(Luận văn) nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (citrus grandis l ) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ XUÂN lu an n va p ie gh tn to NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN (CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2017 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ XUÂN lu an n va p ie gh tn to NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN (CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO d oa nl w Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 nf va an lu z at nh oi lm ul LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Ngà z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2017 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017 Tác giả luận văn lu an Hoàng Thị Xuân n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thu Ngà tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong q trình nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phịng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập lu an hồn thành luận văn n va Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, tất thầy cơ, bạn bè động tn to viên, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình học tập hồn thành Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong p ie gh luận văn oa nl tốt w nhận đóng góp quý báu từ thầy cô bạn bè để có kết d Tơi xin chân thành cảm ơn! an lu Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017 nf va Tác giả luận văn z at nh oi lm ul Hoàng Thị Xuân z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề lu Mục tiêu nghiên cứu an Nội dung nghiên cứu va n Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU gh tn to 1.1 Nguồn gốc phân loại bưởi 1.1.1 Nguồn gốc ie p 1.1.2 Phân loại nl w 1.1.3 Đặc điểm hình thái d oa 1.2.4 Cây bưởi Diễn an lu 1.2 Thành phần hóa học giá trị sử dụng bưởi nf va 1.2.1 Thành phần hóa học lm ul 1.2.2 Giá trị sử dụng bưởi 1.3 Một số giống bưởi chủ yếu giới Việt Nam z at nh oi 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam z 1.4 Tình hình sản xuất bưởi giới Việt Nam 10 @ gm 1.4.1 Tình hình sản xuất bưởi giới 10 co l 1.4.2 Tình hình sản xuất bưởi Việt Nam 11 m 1.5 Kĩ thuật nhân giống in vitro 13 an Lu 1.6 Một số thành tựu nhân giống có múi 19 n va ac th iii si Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu hóa chất 22 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22 2.2 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3.Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 23 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 23 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 26 lu Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 an 3.1 Kết khử trùng hạt bưởi Diễn 27 va n 3.2 Kết tạo chồi in vitro bưởi Diễn 28 tn to 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến phát sinh chồi mẫu cấy 29 ie gh 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy 32 p 3.2.3 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy 34 nl w 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi d oa bưởi Diễn 36 an lu 3.4 Kết tạo bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh 39 nf va 3.4.1 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 39 lm ul 3.4.2 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 41 3.5 Kết vườn ươm 42 z at nh oi 3.5.1 Giai đoạn bầu đất 42 3.5.2 Ra vườn ươm 44 z Kết luận 46 @ l gm Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 m co an Lu n va ac th iv si DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an 2,4-D : 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid BAP : 6-Benzyl Amino Purin Cs : Cộng ĐC : Đối chứng MS : Murashige - Skoog (1962) IAA : Indoly Acetic Acid IBA : Indoly Butyric Acid NAA : α - Napthalen Acetic Acid GA3 : Gibberellin Kinetin : 6-furturylamino purine n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th iv si DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ăn có múi Việt Nam giai đoạn 2010- 2014 12 Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng javen đến nảy mầm hạt bưởi Diễn (sau tuần) 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi mẫu cấy 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy mẫu cấy 35 lu an Bảng 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn 37 n va Bảng 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tn to tuần) 40 ie gh Bảng 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 41 p Bảng 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi nl w Diễn in vitro (sau tuần) 43 d oa Bảng 3.9 Kết vườn ươm 44 nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt bưởi Diễn (sau tuần) 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP tới phát sinh chồi mẫu cấy (sau tuần) 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin đến phát sinh chồi mẫu cấy (sau tuần) 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn (sau lu an tuần) 38 va n Hình 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh chồi bưởi Diễn 40 tn to Hình 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau ie gh tuần) 42 p Hình 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi nl w Diễn in vitro (sau tuần) 43 d oa Hình 3.9 Cây bưởi Diễn in vitro trồng vườn ươm 44 nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây Bưởi (Citrus grandis L.) loại ăn thương mại chủ lực, có lịch sử phát triển lâu đời nước ta Do có phổ thích nghi rộng nên trồng khắp vùng sinh thái nước từ Bắc vào Nam tạo nên vùng đặc sản tiếng như: Bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Diễn (Từ Liêm, Hà Nội), bưởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bưởi Da Xanh (Bến Tre), bưởi Đỏ (Thanh Hóa), bưởi Năm Roi,… Mỗi loại bưởi có hương vị đặc trưng riêng Diện tích sản lượng bưởi tăng không tạo cảnh quan đẹp, góp phần bảo vệ mơi trường sinh lu thái bền vững, nâng cao hiệu kinh tế cho nơng hộ mà cịn đáp ứng nhu cầu xuất an khẩu, tạo điều kiện chuyển dịch cấu kinh tế nơng nghiệp, thực cơng nghiệp va n hóa, đại hóa nơng nghiệp nơng thơn Nhiều nhà vườn trồng bưởi sau - năm gh tn to thu lãi 40 - 100 triệu đồng/ha, suất cao tới 250 quả/cây vườn có mật độ khoảng 1000 - 1200 cây/ha [8] ie p Cây bưởi loại ăn quý, có giá trị dinh dưỡng cao Trong lá, hoa, nl w vỏ chứa nhiều tinh dầu; vỏ bưởi cịn có pectin, narigin, men tiêu hóa d oa peroxydaza, amilaza,… Quả bưởi có vị mát, chứa nhiều vitamin, chất khống an lu cần thiết cho thể người [23] Chính vậy, bưởi cịn dược liệu nf va quan trọng có nhiều ứng dụng y học cổ truyền dân tộc Bưởi thuộc loại ăn lâu năm chịu ảnh hưởng rõ điều kiện ngoại lm ul cảnh, biểu qua sinh trưởng, phát triển, suất phẩm chất Hiện z at nh oi nay, Việt Nam nhiều nước giới rơi vào tình trạng nguồn gen ăn dần suy giảm, đặc biệt loại ăn quý Đứng trước việc z thị hóa, giới thiệu giống trồng biến đổi khí hậu, nguy xói mịn @ gm nguồn gen diễn nhanh chóng Diện tích ăn phá hàng năm l khơng nhỏ cịn gặp nhiều khó khăn dịch bệnh chất lượng giống Nhiều m co nông trại sản xuất giống áp dụng phương pháp truyền thống như: chiết cành, an Lu ghép cành, gieo hạt, [3], [15] Tuy nhiên giống xuất vườn chưa cao, thời gian sinh trưởng kéo dài, kết đạt không ổn định, chất lượng không n va ac th si Qua bảng 3.4 nhận thấy, kết cơng thức thí nghiệm có khác tiêu nghiên cứu Số chồi/mẫu chiều cao chồi tăng tỉ lệ thuận với nồng độ kinetin tăng dần từ 0,3 đến 0,5mg/l Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ kinetin khả phát sinh chồi giảm Hiệu tạo chồi tốt môi trường MS bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + BAP 5mg/l + kinetin 0,5mg/l, sau tuần, số chồi/mẫu 1,72, chiều cao chồi 0,69cm; Sau tuần số chồi/mẫu 3,03 (cao 1,63 lần so với đối chứng), chiều cao chồi 1,70 (cao 1,36cm so với đối chứng), sau tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu 4,47 (cao 2,40 lần so với đối chứng), chiều cao chồi 2,27 (cao 1,36cm so với đối chứng) Ở nghiên cứu chúng tôi, nồng độ BAP kết hợp với kinetin tối ưu cho lu tạo đa chồi cao so với kết nghiên tác giả Komal G (2013) nhân an giống chanh không hạt (Citrus limon) [36] Sự khác biệt hàm lượng chất va n kích thích sinh trưởng nội sinh giống khác nhau, sử dụng nguồn hóa So sánh kết thí nghiệm cơng thức bổ sung chất kích thích sinh ie gh tn to chất khác p trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP kinetin tổ hợp BAP kinetin), mơi nl w trường bổ sung BAP cho hiệu tạo đa chồi chất lượng chồi tốt (hình 3.2) oa Mặt khác, môi trường thông dụng nuôi cấy, giảm giá thành giảm chi d phí mơi trường ni cấy Mơi trường bổ sung kinetin, hiệu tạo đa chồi chất lu nf va an lượng chồi (hình 3.3) Do đó, xếp hệ số tạo đa chồi bưởi Diễn mơi trường bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin theo thứ tự lm ul là: BAP > BAP +kinetin > kinetin z at nh oi 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn GA3 thực vật hormon sinh trưởng giúp kích thích kéo dài thân ngun vẹn, vươn dài lóng, kích thích phân chia tế bào z @ Từ đặc tính điển hình GA3, chúng tơi tiến hành thăm dò ảnh hưởng l gm GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy GA3 với nồng độ thay đổi co m Trong thí nghiệm sử dụng chồi đạt chiều cao 1,5- 2,5cm cấy an Lu chuyển sang môi trường MS bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + GA3 thay đổi nồng n va ac th 36 si độ Môi trường đố i chứng MS + đường 30g/l + agar 9,0g/l Sau ngưỡng thời gian thí nghiệm, theo dõi đánh giá kết thu bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn GA3 (mg/l) ĐC CT1 0,3 CT2 CT3 CT4 0,5 0,7 0,9 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 lu Công thức Chiều cao chồi (cm) Sau tuần 1,53 ± 0,50 1,86 ± 0,57 an n va Chiều cao chồi 3,17 ± 0,55 3,33±0,88 + + 2,51±0,82 2,36±0,70 1,84±0,67 4,27±1,12 4,27±0,83 3,50±1,20 ++ ++ + 0,3 Sau tuần 1,69 ±0,53 2,36± 0,60 3,49 ±0,77 5,25±1,23 + ++ 0,5 0,7 0,9 3,65±0,84 3,55±0,65 2,46±0,71 7,86±1,13 5,23±0,94 5,73±0,97 +++ +++ ie gh tn to Số lá/chồi p Sau tuần ĐC 2,17±0,55 4,19±0,80 + CT1 0,3 3,73±0,61 6,62±1,57 ++ CT2 0,5 4,78±1,06 8,59±1,86 +++ CT3 0,7 3,81±0,82 5,36±0,93 +++ CT4 0,9 2,95±0,70 4,43±1,20 ++ Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá, màu xanh nhạt; (++) chồi mập, nhiều lá, màu d oa nl w nf va an lu lm ul xanh; (+++) chồi mập, cao, nhiều lá, màu xanh đậm z at nh oi Qua bảng 3.5 cho thấy, tất công thức, bổ sung GA3 vào môi trường nuôi cấy dẫn đến tượng chiều cao chồi tăng so với đối chứng Điều chứng z tỏ GA3 có ảnh hưởng đến kéo dài chồi bưởi Diễn Ở môi trường đối chứng, @ gm chiều cao chồi tăng chậm Sau tuần, chiều cao chồi 1,53cm; sau tuần, chiều cao l chồi 2,17cm Trên mơi trường có bổ sung GA3, chiều cao chồi bưởi Diễn tăng m co dần tăng nồng độ GA3 từ 0,3 đến 0,5mg/l Ở môi trường có bổ sung GA3 0,5mg/l an Lu đạt hiệu kéo dài chồi tốt Sau tuần chiều cao chồi 2,51cm, sau tuần, chiều cao chồi tăng đến 4,78cm (tăng 2,61cm so với đối chứng) Ở công thức khác, n va ac th 37 si sau tuần, chiều cao chồi tăng từ 1,84- 2,36cm; sau tuần, chiều cao chồi tăng từ 2,95- 3,81cm lu ĐC GA3 0,3mg/l an n va p ie gh tn to d oa nl w GA3 0,9mg/l nf va an lu GA3 0,5mg/l Hình 3.5 Ảnh hưởng GA3 đến kéo dài chồi bưởi Diễn lm ul (sau tuần) z at nh oi Đối với tiêu theo dõi số lá/chồi, môi trường bổ sung GA3 tăng từ 0,30,9mg/l, sau tuần số lá/chồi tăng từ 3,33- 4,27 cao so với đối chứng Sau z tuần, kết thí nghiệm tốt quan sát thấy mơi trường thí nghiệm có bổ sung @ gm GA3 0,5mg/l Như vậy, môi trường tối ưu cho kéo dài chồi bưởi Diễn môi l trường MS + đường 30g/l + agar 9g/l + GA3 0,5mg/l Trên môi trường m co tiêu theo dõi cao cơng thức nghiên cứu cịn lại an Lu Kết phù hợp với kết nghiên cứu môi trường kéo dài chồi Mohammad H cs (2013), tái sinh in vitro cam chua (Citrus n va ac th 38 si aurantium L.) kết luận, mơi trường MS có bổ sung GA3 0,5mg/l cho hiệu kéo dài chồi tối ưu [37] 3.4 Kết tạo bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh Tác dụng rõ rệt auxin phân hóa tế bào khả phát sinh rễ kiểm chứng từ năm 1934 Nhiều kết nghiên cứu cho thấy vai trò IBA α-NAA tác động đến trình phát sinh rễ [10] Để chồi in vitro bưởi Diễn phát triển thành hoàn chỉnh ống nghiệm, chúng tơi thăm dị ảnh hưởng riêng rẽ IBA α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn 3.4.1 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn lu Các chồi in vitro bưởi Diễn có chiều cao từ - 4cm, -5 an va sử dụng để thăm dị mơi trường ni cấy Sử dụng mơi trường MS bản + đường n 30g/l + agar 9,0g/l + IBA thay đổi nồng độ Môi trường đố i chứng MS bản + Kết bảng 3.6 hình 3.6cho thấy, mơi trường có bổ sung IBA ie gh tn to đường 30g/l + agar 9,0g/l Kết thu trình bày bảng 3.6 hình 3.6 p cho tiêu theo dõi cao đối chứng Sau tuần, số rễ trung bình đạt nl w từ 0,55-1,23 rễ/chồi, sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 0,75-2,41 rễ/chồi; sau tuần, oa số rễ trung bình đạt từ 0,90-2,70 rễ/chồi Trong đó, mơi trường bổ sung IBA d 0,7mg/l cho hiệu qủa tạo rễ tốt Sau tuần, số rễ trung bình đạt 2,70 lu nf va an rễ/chồi (tăng 1,17 lần so với đối chứng) Nồng độ IBA ảnh hưởng đến phát triển chiều dài rễ bưởi lm ul Diễn Chiều dài trung bình rễ tăng dần nồng độ IBA môi trường nuôi z at nh oi cấy tăng từ 0,3 - 0,5mg/l Chiều dài trung bình rễ tăng cao mơi trường có bổ sung IBA nồng độ 0,7mg/l, đạt 3,72cm Khi tiếp tục tăng nồng độ IBA chiều dài trung bình rễ giảm z m co l gm @ an Lu n va ac th 39 si Bảng 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tuần) Công thức IBA (mg/l) Số rễ/chồi Chất lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Sau tuần ĐC CT1 CT2 0,3 0,5 0,73±0,08 1,00±0,09 0,75±0,08 1,48±0,04 + + CT3 CT4 0,7 0,9 1,23±0,27 0,55±0,05 1,60±0,05 1,55±0,07 ++ + Sau tuần 0,3 0,5 1,07±0,12 1,18±0,16 1,77±0,11 2,35±0,36 ++ ++ CT3 CT4 0,7 0,9 1,41±0,20 0,75±0,07 3,63±0,51 1,71±0,12 +++ + lu ĐC CT1 CT2 an n va gh tn to Sau tuần ie p ĐC 0 CT1 0,3 1,67±0,21 1,90±0,14 ++ CT2 0,5 1,70±0,13 2,32±0,34 +++ CT3 0,7 2,70±0,04 3,72±0,20 +++ CT4 0,9 0,90±0,09 0,92±0,08 + Ghi chú: (+) rễ ngắn, nhỏ, khơng có rễ phụ, màu trắng; (++): rễ ngắn, màu trắng d oa nl w nf va an lu xanh; (+++): rễ mập, dài, có rễ phụ, màu trắng xanh z at nh oi lm ul z co l gm @ ĐC m IBA 0.7mg/l an Lu Hình 3.6 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh chồi bưởi Diễn n va ac th 40 si Xét đồng thời tiêu theo dõi thí nghiệm chúng tơi cho thấy môi trường tối ưu nồng độ nghiên cứu cho việc tạo rễ bưởi Diễn môi trường bổ sung IBA 0,7mg/l Trên môi trường này, số rễ/chồi đạt 2,07, chiều dài trung bình 3,72cm, bề mặt rễ sần xùi, có nhiều rễ phụ, màu xanh nhạt 3.4.2 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn NAA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trưởng dãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ [10] Dựa đặc tính NAA, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn Thí nghiệm tiến hành cơng thức có bổ sung α- lu NAA nồng độ khác an Bảng 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn n va Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 0,38±0,11 0,47 ±0,03 + CT2 0,5 0,88±0,15 0,91 ±0,02 ++ CT3 0,7 0,53±0,10 0,52 ±0,04 ++ CT4 0,9 0,52±0,08 0,29 ±0,08 + Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 0,73 ±0,11 1,59 ±0,13 +++ CT2 0,5 2,00 ±0,06 1,55 ±0,25 +++ CT3 0,7 1,16 ±0,10 1,94 ±0,11 +++ CT4 0,9 0,88 ±0,08 0,95 ±0,11 + Sau tuần ĐC 0 CT1 0,3 1,32 ±0,14 2,08 ±0,15 ++ CT2 0,5 2,80 ±0,17 2,85 ±0,32 +++ CT3 0,7 1,68 ±0,17 2,36 ±0,15 +++ CT4 0,9 1,40 ±0,06 1,42 ±0,10 ++ Ghi chú: (+): rễ ngắn, nhỏ, màu trắng; (++): rễ ngắn, màu trắng xanh; (+++): rễ p ie gh tn to α-NAA (mg/l) Công thức d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu dài mập, màu trắng xanh n va ac th 41 si ĐC α-NAA 0,5mg/l Hình 3.7 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ bưởi Diễn (sau tuần) Kết bảng 3.7 rằng, môi trường bổ sung α-NAA tiêu số rễ lu trung bình chiều dài rễ tăng so với môi trường không bổ sung α-NAA Sau an va tuần nuôi cấy, số rễ trung bình đạt từ 1,32- 2,8, chiều dài rễ tăng từ 1,42- 2,85 n cm Bề mặt rễ xốp, rễ mập, khỏe, màu trắng xanh to gh tn Có thể thấy, mơi trường có bổ sung α-NAA nồng độ 0,5mg/l cho tiêu theo dõi thí nghiệm tốt nồng độ nghiên cứu Trên môi trường ie p này, rễ bưởi Diễn khỏe, mập, sinh trưởng phát triển nhanh nl w So sánh kết nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ IBA α-NAA đến oa phát sinh rễ bưởi Diễn nhận thấy, môi trường tạo chất lượng d rễ tốt Nếu nghiên cứu tạo hoàn chỉnh mang đặc điểm hình thái rễ bưởi lu nf va an (có rễ rễ bên), mơi trường bổ sung IBA phù hợp Nếu nghiên cứu tạo số lượng rễ nhiều mơi trường bổ sung α-NAA thích hợp kĩ thuật tạo lm ul rễ bưởi Diễn 3.5.1 Giai đoạn bầu đất z at nh oi 3.5 Kết vườn ươm Việc lựa chọn giá thể phù hợp để vườn ươm phải thực tỉ mỉ z cẩn thận, khâu định đến thành cơng q trình ni cấy in vitro @ gm Giá thể phù hợp giá thể cho tỉ lệ sống cao, sinh trưởng phát triển tốt co l Trong điều kiện in vitro, ni cấy mơi trường có đầy đủ m chất dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo vô trùng Khi đưa trồng giá thể an Lu vườn ươm, phải sống tự dưỡng, xung quanh môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên Do vậy, huấn luyện in vitro giúp chuyển từ trạng n va ac th 42 si thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, đưa trồng môi trường tự nhiên tự dưỡng mà khơng ảnh hưởng đến sinh trưởng [23] Đất thịt trung bình giữ nước, nhiệt, khơng khí, tơi xốp thuận lợi cho q trình lý hố xảy đất Mặt khác, dễ cày bừa, làm đất Độ pH từ 5,5 đến 6,5, thích hợp cho sinh trưởng phát triển thuận lợi bưởi Diễn [4] Các in vitro đạt chiều cao - cm,mọc - lá,2 - rễ, chiều dài rễ đạt - 3cm, rễ mập đủ tiêu chuẩn đưa vườn ươm Chúng tiến hành đưa in vitro khỏi môi trường, rửa agar bám rễ Sử dụng loại giá thể để trồng thăm dò: cát vàng + trấu hun (tỉ lệ 1:1); đất thịt trung bình + trấu hun (tỉ lệ 6:4); đất thịt trung bình lu Kết thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống an bưởi Diễn trồng giá thể sau tuần chăm sóc trình bày bảng 3.8 va n Bảng 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng bưởi Diễn to gh tn in vitro (sau tuần) Giá thể Chất lượng 61,70 + 93,56 +++ 79,23 ++ ie Tỉ lệ sống (%) p Cát vàng + trấu hun (1:1) nl w Đất thịt trung bình + trấu hun (6:4 ) d oa Đất thịt trung bình lu an Ghi chú: (+): vàng nhạt, rụng, không phát triển; (++): xanh nhạt, nf va không phát triển; (+++): xanh đậm, sinh trưởng bình thường z at nh oi lm ul z Đất thịt trung bình + trấu Đất thịt trung bình co hun (6:4) l gm @ Cát vàng + trấu hun (1:1) m Hình 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng an Lu bưởi Diễn in vitro (sau tuần) n va ac th 43 si Kết bảng 3.8 hình 3.8 cho thấy, loại giá thể khác cho tỉ lệ sống chất lượng khác rõ rệt Tỉ lệ sống giá thể sau tuần trồng dao động từ 61,70- 93,56% Trên giá thể cát vàng + trấu hun (1:1), tỉ lệ sống đạt 61,7%, sinh trưởng yếu so với cơng thức khác, có màu vàng nhạt, khơng phát triển, có tượng rụng cũ Những trồng giá thể đất thịt trung bình + trấu hun theo tỉ lệ 6:4, tỉ lệ sống cao đạt 93,56%, sinh trưởng phát triển bình thường, hình thành thêm mới, phiến rộng, màu xanh đậm Cây trồng giá thể đất thịt trung bình, tỉ lệ sống đạt 79,23%, khơng phát triển giá thể này, khơng hình thành mới, chuyển sang màu xanh nhạt Do đó, giá thể đất thịt trung bình kết hợp với trấu hun tỉ lệ 6:4 nghiên cứu phù hợp lu để trồng bưởi Diễn in vitro giai đoạn bầu đất an 3.5.2 Ra vườn ươm va n Cây bưởi Diễn in vitro sau huấn luyện đạt chiều cao khoảng 4- 5cm, hình tn to thành thêm mới, xanh, chiều dài rễ đạt 3-4cm, khỏe mạnh sẵn sàng cho ie gh việc chuyển môi trường tự nhiên Chúng tiến hành chuyển trồng p luống với mật độ 30x30cm Tuần phủ ni lông Theo dõi, đánh giá kết Bảng 3.9 Kết vườn ươm Số lá/cây Chất lượng 3,82 ± 0,89 7,87 ± 1,18 + nf va 10,74 ± 2,18 ++ 13,03 ± 2,52 +++ Chiều cao (cm) d Thời gian oa nl w sau 1, 2, tháng chăm sóc Kết thí nghiệm thể bảng 3.9 hình 3.9 lu an Sau tháng 6,66 ± 2,05 Sau tháng 11,50 ± 6,57 z at nh oi lm ul Sau tháng z m tháng co l gm @ tháng tháng an Lu Hình 3.9 Cây bưởi Diễn in vitro trồng vườn ươm n va ac th 44 si Qua bảng 3.9 hình 3.9 cho thấy, in vitro sinh trưởng phát triển tốt môi trường tự nhiên, chiều cao tăng dần từ 3,83cm đến 11,50 cm Thời gian đầu, phát triển chậm, nhỏ thấp, nhỏ, màu xanh nhạt Do chuyển vườn ươm chưa thích ứng với điều kiện môi trường tự nhiên.Tuy nhiên, sau tháng trồng chăm sóc phát triển nhanh chóng, to, cao, thân bắt đầu phân cành, nhiều lá, phiến rộng, có màu xanh đậm, chiều cao đạt 11,50cm, số lá/ 13,03, phát triển cân đối sau tháng chăm sóc lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 45 si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Hạt bưởi Diễn khử trùng cồn 700 (1 phút), javen 60% 25 phút Ở ngưỡng thời gian tỉ lệ hạt nảy mầm đạt 91% Mơi trường thích hợp để tạo đa chồi từ đoạn thân bưởi Diễn invitro MS + đường 30g/l + agar 9g/l +BAP 5,0mg/l Trên môi trường chồi mập, phát triển cân đối, số chồi/mẫu đạt 5,8 Trên môi trường MS + đường 30g/l + agar 9g/l + GA3 0,5mg/l cho hiệu kéo dài chồi tốt nồng độ nghiên cứu (Chiều cao chồi đạt 4,78 cm sau tuần nuôi cấy) lu Môi trường tối ưu cho trình tạo bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh MS an n va + đường 30g/l + agar 9g/l có bổ sung IBA 0,7mg/l NAA 0,5mg/l Rễ Khi điều kiện tự nhiên giai đoạn bầu đất, giá thể đất thịt trung gh tn to phát sinh mập, khỏe, rễ mang nhiều rễ phụ p ie bình + trấu hun tỉ lệ 6:4 phù hợp cho việc huấn luyện in vitro Đề nghị nl w Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng d oa chất phụ gia khác đến sinh trưởng phát triển bưởi Diễn in vitro an lu Cây bưởi Diễn chưa đưa vào sản xuất quy mô rộng nên chúng nf va đề nghị tiếp tục nhân giống sản xuất với số lượng lớn nhằm bảo vệ nguồn gen quý, đáp ứng nhu cầu nhà vườn z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 46 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Boun K V (2005), Nghiên cứu tình hình sản xuất có múi huyện ngoại thành Hà Nội số biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao suất bưởi quýt, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Cục Nông nghiệp thành phố Phúc Châu, Phúc Kiến (2009), Tình hình sản xuất kỹ thuật trồng bưởi tỉnh Phúc Kiến, Tài liệu hướng dẫn kỹ thuật Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Sổ tay trồng ăn quả, NXB Nông nghiệp Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao lu động - xã hội an Nguyễn Hữu Đống, Huỳnh Thị Dung, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2003), Cây va n ăn quả có múi cam chanh quýt bưởi, NXB Nghệ An gh tn to Vũ Mạnh Hải (2000), Tài liệu tập huấn ăn quả, Viện Nghiên cứu Rau Trần Văn Hâu (2009), Giáo trình xử lý hoa ăn trái, NXB Đại học Quốc ie p gia Tp Hồ Chí Minh nl w Nguyễn Quỳnh Hoa (2010), “Nghiên cứu đặc tính nơng sinh học d oa bưởi Diễn chọn lọc ảnh hưởng số biện pháp kỹ thuật đến suất an lu phẩm chất bưởi Diễn trồng xã Minh Khai - Từ Liêm - Hà Nội”, nf va Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ (2010), Nhân giống vơ tính in vitro lm ul chanh Dây (Passiflora Edulis Sims) sử dụng đoạn thân mang chồi nách, Tạp chí z at nh oi cơng nghệ Sinh học 8(3): 379-385 10 Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình Các chất điều hịa z sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục @ gm 11 Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học l 12 Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, NXB Đại học m co Sư phạm an Lu 13 Trần Văn Minh (2004), Công nghệ Sinh học, NXB Trường đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh n va ac th 47 si 14 Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Chi Mai, Đặng Hịa Hiếu, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi trực tiếp từ thân mầm cam sành (Citrus nobilis loureiro) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 363- 370 15 Hồng Thị Sản, Phân loại thực vật, NXB Giáo dục 16 Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Hà Nội (2010 - 2015), Báo cáo khả thi dự án xây dựng sở ứng dụng, sản xuất giống sản phẩm trồng chất lượng cao, Báo cáo tổng kết 17 Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thu Thủy (2016), Giáo trình Cơng nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Đại học Thái Nguyên lu 18 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch Vũ Quang Sáng (2006), Giáo trình an sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội va n 19 Phan Hữu Tơn, Tống Văn Hải, Đồn Văn Lư, Phạm Thị Dung, Nguyễn Xuân reticulata)”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 5: 641-649 ie gh tn to Viết “Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống cam (Citrus sinensis), quýt (Citrus p 20 Tổng cục thống kê (2013), NXB thống kê nl w 21 Nguyễn Quang Thạch Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ sinh học nông oa nghiệp, NXB Đại học Sư phạm d 22 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng lu nf va an dụng, NXB Nông nghiệp 23 Hà Thị Thúy, Đỗ Năng Vịnh (2004), Nghiên cứu tạo mô sẹo phơi hóa phơi vơ z at nh oi Ứng dụng, trang 13-19 lm ul tính từ ni cấy nỗn số giống ăn có múi, Tạp chí Di truyền 24 Đào Thanh Vân, Ngơ Xuân Bình (2003), Giáo trình ăn (dành cho cao học), NXB Nông nghiệp, Hà Nội z 25 Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần Dinh dưỡng, Đại học @ gm quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh l 26 Hồng Văn Việt (2014), "Nghiên cứu đa dạng hóa thị trường tiêu thụ chuỗi giá m co trị bưởi Da Xanh Bến Tre", TC Hội nhập phát triển, 2, trang 15-19 an Lu 27 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi - Công nghệ sinh học chọn tạo giống, NXB Nông nghiệp, Hà Nội n va ac th 48 si 28 Vũ Văn Vụ (2012), Công nghệ sinh học 2- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục 29 Trần Như Ý, Đào Thanh Vân, Nguyễn Thế Huấn (2000), Giáo trình ăn quả, Đại học Nơng lâm Thái Nguyên, NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng Anh 30 Anna K P., Jacek P., Ewa S (2015), In vitro Regeneration induced in leaf explants of Citrus limon L Burm cv ‘Primofiore’, Maria Curie-Skłodowska University in Lublin 31 Bosch M (2005), Plant Physiology, 138: 1334-1346 32 Chen Q., Xu C J (2005), "Effect of artificial pollination on fruit development lu and quality in storage of Yongjiazaoxiangyou pomelo, China", Journal of Fruit an Science va n 33 Ehsan E., Ali D (2015), In vitro plant regeneration from mature tissues of tn to Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Rumani ie gh 34 Evandro H S., Fernando A (2011), In vitro organogenesis in some citrus p species nl w 35 Freeman T., Robbertse P J (2003), "Internal quality of Valencia ‟orange fruit as oa influenced by tree fruit position and winter girdling" d 36 Komal G., Shanma R., P K singh and Govind singh (2013), In vitro propagation lu nf va an produces seedless lime (Citrus limon L cv Kaghzi Kalan) and genetic evaluation of the plant, Plant physiology pp 131-145 lm ul 37 Rezadost M., Hosein S (2013), In vitro regeneration of sour orange (Citrus z at nh oi aurantium L.) via direct organogenesis, 55 (3) pp.137-164 38 Mung H.T (2008), Citrus production in Asia, Cheju Citrus ResearchInstitute, Korea, Asian Studies on the Pacific Coast z @ 39 Ngo Xuan Binh (2001), Study of self-incompatibility in Citrus with special University - Japan m 40 Plant Physiology online, http://www.biology-online.org co l gm emphases on the pollen tube growth and allelic variation, Ph.D thesis Kyushu an Lu n va ac th 49 si 41 Rosely P., Weliton A B., Elma d S., (2008), In vitro organogenesis from adult tissue of ‘Bahia’ sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Brasil, pp 367-371 42 Shahid A K et al (2011), Regeneration in vitro from non-pollinated flowers of sweet citrus (Citrus sinensis L Osbeck), African Journal of Biotechnologyp 15.130-15.134 43 Sunette L (2004), South African Journal of Plant and Soil, pp 199-202 Tài liệu mạng 44 FAO (2013), FAO Statistic Division 45 http://thanglong.chinhphu.vn chuong-my-hieu-qua-kinh-te-tu-mo-hinh-trong- buoi-dien lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 50 si