Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống loài củ dòm (stephania dielsiana y c wu) bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng

LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp ngƣời khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập giảng đƣờng đại học đến nay, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ q thầy cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập trƣờng Và đặc biệt, thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em tiến hành thực đề tài: Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống lồi Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Nguyễn Văn Việt tận tâm hƣớng dẫn em thực tập khóa luận Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Để hồn thành tốt khóa luận này, em xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân ln khích lệ động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Bƣớc đầu vào thực tế, có cố gắng đề tài đƣợc thực hạn, thu đƣợc kết định Nhƣng không tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu q thầy bạn để khóa luận em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14, tháng 5, năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Dƣơng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Củ dòm 1.1.1 Nguồn gốc hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố 1.2 Giá trị Củ dòm 1.2.1 Giá trị kinh tế 1.2.2 Giá trị dƣợc liệu 1.3 Tình hình nghiên cứu Củ dòm nƣớc giới 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.4 Phƣơng pháp nhân giống Củ dòm 1.4.1 Nhân giống phƣơng pháp vơ tính 1.4.2 Phƣơng pháp chế biến sử dụng 1.5 Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào 1.5.1 Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào 1.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào 10 PHẦN II MỤC TIÊU – NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Mục tiêu đề tài 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu 13 2.3.1 Đối tƣợng 13 2.3.2 Địa điểm bố trí thí nghiệm 13 ii 2.3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.4.1 Phƣơng pháp luận 14 2.4.2 Phƣơng pháp thực nghiệm 14 2.4.3 Phân tích xử lý số liệu 18 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Tạo mẫu từ cành bánh tẻ Củ dòm 20 3.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh chồi trực tiếp từ lát mỏng 22 3.3 Khả tái sinh chồi từ lát cắt có kích thƣớc khác 25 3.4 Ảnh hƣởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 27 3.5 Ảnh hƣởng ĐHST đến khả rễ tạo hoàn chỉnh 29 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 Kết luận 32 4.2 Tồn kiến nghị 33 4.2.1 Tồn 33 4.2.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Viết đầy đủ BAP Benzylamino purine-6 IBA Indole-3-butyric acid Kinetin Furfuryamino purine NAA Naphthylacetic acid ĐHST Điều hòa sinh trƣởng MS Murashige&Skoog, 1962 WPM Woody plant Medium CTTN Công thức nghiên cứu CTNC Công thức nghiên cứu 10 TB Trung bình 11 NN Nhân nhanh iv C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến kết tạo mẫu 15 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng 16 Bảng 2.3 Nghiên cứu khả tái sinh chồi từ lát cắt có kích thƣớc khác 17 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 17 Bảng 2.5 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ in vitro 18 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% 20 đến kết tạo mẫu 20 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng 23 Bảng 3.3 Khả tái sinh chồi từ lát cắt có kích thƣớc khác 25 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 27 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ tạo hoàn chỉnh 29 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn v C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) (Đỗ Tất Lợi, 2009) Hình 3.2 Chồi tái sinh công thức môi trƣờng 24 Hình 3.3 Chồi tái sinh cơng thức thí nghiệm 26 Hình 3.4 Chồi nhân Củ dịm cơng thức thí nghiệm 28 Hình 3.5 Cây rễ cơng thức thí nghiệm 31 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn vi C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ĐẶT VẤN ĐỀ Nguồn dƣợc liệu ngƣời sử dụng đƣợc tổng hợp nhiều đƣờng khác nhƣ tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song dƣợc liệu quý từ thực vật đƣợc ngƣời sử dụng từ lâu đời nhu cầu ngày lớn Theo thống kê Viện Dƣợc liệu, nhu cầu sử dụng dƣợc liệu nƣớc ta khoảng gần 60 – 80000 tấn/năm Tuy nhiên, loài tự nhiên bị giảm số lƣợng chất lƣợng khai thác mức với điều kiện bất lợi môi trƣờng dẫn đến nhiều quý bị tuyệt chủng, ảnh hƣởng đến nguồn cung cấp dƣợc liệu bền vững cho ngƣời có lồi Củ dịm Cây Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C Wu) vị thuốc nam mang nguồn gen quý đƣợc phát Việt Nam đƣợc ghi Sách đỏ Việt Nam (1996), thuộc họ Tiết dê – Menispermaceae loài thực vật có hoa họ Biển cát, chứa nhiều hoạt chất dƣợc liệu quý Nhiều nghiên cứu Củ dịm có chứa alkaloid bao gồm: L-tetrahydropalmatin (rotundian), stephrin, roemerin, cuycleanin có tác dụng giảm đau, an thần hiệu quả, gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp, điều hịa hơ hấp tim mạch Cepharanthin đƣợc tìm thấy Củ dịm có tác dụng kích thích miễn dịch làm giảm nhẹ cách hữu hiệu tác dụng phụ thuốc chống ung thƣ.[3] Bên cạnh đó, Bun Sok – Siya cộng (2009) phát cepharanthin có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng ung thƣ gan Mặt khác, ức chế phát triển trực khuẩn lao Ngoài ý nghĩa mặt y học, Củ dòm làm vật trang trí, làm cảnh đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng Thế nhƣng Củ dòm nằm nguy cạn kiệt cảnh báo tuyệt chủng cấp VU sách đỏ Việt Nam (2007) nên cần đƣợc nhân giống mở rộng trì nguồn gen quý Vì vậy, mà việc bảo tồn giống Củ dòm cấp thiết có ý nghĩa quan trọng Nhận thức đƣợc việc bảo tồn phát triển loài thuốc quý tiền tiến hành thực nghiên cứu đề tài: Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống lồi Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan Củ dòm 1.1.1 Nguồn gốc hệ thống phân loại Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) thuộc họ Menispermaceae (Tiết Dê), tên khác củ Gà ấp (củ mọc lộ khỏi mặt đất giống gà ấp trứng) Có nguồn gốc Biển Đơng, Nam Châu Á, Trung Quốc Ở Việt Nam, Củ dịm sống vùng núi đá lẫn rừng núi đất, nơi có nhiều đá lộ đầu, thuộc tỷnh Lào Cai, Yên Bái, Hà Tây, Hà Bắc, Quảng Ninh [1,3] Hệ thống phân loại: Giới: Plantase Ngành: Magloliophyta Phân lớp: Magloliosida Bộ: Ranunculales Họ: Menispermaceae Chi: Stephania Loài: Stephania dielsiana Y.C.Wu Hình 1.1 Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) (Đỗ Tất Lợi, 2009) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố Cây Củ dịm mọc hoang dại vùng núi đá, núi đất có nhiều đá lộ đầu, độ cao 300 – 500m Thích hợp nhiệt độ trung bình năm 21 – 230C, lƣợng mƣa 2000 – 2500mm, độ pH = 6,5 – [3] Cây Củ dòm dây leo nhỏ, sống nhiều năm, rễ củ to, thân leo cuốn, dài khoảng 3m, thân non hồng tím nhạt, tồn khơng lơng Lá đơn ngun, mọc so le, có cuống dài 4,5 – 8,5cm Phiến hình tam giác trịn, – 13 x – 13,5cm, mép lƣợn sóng, có tù thƣa phía ngọn, chóp nhọn, gốc lõm, gân xếp dạng chân vịt, xuất phát từ chỗ đính cuống Ngọn no, cuống cuống cụm hoa có dịch màu tím hồng [1,3] Hoa đơn tính khác gốc, hoa đực tụ họp thành tán giả, hoa thành dạng đầu Hoa nhỏ, có cuống ngắn, dài màu tím xếp vịng, vịng cánh hoa hình quạt trịn, hoa có màu vàng cam, cột nhị ngắn Cụm hoa gồm - đầu nhỏ, cuống ngắn, xếp thành dạng đầu Hoa nhỏ, dài màu tím hồng, cánh hoa hình quạt trịn vàng cam có vân tím Bầu hình trứng, đầu nhụy có – thùy dạng dài Quả hình trứng đảo, dẹt Hạt hình trứng ngƣợc cụt đầu, có lỗ thủng giữa, lƣng hạt có hàng gai nhọn, cong [1] Mùa hoa tháng - 5, tháng – 7, mọc chồi thân từ cổ rễ vào đầu mùa xuân Sau bị chặt phá, phần cịn lại có khả tái sinh Cây ƣa ẩm, ƣa sáng chịu bóng Thƣờng mọc rừng kín thƣờng xanh ẩm trở nên thứ sinh, gặp rừng núi đá vôi (Tuyên Quang), độ cao 300 - 600m [1] Củ dịm nƣớc ta có phân bố rộng rãi đặc biệt miền Bắc, tập trung vùng núi đá vôi thuộc tỷnh Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang, Chiêm Hóa), Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hà Giang, Hà Tây, Quảng Nam Sự phân bố khác tùy theo đặc tính sinh học Trên giới thƣờng có ở: Trung Quốc, Nam Châu Á vùng Biển Đông [1,3] Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1.2.Giá trị Củ dòm 1.2.1 Giá trị kinh tế Cây Củ dòm loại thuốc nam mọc tự nhiên số vùng nƣớc ta, dạng thân leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện tự nhiên Việt Nam Cây phát triển tốt điều kiện khơ cằn, vùng đất đá mà khơng cần tốn cơng chăm sóc hay kỹ thuật canh tác cao nhƣng mang lại giá trị kinh tế cao cho ngƣời trồng Hiện nay, giá 1kg Củ dòm tƣơi 120000 – 150000VND Cây Củ dịm đƣợc coi trồng “Xóa đói giảm nghèo” ngƣời dân tộc vùng cao Bên cạnh đó, có tiềm lớn y học, nguồn nguyên liệu cho ngành dƣợc học Tuy nhiên, trƣớc việc khai thác ạt ngƣời dân loại quý dần cạn kiệt có nguy tuyệt chủng tự nhiên 1.2.2 Giá trị dược liệu Cây Củ dòm thuộc họ Menispermaceae chứa nhiều chất có giá trị dƣợc liệu có tác dụng nhiệt, giải độc Hoạt chất chứa alkaloid bao gồm L-tetrahydropalmatin (rotundian), stephrin, roemerin, cycleanin Ngồi cịn có tinh bột đƣờng khử oxygen, acid malic, men oxidase Trong quan trọng L-tetrahydropalmatin (rotundian) roemerin cepharanthin Rotundin có tác dụng giảm đau, an thần hiệu quả, điều hịa hơ hấp tim mạch Hàm lƣợng chất có Củ dịm tƣơi khoảng 0,12 – 0,3% [6,7] Theo kinh nghiệm y học cổ truyền, Củ dòm đƣợc dùng dƣới dạng thuốc sắc hay ngâm rƣợu để chữa bệnh ngủ, sốt, đau đầu, sốt rét, phù thũng, đau lƣng, chân tay nhức mỏi, đau bụng, đau dày, kiết lỵ, đại tiện máu Cách chế biến sử dụng Củ dòm: đào củ đem rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô Dƣợc liệu có màu nâu, vị chát, đắng tê, tính ấm, khơng độc Liều dùng ngày: – 8g sắc với 200ml nƣớc 50ml, uống làm lần ngày, ngâm rƣợu uống với tỷ lệ 1/10 [14] Trong y học đại, hoạt chất L-tetrahydropalmatin (hyndarin, gindarin) chiết từ củ Củ dịm có tác dụng đặc hiệu số trƣờng hợp loạn tâm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 12 Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ Lê Mai Phƣơng (2009) Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào 10 hợp chất phân lập từ số loại Bình vơi (Stephania Lour) Việt Nam” Tạp chí Dƣợc học trang 54- số 12 13 Bùi Văn Lệ cs (2003) tiến hành nghiên cứu tạo chồi từ lát mỏng tTCL vùng đốt thân Điều mơi trƣờng MS có bổ sung BAP với nồng độ thay đổi 1- 10 mg/l 14 Đỗ Tất Lợi (2009) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học 15 Nguyễn Kim Liễn (2011) Nghiên cứu đặc điểm phân bố thử nghiệm nhân giống lồi Củ dịm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) vƣờn quốc gia Ba vì, Hà Nội Luận văn Thạc sỹ - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp 16 Nguyễn Hoàng Lộc (2011) Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nxb Đại học Huế 17 Nguyễn Vũ Minh, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Trần Việt Hùng (2014) Phân lập xác định cấu trúc thailandin từ loài Củ dịm (Stephania diesiana Y.C Wu) Tạp chí Dƣợc liệu trang 55 – Số 12 18 Nguyễn Vũ Minh, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Trần Việt Hùng (2014) Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu oxostephanin dùng kiểm nghiệm nghiên cứu dƣợc liệu Củ dòm (Stephania diesiana Y.C Wu) Tạp chí Dƣợc liệu trang 54 – số 8.Luận văn Thạc Sỹ - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp 19 Hoàng Ngọc Nhung, Toyoki Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Vũ Ngọc Anh Nguyễn Lê Anh Thƣ (2012) Nghiên cứu phát triển quan lớp mỏng tế bào thực vật đƣơng quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) nuôi cấy in vitro Tạp trí sinh học số 34 , trang 106 – 204 20 Đỗ Văn Thịnh (2005) Công nghệ sinh học ứng dụng Nxb Nông nghiệp 21 Nguyễn Quang Thạch (2009) Cơ sở Công nghệ Sinh học – tập Nxb Giáo dục 22 Nguyễn Quang Thạch (2009) Cơ sở Công nghệ Sinh học – tập Nxb Giáo dục 23 Nguyễn Tiến Thân (2003) Kiểm nghiệm Dƣợc liệu phƣơng pháp hiển vi Nxb Khoa học Kĩ thuật 24 Nguyễn Tiến Vững (2000) Nghiên cứu thực vật, hóa học tác dụng sinh học sơ lồi thuộc chi Stephania Lour Việt Nam Luận án Tiến sĩ Dƣợc học - Trƣờng Đại học Dƣợc 25 Nguyễn Văn Vinh, Trịnh Ngọc Nam (2011) Nghiên cứu nhân giống in vitro khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ Bình Vơi (Stephania Rotunda Lour) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ số 49, trang 51 – 58 26 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009) Công nghệ sinh học – tập Nxb Giáo dục Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 27 Behera K.K., Pani D and Shahoo S (2010) Effect of pkant growth regulator on in vitro multiplucation of turmeric (Curcumar longa L.cv.Ranga) Internationla Journal of Biological Technology, 1(1):pp16 – 23 28 Banna Chatoopadhaya., Joydeep Banerjee., Asitava Basu., Soumitra K Sen., Mrinal K Maiti (2010) Shoot induction and regeneration using intermodal transvers thin cell layer in Sesamun indicum L; Plant Biotechnology Rep (2010) 4; pp 173 – 178 29 Duong Tan Nhut, Kiem Tran Thanh Van, B Van Le, Thorpe, T.A (Eds.) 2003 Thin Cell Layer Culture System: Regeneration and Transformation Applications Springer Holland 1; pp XI, 517 30 P Azadi., K Bagheri, M Gholami., M Mirmasoumi., A Moradi & A Sharafi (2016) Thin Cell Layer, a Suitable Explant for in vitro Regeneration or Saffron (Croucus Sativus L.) ; Joumal of Agricultural Science and Technology; Article 18, Volome 19, number 6, Page 1429 – 1435 31 Joanne T Blanchfield, Donal P.A Sands, Colin H.L Kennard, Karl A Byriel, William Kiching (2003) Characterisation of alkaloids from some Australian Stephania (Menispermaceae) species, Phytochemistry, 63(6), pp 717-720 32 Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada Masao Tomia (1984) A major akaloid of the leaves and stems of Stephania Rotunda Science and Technology of Kyoto pharmaceutial University, Misasagy, yamasbina – ku Kyoto Japan 8,pp 606 33 Yecheng Deng, Yanzhen Yu, Haiyu Luo, Ming Zhang, Xu Qin, Lifeng Li (2011) Antimicrobial activity of extract and two alkaloids from traditional Chinese medicinal plant Stephania dielsiana Food Chemistry, 124(4), pp1556 – 1560 34 Zhang Yi, Zhang Sheng, Zhang Hai-Yan, Shen Zheng-wu, Qin Guo-Wei (2009) Chemical constituents from the roots of Stephania dielsiana Chinese Journal of Natural Medecinese 7(3), pp99-202 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ BIỂU Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 01 Môi trƣờng MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) Các thành phần môi trƣờng mg/l 1900 KN 1650 O 370 170 332 6,2 O 22,3 8,6 0,25 O 0,025 0,025 O EDTA 27,8 37,3 Glycin Myo-Inositol 100 Thiamine HCl 0,1 Axit nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 02 Môi trƣờng WPM (Woody Plant Medium) Thành phần môi trƣờng Hàm lƣợng (mg/l) NH4NO3 400 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H20 556 MnSO4.7H2O 370 K2NO4 990 KH2PO4 170 Na2EDTA 37,5 CuSO4.5H2O 0,25 MnSO4.H2O 22,3 H3BO3 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.H2O 8,6 Myo- Inositol 100 Glycine Acid nicotinic 0,50 B1 0,1 B6 1,0 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 03 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu Củ dòm CTTN Thời gian khử trùng cồn 70% ( phút) Thời gian khử trùng HgCl2 0,1%(phút) KT0 0 KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Số lần thí nghiệm Tỷ lệ mẫu (%) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) TB TB TB TB TB TB TB 0 0 21,31 22,51 22,51 22,11 31,52 32,31 32,31 32,04 61,23 62,41 62,41 62,01 72,34 72,51 72,51 72,45 85,41 86,24 86,24 85,96 86,12 86,34 86,34 86,26 0 0 15,52 16,43 16,43 16,12 21,34 22,43 22,43 22,06 45,78 50,12 50,12 48,67 61,23 62,16 62,16 61,85 70,12 71,3 71,21 70,84 25,76 30,12 30,12 28,67 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 04 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng CTTN Số lần thí nghiệm Số mẫu tái sinh Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) MT1 TB TB TB 15 16 17 16 10 50 53,33 56,66 53,33 26,66 30 33,33 30 MT2 MT3 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Chiều cao TB/chồi (cm) 0,8 1,2 0,4 0,5 0,6 0,5 0,2 0,3 0,4 0,3 Đặc điểm chồi ++ ++ ++ ++ + + + + 16,66 20 23,33 20 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 05 Khả tái sinh chồi từ lát cắt có kích thƣớc khác CTTN MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Số lần thí Số mẫu tái Tỷ lệ mẫu tái Chiều cao nghiệm sinh sinh (%) chồi (cm) 10 33,33 0,9 12 40 15 50 1,2 TB 12,33 41,1 1 14 46,67 15 50 1,2 17 56,67 1,4 TB 15,33 51,11 1,2 17 56,6 1,7 18 60 1,9 20 66,66 1,9 TB 18,3 61,10 1,8 11 36,66 1,2 12 40 1,3 13 43,33 1,4 TB 12 40 1,3 26,6 0,7 30 0,9 30 0,9 TB 8,67 28,9 0,8 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 06 Ảnh hƣởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi CTTN NN1 NN2 NN3 NN4 NN5 Số lần thí Số chồi sau Số chồi Chiều cao TB nghiệm NN(chồi) TB/mẫu (cm) 40 2,5 41 3 41 TB 40,67 1,67 2,83 61 62 3,5 62 3,5 TB 61,67 2,3 3,3 91 3,5 92 92 4 TB 91,67 3,3 3,83 71 72 3 72 3 TB 71,67 2,3 42 2,5 43 2,5 43 2,5 TB 42,67 1,67 2,5 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 07 Ảnh hƣởng ĐHST đến khả tạo rễ CTTN Số lần thí Số chồi Tỷ lệ Chiều dài Số rễ Đặc nghiệm rễ rễ(%) rễ (cm) TB/chồi điểm R0 R1 R2 R3 R4 0 0 - 0 0 - 0 0 - TB 0 0 - 16 53,3 0,5 + 18 60 0,5 + 20 66,67 + TB 18 60 0,6 2,3 + 27 90 ++ 27 90 ++ 28 93,33 2,5 ++ TB 27,67 92,22 2,16 3,67 ++ 21 70 1,5 + 22 73,33 + 23 76,67 2,5 + TB 22 73,33 + 15 50 1,5 + 16 53,3 1,5 + 17 56,67 + TB 16 53,33 1,67 2,3 + Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 08 Kết xử lý phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 cồn 700 đến khả tạo mẫu Groups Count Sum Average Variance CTTN KT0 0 KT1 66.33 22.11 0.48 KT2 96.14 32.04667 0.208033 KT3 186.05 62.01667 0.464133 KT4 217.36 72.45333 0.009633 KT5 257.89 85.96333 0.229633 KT6 258.8 86.26667 0.016133 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 26966.72 3852.388 12800.94 Within Groups 4.815133 16 0.300946 Total 26971.53 23 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 9.16E-29 2.657197 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 09 Kết xử lý phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng Anova: Single Factor SUMMARY Groups CTTN MT1 MT2 MT3 ANOVA Source of Variation Count Sum Average Variance 48 16 27 18 SS df Between Groups Within Groups 314.25 8 Total 322.25 11 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn MS 104.75 F 104.75 P-value F crit 9.25E07 4.066181 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 10 Kết xử lý phƣơng sai nhân tố khả tái sinh chồi từ lát cắt có kích thƣớc khác Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count CTTN MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 3 3 3 ANOVA Source of Variation SS Sum Average Variance 37 12.33333 6.333333 46 15.33333 2.333333 54 18 36 12 26 8.666667 0.333333 df MS F Between Groups Within Groups 468.2778 24 93.65556 46.82778 12 Total 492.2778 17 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn P-value F crit 1.85E07 3.105875 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ biểu 11 Kết xử lý phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count CTTN NN1 NN2 NN3 NN4 NN5 3 3 3 ANOVA Source of Variation SS Sum 122 185 275 215 128 Average 40.66667 61.66667 91.66667 71.66667 42.66667 Variance 0.333333 0.333333 0.333333 0.333333 0.333333 df MS F Between Groups Within Groups 14306.28 5.333333 2861.256 6437.825 12 0.444444 Total 14311.61 17 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn P-value F crit 3.93E20 3.105875 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn