Microsoft Word Bao cao Hesperidin sua docx BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHCN CẤP BỘ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HESPERIDIN TỪ QUẢ PHẬT THỦ LÀ[.]
TỔNGQUAN
CâyPhậtthủ
CâyPhậtt h ủc ó t ê n k h o a h ọcl àC i t r u s m e d i c a L v a r S a r c o d a c t y l i s Swinglethuộcc h i C a m q u ý t (Citrus)h ọCửul ý hương(Rutaceace)thườ ngđ ư ợ cgọil à h ọCa m ; t ê n thườngg ọil à Buddha'sHa n d c i t r o n , Fingerc i t r o m f r e n i t , Phậtthủ.[5]
CâyPhậtth ủlàdạngcâynhỏxan htốtquanhnăm,lámọcsole, hìnhtr ứng, mépcórăngcưanhỏ,gaingắnmọcởdướilá.Vàođầumùahạrahoam à u trắng,cánh hoatrêntrắngdướiđỏ,quảchínvàomùađông,vỏngoàimàuv à n g , t r ê n mộtsốn h ữn gmúic h ạyd à i d ọcq u ảp h í a dướit á c h r a t r ô n g n h ưngóntaynêncótênlàphậtth ủ.[5],[4](Hình1)
Phậtthủđượctrồngtạinhiềunơitrong nướcta,thườngđểlấyquảăn,l à m m ứtvà l à m thuốc.Phậtthủc ò n đượ ctrồngở TrungQuốc,Ấnđ ộ ,cácn ướcv ù n g Đị aT r u n g Hải,Ú c , N a m M ỹ,T r u n g Đông.Y h ọccổtryuềnt h ườngdùngquảphơikhô(FructusCitrisarcodactyli).
Quảphậtthủhiệnmớichỉđượ cdùngđể chữahođặcbiệtlà chữah oc h o trẻe m,chữabụngđầy,đau,biếngăn,nônmửatạiTrungQu ốcvàViệtN a m theokinhng hiệmcủaYhọccổtruyền.
[5]Gầnđâydothànhphầnphongp h ú cáchợpchấtpolyphenolvàđặcbiệtlàsựcómặt vớihàmlượngđángkểcủacách ợpchấtf l a v o n o i d trongq u ảphậtt h ủn ê n phậtt h ủđượcsửdụngt r o n g phòngngừavàđiềutrịhuyếtáp,loãngxương,chốngoxyhóa
[20]ỞT ru ng QuốchiệncaochiếtflavonoidtoànphầncủaquảPhậtthủđãđượcbào chếthànhdạngthựcphẩmchứcnăng.
TrongquảPhậtthủngoàitinhdầu,cáchợpchấtđườngcòncócáchợpchấtpol yphenolnhư:Hesperidin(1);diosmetin(2);eriocitrin(3);diosmin(4);5- methoxyfurfural(5); 5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran-4- one(6);v a n i l l i c a c i d (7);3 - ( 3 - m e t h o x y - 4 - h y d r o x y p h e n y l ) - a c r y l i c a c i d (8);3 , 4 - dihydroxy- benzoicacid(9);limettin(10);obacunone(11).[5],[4]
TrongquảPhậtthủnóiriêng, qu ảcủacáccâyh ọCam nóichungcác hợp chấtflavonoidtậptrungchủyếuởlớpvỏcùi(Albedo)vàởlớpvỏdầu( F la v ed o) Trongđóhesperidintậptrungchủyếuởlớpvỏcùidướidạngkếttinh.[2],[7]
/\/gfriéiicii'u9uyif×frhicfrehiélhesperi4intirquitph(itffriif*imnguyéiifi(usitu.rudtt6udc
N N g g h h iên iên c c ứ ứ u u q q u u y yt t r r ̀n ̀n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t he he s s p p er er idin idin t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ật ật t t h h ủ ủ l l àm àm n n g g uy uy ê ê n n li li ệu ệu s s ản ản x x u u ất ất th th u u ốc ốc
Flavonoid,cáchợpchấtflavonoidtrongcâyhọCam
Flavonoidb a o g ồmmộtn h ó m lớnc á c h ợpchấtp o l y p h e n o l tựn h i ê n khốilượngphântửthấpphânbốrộngdãitrong giớithựcvật.Chúnglà sảnphẩm củaquátrình chuyểnhóa thứcấptrongcâyqua conđườ ngShikimatevàchu yểnh ó a phenylpropanoid.F l a v o n o i d l à mộtt r o n g nhữngn h ó m hợpchấtc óhoạttínhsinhhọcquantrọngnhấtvàđángchúýnhất.Chođếnnay,h ơn4.000hợpc hấtflavonoidđãđượcphânlậpvàxácđịnhcấutrúc.Chúngxuấthiệncảởdạngt ựdo (aglycone)cũngnh ưdạngglucosid.F la vo no id có t r o n g hầuhếtcácphầncủ athựcvậtbaogồm:trong quả,thân,lá,rễvàhoa.[2],[19]
Khungflavonoidđượctạothànhtừhaivòngthơm(thườngkýhiệulàAvàB),đ ượcgắnvớinhauquamộtvòngpyrone(C)trongtrườnghợpcáchợpchấtflavone,h oặclàmộtvòngdihydropyronetrongtrườnghợpcáchợpchấtflavanone,nhưtr onghình3.
Hình3:Khungflavonevàflavanone Theocấutrúcphântử,flavonoidđượcchiathànhsáunhómchínhsau:fl avone,flavanone,flavonol,isoflavone,anthocyanidin vàflavanol.
FlavonoidtrongquitcayhpCamchuyéuduoidang 'nxuat glucosyl. Dangt;rdokhfingcéinuaducrngdupcgpilaAglyconeitxuathi(ntrongphandichqu:ivibanch atlipophiliccuachungIDchochungtankémtrongnuoc.afraduéngthongthufingn hatgfimD-glucosev : i L-rhamnose.C a c danxuatglucosidt h u o n g l a O - g l y c o s i d , t r o n g d f i n i i a d u é n g l i e n k é t v riin h f i m hydroxylcuaagly conec vitri+7hoaclaCl(trongmotvattrué'nghpp).DangC- glucosidciingdupetimthaytrongmotsocayhoCam.
Bang1lacacaglyconeflavanonechuyéucotrongcayhoCam.Tatcaciteaglycon en:iydéucohainhé›mOH6'vitriCv:iC,.Hppchathesperetln
(12) vaisosakuranetin(15)cé›nhfimmethoxyl’avitriC4.Hppchatflavanonetaxifolin(14)comot nhfimhydroxyl’av’!triCltrongkhungnénciingcothexepvaophinnhfimflavanol.
N N g g h h iên iên c c ứ ứ u u q q u u y yt t r r ̀n ̀n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t he he s s p p er er idin idin t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ật ật t t h h ủ ủ l l àm àm n n g g uy uy ê ê n n li li ệu ệu s s ản ản x x u u ất ất th th u u ốc ốc
Trongbảng2 l à dạnga g l y c o ne c ủacá c flavonec h ủyếut r o n g câ y h ọc a m Acacetin(17)vàdiosmetin(23)cómộtnhómmethoxyởvịtríC4’t r o n gk h i đón hómmethoxytrongchrysoeriol(24) lạigắnởvịtríC3’.Kaempferol
Nhómp o l y m e t h o x y f l a v o n e (PMF)t h ườngthấyt r o n g t i n h dầuv ỏq u ảcâyhọcamđượctrìnhbàytrongbảng3.
32 Isosakuranetin7-O-rutinoside( D i d y m i n , Neoponcirin) O-Ru a H OMe
3 Eriodictyol7-O-rutinoside(Eriocitrin) O-Ru a OH OH
1 Hesperetin7-O-rutinoside(Hesperidin) O-Ru a OH OMe
33 Naringenin7-O-neohesperidoside(Naringin) O-Nh b H OH
34 Naringenin7-O-rutinoside(Narirutin) O-Ru a H OH
35 Hesperetin7-O-neohesperidoside(Neohesperidin) O-Nh b OH OMe
36 Eriodictyol7-O-neohesperidoside(Neoeriocitrin) O-Nh b OH OH
37 Isosakuranetin7-O-neohesperidoside(Poncirin) O-Nh b H OMe
27 Natsudaidain OH OMe OMe MeO 5 4
Bảng4:Cáchợpchấtflavanone-O-glycosid a O-Rutinose; b O-Neohesperidose
Cácf l a v a n o n e O- glycosidc ó t r o n g c â y h ọCamđượcg i ớit h i ệutrongbảng4 Các dẫnxuấtnà ycóm ộtn hó m thếglycosylở vịt rí C7(trongvòngA).Chođếnnay,trongnhómhợpchất nàychỉcóhainhómdisaccharidđượcxácđịnhmàcảhaiđềulàdẫnxuấtL- rhamnosyl-D-glucosyl:Nhómrutinose,c ó mộtliênkếtα-
1,6interglycosid;cònnhómneohesperidosethìhaiphântửđ ư ờ ngliênkếtvớinha uqualiênkếtα-1,2interglycosid.(Hình5)
38 Luteolin6,8-di-C-glucoside(Lucenin-2) H Glu OH Glu OH OH
39 Apigenin6,8-di-C-glucoside(Vicenin-2) H Glu OH Glu H OH
H Glu OH Glu OMe OH
41 Diosmetin6,8-di-C-glucoside(Lucenin-24´-methylether) H Glu OH Glu OH OMe
42 Apigenin7-O-neohesperidoside-4´-glucoside(Rhoifolin4´-glucoside) H H O-Nh b H OH O-Glu
43 Chrysoeriol7-O-neohesperidoside-4´-glucoside H H O-Nh b H OMe OH
44 Apigenin6-C-glucoside(Isovitexin) H Glu OH H H OH
45 Luteolin7-O-rutinoside H H O-Ru a H OH OH
46 Chrysoeriol8-C-glucoside(Scoparin) H H OH Glu OMe OH
48 Quercetin3-O-rutinoside( R u t i n ) O-Ru a H OH H OH OH
49 Apigenin7-O-neohesperidoside(Rhoifolin) H H O-Nh b H OH OH
50 Apigenin7-O-rutinoside(Isorhoifolin) H H O-Ru a H OH OH
51 Chrysoeriol7-O-neohesperidoside H H O-Nh b H OMe OH
4 Diosmetin7-O-rutinoside(Diosmin) H H O-Ru a H OH OMe
53 Diosmetin7-O-neohesperidoside(Neodiosmin) H H O-Nh b H OH OMe
Hình5:Rutinosevàneohesperidose Bảng5:Flavone-C-glucosidvàflavone-O-glucosid a O-Rutinose; b
(Bảng5 ) C h o đếnn a y , ngườit a mớichỉtìmthấyduynhấtRutin(48)làdẫnxuất3- O-rutinoside.Trongcâyh ọc a m cũngcònchứamộtsốl ớndẫnxuấtd i - C - g l y c o s i d cũngn h ưmộtsốl ượngn h ỏh ơndẫnx u ấtmono-C- glycosid.Vớinhữngh ợpchấtn à y , sựt h ết h ườngởvịtríC6hayC8hoặccảhai.Hiệnm ớichỉcódẫnxuấtD-glucosylđ ư ợ ctìmthấy.[17]
Hesperidin
Hesperidin(1)làmộthợpchấtflavonoidchủyếutrongvỏquảcâyhọCam(Ci trusRutaceae)đượcLebrtontáchchiếtvàonăm1827từvỏquảcâyHesperides, sauđónóđượctìmthấytrongrấtnhiềucâyhọCam(họCửulýhương).[2],
[ 9 ] Hesperidin c ó côngthứcp h â n t ử:C 28 H 34 O 15 Khốilượng phântử:610,56.CôngthứccấutạocủaHesperidinnhưsau:
Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one.
Tênk h á c : h e s p e r e t i n 7-rhamnoglucoside; cirantin; hesperetin-7- r u ti n o s i d e
Theocấut r ú c p h â n t ửhesperidint h u ộcv ền h ó m flavanone.P h â n t ửh e s p e r i d i n gồmmộtphântửaglyconehesperetin(12)liênkếtvớimộtphântửdisac charid (rutinose).Dođócóthểcoihesperidinlàdẫnxuấtβ-7- rutinosidecủah e s p e r e t i n R u t i n o s e (6-O-(6-deoxy-α-L- mannopyranosyl)-D- glucose)l à mộtd i s a c c h a r i d tạon ê n b ởimộtp h â n t ửrhamnosev à mộtp h â n t ử g l u c o s e bằngliênkếtα-
Khit h ủyp h â n h e s p e r i d i n bằngk i ềmt h u đượcp h l o r o g l u c i n o l v à he speretenicaxít.[9]Khithủyphânhesperidinbằngaxítthuđượchesperetin,D- glucose,L-rhamnose.
Hesperidinl à b ộtm à u trắngh a y n â u nhạt,k h ô n g mùi,k h ô n g v ị.Khót a n trongnước(1gamtrong50lítnước).Tantrongformamid,DMFở60 o C.T an í t t r o n g metanol,a x í t a x e t i c n ó n g Hầun h ưk h ô n g t a n t r o n g a c e t o n e , benzene,chloroform.T a n tựdotrongkiềmloãng,pyridine tạoramộtdungd ịchcómàuvàngsáng.[20]
Tácdụngchữabệnhcủahesperidin đượccácnhànghiêncứuđặcbiệtq u a n tâmtronghaithậpkỷvừaquavàđãcómộtsốlượnglớnấnphẩmđượcc ô n g bốvềứn gdụnghesperidintrongđiềutrịbệnh.[2],[6],[19]
Hesperidincũngnhưcácflavonoidkháccótácdụngkhángviêm,chốngôxyh óa,chốngdịứng,chốngungthư.Hesperidincótácdụnglàmbềnt h à n h mạchvàgiả mtínhthấmcủamaomạchnênđượcsửdụngtrongđiềutrịbệnhc a o huyếtá p v à bệnh trĩ.Tácd ụngc h ữahocủahesperidinlàdok h ảnăngchốngdịứngnhờtínhchấtứcch ếviệcgiảiphónghistaminetừcác tế bàolớn.HesperidinkhidùngphốihợpvớivitaminCcótácdụngcộnghưởngv à hỗtr ợhấpthụvitaminC.[2][6]
Tínhthẩmthấucủacácmaomạchgiatănglàđặcđiểmđiểnhìnhcủamộtsốt r ạngtháibệnhtậtv à đượcbiểul ộdướicáctriệuchứngnhư:phùt h ũng,c h ẩym á u v à tă nghuyếtáp.Cácbệnhcủac ơt h ểt h ườngđ ikèmv ớiviệctăngtínhthẩmthấucủacácm aomạchbaogồm:bệnhđáiđường,chứngthiếutĩnhmạchmãntính,xuấthuyết,bệnh sco- bút,nhiềuloạilởloétvàbầmt í m Cácnghiêncứutrướcđâyvềflavonoidchiếtxuấttừ thựcvậtchỉrarằngc h ú n g làmgiảmtínhthẩmthấuvàtínhdễvỡcủacácthànhmạch Hesperidinnóir i ê n g , c á c h ợpchấtf l a v o n o i d n ó i c h u n g đ ãđượcr ấtnhi ềuc ô n g t r ì n h nghiêncứuchứngtỏkhảnăngngănchặn,hạnchếsựgiatăngtínhthẩ mthấucủacácm a o mạch.[2],[6],[8],
[9].Năm1 9 3 9 Moriic h ỉr a r ằngv ớiliềus ửd ụng30mgmộtngàyhesperidinlàm giảmtínhthẩmthấucủacácmaomạchvàgiatăngsứcđềkhángcủacácmaomạchtr ongnhiềucađiềutrịlâmsàngc á c bệnhviêmmàngphổi,laophổi,bệnhGrave,bệ nhtêphù.Từđó,hesperidinđượcsửdụnglàmthuốctăngsứcđềkhángcủahệmao mạch.
Năm1 9 4 0 S c a r b o r o u g h sửdụnghesperidintrongđiềutrịchứngxuấthuyế tdosửdụngthạchtínvàbệnhgiangmai.Kếtquảthựcnghiệmcủaôngc h o thấyhesp eridincótácdụngtăngđộbềnvàkhảnăngchụiđựngcủacácm a o mạch.Năm1941Higbysửdụnghesperidintrongđiềutrịlâmsàngbệnhxuấthuyếtvànhữngrốiloạn gâyrabởichứngdònthành mạch.Vaitròcủah e s p e r i d i n trongviệcgiatăng độbềnthànhmạchlàdonóứcchếảnhhưởngcủacácemzymetácđộngđếntínhthấmvà tínhdễvỡcủacácmaomạch.[19]
Năm1994,Galastivàcộngsựđãchứngminhkhảnăngkhángviêmvàgiảmđ auđángchúýcủaHesperidintrênchuộtthựcnghiệm.CũngtrongnămđóEminvà c ộngsựcô ng bốsốliệunghiên cứudượclýchothấycóth ểsửdụnghesperidinlà mthuốckhángviêmrẻtiền,đặcbiệtlàtrong nhữngbệnhn h â n mẫnc ảmv ớic á c t h u ốck h á n g v i ê m k h ô n g chứasteroidt h ô n g t h ường.[ 2 ] [ 6 ]
Hesperidinnóiriêng,c á c f l a v o n o i d n ó i c h u n g l à c á c hợpchấtchốngô x y h ó a mạnh.C h ú n g h o ạtđ ộ ngn h ưl à c á c chấtd ọndẹpc á c g ốct ựdo(rad ical- scavengers)n h ờk h ảnăngc h o nhậnn g u y ê n tửh y d r o củac á c nhómchứcphen olicvàkhảnănggiảitỏađiệntửcủagốctựdotrongtoànbộkhung cấutrúcflavonoid:flavonoid(OH)+R.→flavonoid(O)+RH.[19]
Rấtnhiềun g h i ê n cứut h ựcnghiệmv ềhoạtt í n h c h ốngo x y h ó a củahe sp er id in đãđượctiếnhành.Kếtquảchothấykhảnăngchốngoxyhóacủahesperi dinlàtươngđốiyếunếusosánhvớicácflavonoidkhác[6].
Tuyn h i ê n , n ăm2 0 0 5 ngườit a đ ãchứngminhđ ư ợ ck h ản ăngc h ốngo x y hóarấttốtcủaHesperidintrênchuột(BMCPharmacol.2005Jan31;5(1):2.).
- Tácd ụngk h á n g v i k h u ẩn:K ếtq u ảt h ửnghiệmi n v i t r o củaBaevàcộng sực h o thấyh e s p e r i d i n c ó khản ăngứcc h ếsựp h á t triểncủa
Helicobacterpylori(HP).Trongnhữngbệnhnhânviêmdạdầymãntính,HPt h ú c đẩysựbiếnđổitừviêmdạdầythànhungthưdạdầy.Tuynhiên,Islamvà A h s a n , t r o n g thửnghiệmi n v i t r o hesperidint r ê n đ ĩ athạchc h o thấynók h ô n g cóh oạttínhkhángkhuẩnvớicácchủng:Bacillussubtilis,S t a p h y l o c o c u s aureus,
Streptococoushemolyticus,Escherichiacoli,chủngK l e b s i e l l a , Pseudomo nasaerugisnosa,Salmonellatyphi,Shigelladysenteriae,ShigellaflexnerivàVib riocholera.
- Hoạtt í n h k h á n g nấm:Ho ạtt í n h k há n g n ấmcủahesperidinđư ợ cg h i nh ậnở liềut ừ1 đến1 0 à g đ ố iv ớichủngB o t r y t i s c e n e r e a , Trichodermag l a u c u m vàAspergillusfumigatus Tuynhiên, hesperidinkhôngcóhoạttínhk h á n g nấmvớichủngAspergillusniger.
- Hoạtt í n h k h á n g virút:C á c n g h i ê n cứui n v i t r o trênt ếb à o n u ô i cấy củaWackervàEilmestiếnhànhvàocácnăm1975và1978chothấyh e s pe ri di n cóhoạttínhkhángvirútgâyviêmmiệngcómụnnướcởcácnồngđ ộkhácnhau vàcóhoạttínhkhángvirútcúm.N ăm1999,LeevàCS.pháthiệnthấyhesperidin c ó hoạtt í n h k h á n g v i r ú t yếuđ ố iv ớiv i r ú t h e r p e s đ ơ nh ì n h (HSV).Mild dletonchứngminhhoạttínhkhángvirútcủahesperidinđốiv ớivirútherpestype -I,parainfluenza-3,poliovirustype-
I,virúthỗnbàohôhấp(RSV)trênmôtếbàođơnlớp.MucsivàPragaichứngminht ácdụngứcchếvirútcủahesperidinđốivớivirútherpesđơnhìnhtype-
Tronghaithậpniêngầnđây,mộtsốlượnglớnnghiêncứuvềhoạttínhchốngu ngthưcủahesperidinvàdạngaglyconecủanó(hesperetin)đượctiếnh à n h Kếtq u ảchothấyhesperidin ứcchếcác tácnhângâyungthưtrênmôh ìn h thựcnghi ệmtrênchuộtởnồngđộ500ppm/ kgthểtrọng.YangvàCS.sửd ụnghesperidinkếth ợpvớid i o s m i n t r o n g 8 tuần đầutrênchuộtthựcnghiệmg â y u n g t h ưb ởit á c n h â n N-butyl-N-(4- hydroxybutyl)nitrosamine;kếtquảchothấyhỗnhợpứcchếgiaiđoạnđầuhìnhthành cáckhốiu.Tanakav à CSthửnghiệmhoạttínhchốngungthưcủahesperidin bằn gđườnguốngkếtquảchothấyhesperidin ứcchếtác nhângâyungth ư4- nitroquinoline-1- o x i d , làmgiảmsốlượngcácthươngtổnvàmứcpolyamidetrongtếbàolưỡi.[2], [6]
Hesperidinthểhiệnhoạttínhgiảmđau,hạsốttrênchuộtthựcnghiệmq u a đ ườngtiêmdướidavàđườnguống.Ngoàirahesperidincòncótácdụngứcchếsựgiả iphónghistaminvàprostaglandinvìvậymàđượcsửdụngtrongđiềutrịđaudạdầyvàu ngthưdạdầy.[2]
Ngoàic á c t á c d ụngn ê u t r ê n h e s p e r i d i n c ò n c ó t á c d ụngc h ống độc,chốngloãngxương,chốngtiatửngoại…
Năm2004lầnđầutiênngườitachứngminhđượckhảnăngchốngđộcAsen(III)củaHesperidintrênchuột( T o x i c o l Pathol.2 0 0 4 S e p - Oct;32(5):527-35.).Năm2003ngườitađãchứngminhđượckhảnăngchốngl o ã n g xươngcủaHe speridin(JNutr.2003Jun;133(6):1892-7.).
Nhưđ ãđ ề cậpở trên,H e s p e r i d i n đượcLebrtontáchc h i ếtv à o n ăm1 8 2
7 từvỏquảcâyHesperides,sauđónóđượctìmthấytrongrấtnhiềucâyh ọCam(họ Cửulýhương).[2],[9]
RH.HigbyvàCSchiếttáchhesperidintừvỏcamvàonăm1942bằngd u n g di chNaOHởpH11-12,sauđóaxithóadịchchiếtthuđượcbằngHClđếnp H 4 -
5 , t h u đượch e s p e r i d i n t h ô , đ emh ò a t a n t r o n g d u n g d i c h N a O H 0,0 2N,tủapectinbằngisopropanolvàtáchloạipectin,dịchlọcđượcchỉnhvềp H bằng6 để kếtt ủahesperidin,sauđ ót ác h h es p e r i d i n r a k h ỏid u n g dịch.[22]
TrongUSpatent2,421,061,c á c t á c g i ảmôt ảc ô n g n g h ệchiếtflavanone g l y c o s i d b a o gồmc á c bướcsau:làmc ứngn g u y ê n liệubằngv ô i , sauđóchiếtb ằngdungdịchkiềm(NaOHhoặcNH4OH),lọcépthudịchlọcv à điềuchỉnhpHbằn gHClđếnpHbằng4-
5,đểkếttinhtrong24giờ,lọcthukếttinhflavanoneglycosid.Kếttinhlạinếucầnbằng ancol.[23]
W.E Baiermôt ảc ô n g n g h ệchiếth e s p e r i d i n t ừv ỏcamb ằngd u n g dị chCaOH,s a u đ ókếtt i n h h e s p e r i d i n t r o n g môitrườnga x i t ( p H > 2 , 5 ) ở nhiệtđộ50 o C.Điểmcảitiếnduynhấtcủacáctácgiảlàthúcđẩyquátrìnhkếtt i n h ởnhi ệtđộcaođểrútngắnthờigiankếttinhvàhạnchếsựlênmencủadịchchiết.[24]
S.H.WendervàCS.đưaraquytrìnhtáchvàphânlậpflavonoidbằngcộtt r a o đổic a t i o n , d u n g m ô i rửagiảil à e t a n o l 9 0 % P h ươngp h á p nàyc h o phéptạorađượcflavonoidtươngđốitinhkhiết,tuynhiênchiphícaovàcôngn g h ệkh óápdụngtrongsảnxuấtlượnglớn.[25]
Bonnell;M J a m e s t r o n g USP4 , 4 9 7 , 8 3 8 môt ảc ô n g n g h ệc h i ết he sp e r id in t ừv ỏc a m ; t r o n g đ ósửd ụngmetanoll à m d u n g m ô i chiết.D ịchc hiếtt h u đượcđ emloạibớtm e t a n o l c h o đếnđiểmđ ụ c,t á c h l o ạit i n h dầubằng lytâm.Loạihếtmetanolbằngphươngphápcất,dịchthuđượcđemkếtt i n h ở nhiệtđ ộ p h ò n g , s a u đ óđ eml ọct h u đ ư ợ chesperidin.C ô n g nghện à y thuậnlợic h o tựđ ộ ngh ó a v à x â y dựngd â y chuyềnsảnxuấtq u y môl ớnn h ưngsuấtđầutưcaodos ửdụngthiếtbịphứctạpvàđắttiền.[26]
TrongU S P 7 , 0 1 5 , 3 3 9 , B E K h a r e v à C S m ô t ảmộtq u á t r ì n h chi ếtf l av one từthựcvậtbaogồmgiaiđoạnloạichấtbéobằngn- hexan,chiếtbằnga n c o l và côđặcdịchchiết.Chiếtdịcht h u đượ cbằngnướcởpH
6,5.Sửl ý tiếpbằngc á c p h ươngp h á p t á c h loạit h ô n g thường.[27]
A.D i M a u r o , B F a l l i c o v à c ộngsựp h á t triểnm ộtc ô n g n g h ệchi ếthesperidintrêncơsởcôngnghệchiếtbằngdungdịchkiềm,sauđótrunghòad ịch chiếtvàhấpphụhesperidinbằngnhựastyrene- divinylbenzene(SDVB).RửagiảibằngdụngdịchNaOH0,5NsauđókếttinhởpH 5.[1]
TrongnướchiệnchưasảnxuấtđượcHesperidin.Tuycómộtsốnghiêncứuvềhe speridinnhưnghầuhếtmớichỉdừngởphạmvinghiêncứucơbản.QuảPhậtthủcũng mớichỉđượcdùngđểchữahochotrẻem,chữađaubụng, đầyh ơi,biếngăn… t r o n g phạmv i k i n h nghiệmd â n g i a n hoặct h e o c á c b à i t h u ốccổphươngtrong yhọccổtruyền.
Năm2001,NguyễnHươngThảovàCStiếnhànhkhảosátflavonoidtừv ỏquý tsửdụngphươngphápchiếtbằngetedầuhỏasauđóbằngmetanolvàp h â n lậpflavo noid,kếttinhhesperidintrongmetanol.[16]
Năm2 0 0 6 , H o à n g T h ịK i m D u n g v à C S côngbốn g h i ê n cứuv ềk h ản ăngchốngoxyhóacủaRutinvàHesperinchiếtxuấttừhoahòevàvỏquýtviệtn am.
[11]Trongnghiêncứunày,cáctácgiảsửdụngphươngphápchiếtbằngdungmôih ữucơbaogồmviệcloạibỏchấtbéobằngetedầuhỏasauđóchiếtbằngmetanol,chiếtph ânlậpvàkếttinhhesperidintrongmetanol.
1 Phươngp h á p t h ứnhấtngườit a sửd ụngkiềmt r o n g d u n g môin ướcđ ể chiết hesperidinsauđókếttinhvàtinhchế.Ưuđiểmcủaphươngphápnàyl à c h i p h í sả nx u ấtt ươngđ ố ithấp,sửd ụngd u n g môil à n ướcn ê n t h â n thiệnvớimôitrườn g.Tuynhiên,phươngphápnàycónhượcđiểmlàsảnphẩmthuđượccóđộtinhkhi ếtkhôngcao,đòihỏiphảitách,kếttinhvàp h â n lậpbằngdungmôihữucơ.
2 Phươngphápt h ứhaisửd ụngd u n g môih ữucơh o ặch ỗnh ợpd u n g môih ữucơv à nướcđ ể chiếtt á c h hesperidinsauđ óp h â n lậpv à kếtt i n h P h ươngphá pn à y t h ườngđ ư ợ csửd ụngt r o n g p h ò n g t hí n g h i ệm,cònk h i ápdụngtrongs ảnxuấtthìchiphídungmôivàchiphísảnxuấtvàđặcbiệtl à suấtđầutưđắthơn.
Phântíchhesperidin
Hesperidinđượcphântíchbằngcácphươngphápphântíchhóalýnhư:P h ổt ửngoại(UV),phổhồngngoại(IR),khốiphổ(MS),phổcộnghưởngtừhạtnhân(NMR),sắckýlỏnghiệunăngcao(HPLC),LC-MS.HPLC-MS
PhổUVcủahesperidincóhaipichấpphụtửngoạicựcđạitươngứng:picIvớ icườngđọyếuhơnở326-330nm,picIIvớicườngđộmạnhhơnở2 8 4 -
286n m Trongđ ó,p i c I gắnv ớisựhiệndiệncủan h ó m c i n a m o y l t ừv ò n g B,cò npicIIgắnvớisựhiệndiệncủan h ó m benzoyltừvòngAtrongkhung cấutrúcc ủahesperidin.
PhổMSc ủahesperidin đượcg h i cảởchếđộionâm(negativemode)v àdương(positivemode).PhổMScủahesperidinghiởdạngnegativemodec ó các picđặctrưngtươngứngvớisốm/zcủacácion:[M-H] -
162] += 303vàmộtpicđặcthùcholớpchấtnàyhìnhthànhdosựchuyểnvịnộiphântửc ủaion[M+H] +t ạot h à n h ion[M+H-162] += 449domấtmộtđơnvịglucô.
Phươngp h á p HPLCt h ườngđượcsửd ụngđ ể p h â n t í c h đ ị nhlượnghes peridin.ThườngngườitasửdụngcộtphađảoC-18hoặcC-
8vớihệphađộngg ồmh ỗnh ợpn ước,a x e t o n i t r i l , m e t a n o l v à THFc ù n g v ớimộtlượngn hỏa x i t Đêtectơt h ườngd ù n g l à đêtectơU V ở 2 8 0 n m hoặcđ êtec tơD A D [3],[9],[30]
PHƯƠNGPHÁP THỰCNGHIỆM
Phương pháptiếpcận
Phươngp h á p 1 : Chi ếthesperidinvà các flavonoidkhác bằngnướcở p H 1
12.Dịchl ọcthuđượcđượcđiềuchỉnhvềmôitrườngaxi t đểkếttủa(hoặckếttinh)c ácflavonoid.Sauđóphânlậphesperidinkhỏihỗnhợpf l a v o n o i d toànphầndựatr êntínhkémhoặckhôngtancủanótrongcácdungmôihữucơ.
Phươngp h á p 2 : Chi ếtflavonoidt o à n phầnbằngd u n g môih ữucơhoặc hỗnhợpdungmôihữucơ.Cấtloạidungmôi.Sauđóphânlậphesperidin.
Donhữngưuđiểmvềchiphísảnxuấtthấpvàtínhthânthiệnvớimôit r ườngn ê n t r o n g c ô n g nghiệp,H e s p e r i d i n t h ườngđượcsảnxuấtbằngc ô n g n g h ệchi ếtbằngnước(phươngpháp1)dựatrêncơsởphươngphápchiếtcủaR H.HigbyvàW E.Baier.Theođó,nguyênliệuchứahesperidinđượcchiếtbằngkiềmởpH11- 12,lọcbỏbã,dịchlọcthuđượcđượcđưavềPH4-
5sauđ ókếttinhth uđượchỗnhợpflavonoid Tiếnhànhphân táchđểthuhesper idin,tinhchế,sấykhôvàbảoquản.
Trongnghiêncứun à y c h ú n g t ô i tiếnh à n h t á c h chiếtflavonoidt o à n p hầntừquảphậtthủbằngdungdịchkiềm.Hesperidinđượctáchchiết,phânlậpbằngp hươngphápchiếtrắn– lỏngsửdụngcácdungmôihữucơsauđókếttinhlạitrongmetanol.
Trêncơs ởkếtq u ản g h i ê n cứut h u được,chúngt ô i tếnh à n h chiếth e s p e r i d i n từcácnguyênliệuchứahesperidinkhácnhưvỏQuýt,vỏCamđểhoànth iệncơsởsốliệuphụcvụchoviệcpháttrểnsảnxuấtởquymôlớnhơn saunày.
Nguyênliệu,hóachấtvàthiếtbị
Chúngtôisửd ụngn g u y ê n liệul à q u ảPhậtt h ủt h u muatạichợL o n g Biênđ ượcsơchếnhưmôtảdướiđâyvàPhậtthủkhô,vỏCam,vỏQuýtmuat a i phốLãnÔng, HàNội.
Ctrong72giờthuđượcPhậtthủkhôvớihàmẩmkhoảng10%đemđ ónggóibảoquảns ửdụngchonghiêncứu,khảosátcôngnghệ.
- Metanol(CH3OH),P,KT(TQ);
Phương phápchiếttáchhesperidin
Cách ợpchấtf l a v o n o i d l à c á c polyphenoln ê n t r o n g môitrườngkiềmc h ú n g chuyểnt h à n h dạngpolyphenolatc ó k h ảnăngt a n t r o n g nước.Vớih e s p e r i d i n t h ì n g o à i viếcchuyểnt h à n h dạngp o l y p h e n o l a t n ó c ò n chuyểnth ànhdạnghesperidinchalcone.[7],
[18]C á c dẫnxuấtnàyc ó khản ăngchuyểnđổithuậnnghịchthànhhesperidin[10]th eosơđồsau:
Trongnghiêncứun à y c h ú n g t ô i sửd ụngphươngp h á p chiếtflavonoidt oànphầnnhưsau:
12.ĐiềuchỉnhpHbằngkiềm(NaOH,KOH,NH4OHhoặcCaOH).Kếtthúcgiaiđ oạnchiết,đemlọcéploạibỏbãqua3lớpvảilọc.Dịchlọcthuđượcđemlọcq u a giấylọc đ ể loạib ỏtạpchấtk h ô n g tan.Điềuc h ỉnhp H củadịchlọct h u đượcbằngHCl30%vềgiátrị4-
5đểkếttinhflavonoid.Sau24giờđemlọc,rửabằngnước5lần.Sauđósấyở60 o Ctro ng8giờthuđượcflavonoidtoànphầm.
Dohesperidinhầunhưk h ô n g t a n t r o n g acetone,benzene,chloroformn ê n chungtôitiếnhànhtáchhesperidinrakhỏihỗnhợpflavonoidtoànphầnn h ưsau: Flavonoidtoànphầnthuđượcởtrênđượcđemchiếtrắn– lỏngbằnga x ê t o n 3 lần,s a u đ óchiếtbằnge t y l a x e t a t t h u đ ư ợ ch e s p e r i d i n t h ô Hesperidint h ô t h u đượcđ emkếtt i n h lạit r o n g metanol.Lọc,r ửal ạib ằ ngmetanol.Sauđósấyở60 o Ctrong8giờthuđượchesperidinthànhphẩm.
Phântíchsảnphẩm
Hesperidinthànhphẩmthuđượcđượcphântíchbằngcácphươngphápphâ ntíchhóalýnhư:đođiểmchẩy,IR,LC-MSH 1 -NMR,C 13 -NMR,HPLC
KẾTQUẢNGHIÊNCỨU
TáchchiếtflavonoidtoànphầntừquảPhậtthủ
NguyênliệuPhậtthủkhôđượcsơchếnhưmiêutảởmụcII.2.1,đemx a y n h ỏ.Lấy2 0 0 g đ emnạpvàob ì n h chiếtd u n g t í c h 3 l í t Nạptiếp1 , 0 l í t n ướccấtvàk hấytrộntrong5phút.SauđóvừaduytrìkhấytrộnvừabổxungtừtừCaOHbộtđếnkhi pHđạtgiátrịmongmuốn(11-
12);theodõivàduytrìpHcủah ỗnh ợpchiếtở g i á t r ịn à y t r o n g s u ốtq u á t r ì n h chi ết.Kếtt h ú c q u á trìnhchiếtđ eml ọcépl o ạib ỏb ã n g u y ê n liệu.Rửalạib ằngn ướ c(60mlx3lần).
Gộptoànbộdịchlọcthuđượcđemlọclạiquagi ấylọc,sauđóchỉnhpHvềgi átrị4đến5bằngaxítHCl30%.Đểkếttinhtrong24giờsauđóđemlọc.Rửatinhthểthu đượcbằng20mlnước(5lần),sauđórửalạibằng20mln - h e x a n Đensấyở60 o Ctrong8giờthuđượcflavonoidtoànphần(2,65g).
Lượngnguyên liệu,g pH Lượngn ước,ml
Thờigian chiết,giờ Nhiệtđộ chiết, o C
Táchchiếtvà tinhchếHesperidin
Lấy5 g f l a v o n o i d toànphầnt h u đượcở t r ê n đemchiếtbằng25mla x ê t o n 3lần,mỗilầntrong30phút.Cáchợpchấtflavonoidvàpolyphenoltant r o n g cá cdungmôihữucơnhư:diosmetin(2);5-methoxyfurfural(5);5-h y d r o x y - 2 - h y d r o x y m e t h y l - 4 H - p y ra n - 4 - o n e (6);vanillicacid(7);3-(3- methoxy-4-hydroxyphenyl)-acrylicacid(8);3,4-dihydroxy- benzoicacid(9);limettin(10);obacunone(11) bịhòatanvàodịchchiết.Lọcvàgộp cácdịchchiết,cấtthuhồiaxêton.Phầnrắnthuđượctiếptụcđượcchiếtlạibằngetyl axetat,lọc,rửa,sấyở60 o Ctrong8giờthuđược4,25ghesperidinthô(85%).
Hòat a n 2 , 5 g hesperidint h ô t h u đượcở t r ê n t r o n g 500mlm e t a n o l ở nhiệtđộsôi.Lọcdungdịchthuđượcquagiấylọc.Loạibỏtạpchấtkhôngtan.Bổxun gtừtừvàodịchlọcthuđược75mlnướccấtvàkhấytrộnđều.Đểkếtt i n h ở25 o Ctron g24giờ.Lọctinhthểhesperidin,rửalạibằngmetanol.Sauđ ósấyở60 o Ctrong8giờt huđược2,3gsảnphẩmhesperidin(92%).
Lượnghesperid inthô,g Metanol, ml Nước, ml
Hesperidint h u đượcđ ư ợ cphânt í c h I R , UV,LC-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR,HPLCvàđođiểmchảy.(xemphầnIII.5.vàphụluc1-6).
Khảosátcácthôngsốảnhhưởngđếnquátrìnhtáchchiếthesperidintừquả Phậtthủ
Quyt r ì n h t h ựcnghiệmt á c h chiếtflavonoidtoànphầnvàt á c h c h i ếtp h â n lậphesperidintừquảPhậtthủđượctiếnhànhnhưmôtảtrongcácmục
Flavonoidtoàn phần,g Hesperidin,g Hiệusuấthesperidin/ flavonoid TP,%
1 2 Ở p H t h ấph ơnhiệusuấtchiếtf l a v o n o i d t o à n phầncũngnhưhiệusuấthesp eridinthuđượcthấp.Điềunàyphùhợpvớilýthuyếtvìcácionphenolatvàpolyp henolatđượcbềnhóatốtnhấtởpH>10.K h i tiếnhànhchiếtởpHcaohơnmặcdùlượ ngflavonoidtoànphầncaohơn,n h ưnghiệusuấthes per id in th u đượ cgiảm.Kếtq u ảnàycólẽlà do sựth oá i biếncủac ác p h â n t ửflavonoidglycosidebởiphảnứ ngth ủyp hâ n mộtphầnhoặcho àntoànnửađườngtạoradạngaglyconeflavonoid.
III.3.2 Ảnhhưởngcủatỷlệdungmôichiết Ảnhhưởngcủatỷlệdungmôichiếttớihiệusuấtquátrìnhchiếthesperidin,đ ư ợ ckhảos á t t r o n g khoảngt ừ3 / 1 đ ế n8 / 1 , c á c t h ô n g sốkhácđượcgiữnguyên :
Tấtcảcác t h í nghiệmđề usửd ụnglượngnướcr ửabãl ọcl à (60mlx3lần).Kết quảthuđượctrongbảngsau:
Kếtqu ảt h ựcn gh i ệmch o thấyt ỷl ệd un g môisovớin g u yê n liệunênđư ợ c duytrìvùa đủđể cót h ểkhấytrỗnđượ chỗnhợpchiếtmộtcác hhiệuquả.Lượngd ungmôisửdụngcàngnhiềuthìhiệusuấtchiếtsẽcànggiảmdosựh ò a t a n mộtl ượn gn h ỏhesperidint r o n g nước.Từc á c n g h i ê n cứuthựcnghiệm,c h ú n g t ô i thấy t ỷl ện à y n ê n đượck h ô n g c h ết r o n g khoảngt ừ4/1(TT/
KL) đến6 / 1 l à đ ủ đ ể khuấyt r ộnđượch ỗnh ợp.Ở t ỷl ệd u n g môi/ nguyênliệunhỏhơn3/1thìchưađủdungmôiđểcóthểkhấytrộnhỗnhợpchiếtv ì vậymàl à m giảmk h ảnăngp h â n t á n , tươngt á c giữac á c p h â n t ửf l a v o n o i d vớicácionkimloạikiềmđểchuyểnhóachúngthànhdạngtannênhiệusuấtchiếtgi ảm.
Tómlại,tỷlệdungmôi/ nguyênliệutốtnhấttrongkhoảngtừ4/1đến6 / 1 (TT/KL).
III.3.3 Ảnhhưởngcủanhiệtđộ Đểkhảosátảnhhưởngcủanhiệtđộtớihiệusuấtquátrìnhchiếth e s p e r i d i n ,chúngtôitiếnhànhkhảosáttrong khoảngnhiệtđộtừ20đến70 o C,cácthôngsốk hácđượcgiữnguyên:
Flavonoidtoàn phần,g Hesperidin,g Hiệusuấthesperidin/ flavonoid TP,%
KếtquảnghiêncứuđượctrìnhbầytrongBảng8vàBiểuđồ4.Bảng8:Ảnhhưởngcủanhi ệtđộđếnhiệusuấtchiếthesperidin a :RấtkhólọctáchflavonoidTP;dịchchiếtcóđộnhớtcao.
Kếtq u ảt h ựcnghiệmc h o t h ấy,q u á t r ì n h chiếtn ê n đượct i ếnh à n h ở nhi ệtđộtừ30–
40 o C.Khităngnhiệtđộcaohơnkhông chỉhiệusuấtchiếth e s p e r i d i n giảmmàc ònrấtkhólọcflavonoidtoànphầnrakhỏidungdịchsauk h i kếtt i n h c ó lẽd o nhiệtđ ộ c a o t h ú c đẩyq u á t r ì n h h ò a t a n c á c hợpchấtpe ctin vàonước.Hơnnữa,ởnh iệtđộcao trongmôi trườngkiềm(pH-
12)sẽthúcđẩyquátrìnhthủyphân,phânhủycáchợpchấtflavonoidkhông nhữngl àm g i ảmhiệusuấtt h u h ồihe spe ri di n màc ò n g â y kh ókhănch oq uá trì nhtinhchếsảnphẩm.
Cáct h í nghiệmk h ảosátảnhhưởngcủat h ờig i a n chiếtmẫut ớihiệusuấtquát rìnhchiếthesperidinđượctiếnhànhvớicácthôngsốnhưsau:
Flavonoidtoàn p hần,g Hesperidin,g Hiệusuấthesperidin/ flavonoid TP,%
Nhưvậythờigiantiếnhànhquátrìnhchiếthesperidintốtnhấtlà2giờ.Vớithờ igiandàihơn,hiệusuấtchiếtflavonoidtoànphầncũngnhưhiệusuấtt á c h hesperi dincóxuhướnggiảm.Cól ẽd o t hờigianchiếtcà ng dàith ìcách ợpchấtk h á c (pect in,plymetoxylatf l a v o n o i d … ) c ó trongn g u y ê n liệut a n c à n g nhiềuvàodị chchiếtvàchúngcảntrởquátrìnhkếttinhthuhồi,tinhchếf l a v o n o i d toànphầncũn gnhưhesperidinlàmchohiêusuấtchiếtcóxuhướnggiảm.
III.3.5 Ảnhhưởngcủakíchthướcnguyênliệu Đểkhảosátảnhhưởngcủakíchthướcnguyênliệu(độmịncủamẫu)c h ú n g t ôisửd ụngc á c p h â n đoạnn g u y ê n liệusauk h i x a y q u a r â y c ó kíchth ước1m m,3mmvà5mm.Cácthínghiệmđượctiếnhànhkhảosátvớicácthôngsốnhưsau:
STT Kíchthướcmẫun guyênliệu,mm Flavonoidtoàn phần,g Hesperidin,g Hiệusuấthe speridin,%
Từk ếtq u ản g h i ê n c ứuc h o thấyk í c h thướcn g u y ê n liệucàngn h ỏthìhiệu suấtchiếtcàngcao.Tuynhiên,nếunguyênliệuđượcnghiềnquámịnthìsẽgâyrahiê ntượngbítvảilọctrongquátrìnhloạibỏbã,gâykhókhănchoquátrìnhtáchloạib ãlàmtăngthờigianxửlý,tăngchiphí.
Vìvậy,nguyênliệutốtnhấtlàđượcnghiềnnhỏởkíchthướctừ1đến3 m m (K hiápdụngvàosảnxuấtnênsửdụngmáynghiềnlắpsàng3mm).
III.3.6 ẢnhhưởngcủapHmôitrườngkếttinh Đểkhảos á t ảnhh ưởngcủap H m ô i t r ườngkếtt i n h tớih i ệusuấtkếtt i n h th uhồiflavonoidtoànphầnvàhesperidinchúngtôitiếnhànhchiết1000gmẫukíchthướ c