến —ˆ

Ba chất gây đột biển chuẩn là 2-amino acridine (AAC), Sodium azide (NaN) 2-niteofluorene (NF) duoc dling trong cdc khảo sắt qui trình Các chat

gây đột biển khdc nh: nitrosoguanidine, ethidium bromide, aflatoxin BL dude dùng để ứng dụng qui trình

4.Phương pháp

Nhằm mục đích xây dựng qui trình phát hiện các chất có độc tỉnh gây đột biến, ung thư, kết hợp với các tài liệu tham khảo được, trước hết, chúng lỗi

tiến hành các loại thử nghiệm theo các qui trình Ames đã được công bố Tuy

nhiên, thực nghiệm cho thấy, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới tần số đột biến của các chúng vi sinh thử nghiệm Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sắt các

yếu tố ảnh hướng lên tấn số đột biến của tế bào trong thử nghiệm Ảmes Để từ

đó, chúng tôi có thể tìm ra các đữ liệu để xây dựng qui trình thử nghiệm có tỉnh

ổn định cao, tiện lợi cho việc thao tác, ứng dung trong điều kiện thử nghiệm ở nước ta Các yếu tố được chúng tôi quan tầm khảo sát bao gầm mật độ tế bào vị sinh cho một mẫu thử nghiệm, thời gian lưu giữ dịch huyền phù giếng ở 4G, thời gian xử lý hóa chất

Sau khi tìm ra các dữ liệu thích hợp cho gui trình thử nghiệm, chúng tôi xây dựng qui trình thử nghiệm và tiến hãnh kiểm tra qui trình này bằng phương pháp thứ nghiệm với các chất đột biến chuẩn Tiếp theo đó, chúng tôi kiểm chứng độ nhạy và tỉnh ổn định của gui tỉnh vừa xây dựng Bằng cách sử dụng gui tình để phát hiện các chất độc cớ khả năng gầy ung thu va dot biển thưởng gặp trong phòng thí nghiệm và trong sinh hoạt bằng ngày như ethidiumbromide, nitrosoguanidine, aflatoxin,

Nhu da biét, dung dich $9 la dung dịch thu được ở phần đoạn Y ctia dich đẳng nhất gan chugt Trong thứ nghiệm Ames, dụng dịch Š9 giữ vai trò quan trọng trong việc cami Ứng để phát hiện các chất có độc tính gây đột biến, ung thư ở mức thứ cấp, Dung địch S9 có giá thành cao, yêu cầu bảo quản và vận chuyén nghiém ngặt Dung dich S? maa và vận chuyển từ Nhật về rất để bị mất hoạt tỉnh Do vậy, chúng tôi tiến hãnh nghiên cứu nhằm cảm ứng và chỉ tết dung dich S9, kiểm tra tính võ trùng và hoạt tính của dụng dịch Š9 thu được Sử dụng đung dịch S9 vừa thu được cho thử nghiệm

Sau khi chiết dung dịch S9 chúng tôi hoàn tất qui trình thử nghiệm Am và tiến hành ứng dụng qui trình nãy trong việc kiểm tra phát hiện độc tính gây ng thư, đột biển trong các mầu nước thải, mẫu phụ gia thực phẩm,

Các phương pháp thí nghiệm được tiển hành nhữ sâu ' 4.j Khảo sút nh hưởng của mật đã tế bào

Nuôi chủng TA {ĐÓ trong mỗi trường nutrient ling Sau [0-12 giờ nuôi cấy, đo QD ở bước sông 650 am, Phả loãng địch tế bào thành các raật đệ khác nhau, Thực hiện thử nghiệm với NaN; (2us/đĩa môi trường } Khảo sất sự biển

đổi của số khuấn lạc hối biến

4 ?Khảo sát thời gian cho phép bu gu tiöng dạng dịch hụ vều nhù tế bào Ở Ching TA 100 được nuôi trong mỗi trường nutient lỏng, ở 37 ĐC, Sau 10- 12 giờ nuôi cấy, thu nhận sinh khối tế bào và báo quần Ở AC Khao sat sd khuẩn lạc hỗi biển của chúng đội biến này (bằng NaN; như trên) theo thời gian giữ tế bào ở 4°C Xác định thời gian bảo quần cho phép của huyền phù tế bão khi sử dung trong thử nghiệm Ames.

4.3Kháo sát sự hội biến bởi các tác chất gây đột biến chuẩn

Các chủng đột biến TẠ 98, TA 100, TA 1535, TA 1537, TA 1538 được nuôi cấy trong môi trường nutrien! lông trong 10-12 giờ và được gây đột biến

bằng các chất gây đột biến chuẩn theo liêu lượng như sau: NaN; (2ug/đĩa),

AAC (50ug/đĩa) và NF (S0ng/đĩa),

+4 Kháo sút nh hưởng của thời gian xử ly hee chất lên tân số đội biển Nuõi các chủng vi khuẩn thử nghiệm trong môi trường nutriemt lông Sau

10-12 giờ nuối cấy, thực hiện gui trình thử nghiệm với các tác chất đột biến

chuẩn NaN; (2ugiđia), AAC (50ng/đĩa) và NE (SOng/ớdïa) với các thời gian Xử

lý bằng hóa chất lá 10, 20, 3Ó, 40, 50 và 60 phút nhằm xác định mức thời gian để hóa chất có tác động lên vị khuẩn cho tý lệ hồi biển cao nhất

+

.4.5Kiểm chúng quí trình thử nghiệm bằng phương pháp sử dụng môi sỐ túc

chất gêy đột biến và chất có độc tính gây đôi biển thường sắp

Khảo sắt tần số hồi biến theo lượng tác chất gây đội biến (8, 6, 32 v

SOug/đfa) như nitrosoguanidine (thưởng được dùng để gây đột biến vị sinh vật và chất có độc tính gầy dét bién nhu ethidium bromide (thường được sử dụng

để nhuộm DNA trong điện di phân tích DNA trên gel agarose) hay aflatoxin BÍ

là mội chất gây đột biển rất thường gặp trong cuộc sống, Thi nghiệm được thực

hiện với Š chúng S yphimariamn đỘt biển

KẾT QUÁ &THẢO LUẬN

Trong muc này, các yếu tế có khả năng ảnh hưởng tới tẫn số hồi biến

trong thử nghiệm Ames được khảo sát, Các yếu tế như giai đoạn tầng trưởng,

mật độ tế bào, thời gian xử lý hóa chất, thời gian bảo quân đụng dịch giống lẫn lượt được khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố lên tần số hồi biến trên chủng

TA 10 khi được xử lý bằng NaN: Chúng TAẠI100 được chọn trong đa số trưởng hợp này bởi vì đây là chúng có độ nhạy cao, thường được sử dụng trong bước

sàng lọc đối với tất cá hóa chất, NaN; lã chất gây đột biến chuẩn được sứ dụng

trên chúng TAIÔO Riêng trưởng hợp khảo sát ảnh hướng của thời gian xử lý

hóa chất thì tất cá năm chúng đột biển đều được sử dụng Mỗi chủng được thử

nghiệm trên hồa chất chuẩn nêng,

id Anh hưởng giai đoan tầng trưởng của giòng lên tán số hội biên

Trong thí nghiệm này, chúng TA 1ÓO được nuôi cấy trong môi trường Nutrient lông ở điều kiện chuẩn Theo thời gian, địch nuôi cấy được thu mẫu và

được sử dụng để lâm thử nghiệm Ames Kết quả khảo sát được trình bày trên Bảng 6 và Đề thị Ì

Bảng 6 cho thấy thời giun nuôi cấy tuổi của giống Bay giải đoạn tăng

trưởng) có ảnh hưởng đến tần số hồi biến Ở các thời điểm trước 9h nuôi cấy, tần số hồi biến thấp Từ L0h đến lấh tấn số hồi biển cao và khá ổn định Sau

i8h tin số hỏi biến giảm Các thời điểm từ 10h đến l§h là pha ổn định của

chúng, Ở cdc pha log hay pha ổn định trễ, tần sẽ hồi biến thấp cổ thể dơ tế bào quá mẫn cảm với hóa chất (tẾ bào quá trẻ hoặc quá giả) nên nhiều tế bào

Salmonetia His’ bi chét, khOng phat triển thành khuẩn lạc

Bằng 6: Kết quả khủo sảt Ảnh hung của niổi sinh trưởng lên tần sỗ hội biển của các chung S typhimeariunt His