Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Động vật chuyển gen là những con vật mang những gen lạ (khác loài hoặc những gen tái tổ hợp) mà những gen này được đưa vào hệ gen của nó có chủ ý dưới sự can thiệp của con người. Gen chuyển phải được di truyền theo mô hình của Menden và cho phép tạo ramột đàn gia súc theo các phương pháp lai tạo truyền thống. Sử dụng động vật biến đổi gen có hàng loạt những ưu điểm, đó là: chúng có khả năng sinh sản được để tạo ra thế hệ động vật chuyển gen tiếp theo; khả năng sản xuất linh động, sản lượng của chúng phụ thuộc vào số lượng con vật sản xuất; chúng có khả năng tự duy trì nguồn nguyên liệu và năng lượng cho bản thân chúng; và, trong hầu hết các sản phẩm thuốc được chế tạo từvật nuôi, sản phẩm được tạo ra tiện lợi nhất đó là ở dạng sữa. Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu.
Trang 2~ 2 ~
MỤC LỤC
I KHÁI QUÁT CHUNG 4
1 Khái niệm 4
2 Lịch sử phát triển 4
3 Mục đích chuyển gen 5
4 Đối tượng chuyển gen 5
II CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN 5
1 Bước 1: Tách chiết, phân lập gen mong muốn 5
2 Bước 2: Thiết kế và biểu hiện gen vào vật mang 6
3 Bước 3: Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen 6
4 Bước 4: Chuyển gen vào động vật 7
5 Bước 5: Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm 10
6 Bước 6: Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen 11
7 Bước 7: Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục 12
III ỨNG DỤNG CỦA ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN 13
1 Chuyển gen làm tăng sức sinh trưởng 13
2 Cải tiến chất lượng sản phẩm 15
3 Chuyển gen tạo động vật phát sáng 15
4 Gia cầm chuyển gen 16
5 Sản xuất protein tái tổ hợp ở tuyến sữa động vật 17
Trang 3~ 3 ~
IV Ý NGHĨA, THUẬN LỢI, KHÓ KHĂN VÀ VẤN ĐỀ NHẬN THỨC XUNG
QUANH ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN 20
1.Ý nghĩa 20
2 Thuận lợi 20
3 Khó khan 20
4 Vấn đề nhận thức xung quanh động vật chuyển gen 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO 22
Trang 4hệ động vật chuyển gen tiếp theo; khả năng sản xuất linh động, sản lượng của chúng phụ thuộc vào số lượng con vật sản xuất; chúng có khả năng tự duy trì nguồn nguyên liệu và năng lượng cho bản thân chúng; và, trong hầu hết các sản phẩm thuốc được chế tạo từ vật nuôi, sản phẩm được tạo ra tiện lợi nhất đó là ở dạng sữa
Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì
ổn định qua các thế hệ con cháu
2 Lịch sử phát triển
- 1977 Gurdon chuyển mRNA và DNA vào phôi Xenopus (ếch) và quan sát thấy biểu hiện chức năng của chúng
- 1980 Brinster và cộng sự nhận được kết quả tương tự ở chuột
- 1981 Wagner và cộng sự đã cấy thành công gen beta-globulin của thỏ vào phôi chuột
- Từ năm 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo thỏ, cừu, lợn, bò… chuyển gen và các vật nuôi tăng trưởng nhanh được
- Ngày nay, động vật chuyển gen đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như y học, dược phẩm, nông nghiệp,…
Trang 5~ 5 ~
3 Mục đích chuyển gen
- Tăng trưởng: làm tăng tốc độ sinh trưởng và chất lượng thành phần cơ thể động vật
- Kháng bệnh: xác định và chuyển gen có thể tác động đến tính kháng bệnh ở vật nuôi
- Cải tiến chất lượng, thành phần sản phẩm như sữa, thịt, lông,…
- Gen-farming: dùng động vật như hệ thống cải biến sinh học để sản xuất protein đặc biệt
4 Đối tượng chuyển gen
Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát triển trên mô hình chuột và sau
đó được ứng dụng trên gia súc, gia cầm
Ngoài ra, việc chuyển gen thường được thao tác trên:
+ Tế bào trứng đã thụ tinh
+ Tế bào tinh trùng
+ Mô phôi ở giai đoạn sớm
+ Tế bào gốc phôi
II CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN
1 Bước 1: Tách chiết, phân lập gen mong
muốn
- Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào
genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật
chuyển gen phải được phân lập và tinh chế;
- Cắt DNA mẫu và plasmid được cắt bởi
Trang 6~ 6 ~
2 Bước 2: Thiết kế và biểu hiện gen vào vật mang
- Vật mang là những yếu tố cần thiết cho việc đưa các gen muốn chuyển từ thể cho sang thể nhận Tuỳ theo cấu trúc gen cần chuyển mà yêu cầu các loại vật mang khác nhau Vật mang chủ yếu là các vector sinh học, đó là một đoạn phân tử acid nucleic thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vật chủ và mượn bộ máy của tế bào vật chủ để tạo ra nhiều bản sao giống hệt ban đầu
- Các đặc tính cần thiết của một vector:
Có khả năng sao chép tích cực và độc lập trong tế bào vật chủ;
Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận ADN ngoại lai có kích thước tối đa;
Vector phải cho phép phát hiện dễ dàng so với tế bào không mang vector này (thường là kháng kháng sinh hoặc sản sinh enzyme -gallactosidase);
Vector phải có khả năng tồn tại trong tế bào chủ trong nhiều thế hệ;
Vector phải có vị trí nhận biết duy nhất (tồn tại vị trí cho mỗi enzyme giới hạn, càng nhiều loại enzyme càng tốt)
- Các loại vector dùng trong kỹ thuật chuyển gen là: Plasmid( nhóm plasmid tự nhiên, plasmid nhân tạo ), phage, cosmide, virus của eukaryote (SV40, adenovirus, retrovirus, herpes virus ), nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và động vật có vú Sau khi đã tạo được tổ hợp gen biểu hiện, chèn tổ hợp này vào vector thích hợp
3 Bước 3: Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ
sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng Do tế bào phôi chưa phân chia và phân
Trang 7~ 7 ~
hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả
tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này
Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục
tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân
4 Bước 4: Chuyển gen vào động vật
Phương pháp chuyển gen trực tiếp
- Chuyển gen nhờ calcium phosphate
- Chuyển gen nhờ xung điện
- Chuyển gen nhờ vi tiêm
- Chuyển gen nhờ liposome,…
Phương pháp chuyển gen gián tiếp: nhờ virus
- Vector retrovirus (RNA)
- Vector adenovirus (DNA sợi kép)
- Vector adeno-associated virus (DNA sợi đơn)
- Vector herpes simplex virus (DNA sợi kép)
- Vector baculovirus (DNA vòng kép),…
A – Chuyển gen nhờ xung điện
- Máy tạo xung điện có công suất ổn định, điện thế từ 500-1500V/cm
- Sau mỗi lần thực nghiệm thì có 20-50% tế bào còn sống
Trang 8~ 8 ~
Chú ý
- Các DNA duỗi thẳng cho hiệu wủa gen cao hơn, do khả năng dung hợp với genome của tế bào đích
- Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực hiện trong dung dịch huyền phù đơn
- Cần dùng nhiều DNA và tế bào đơn
- Các tế bào khác nhau thì các thông số sử dụng khác nhau
Sơ đồ hệ thống xung điện
Cơ chế chuyển gen nhờ xung điện
Trang 9~ 9 ~
B – Chuyển gen nhờ vector retrovirus
Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus
- Là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ và gắn bộ gen virus vào genome tế bào chủ
Cơ chế hoạt động của vector
- RNA của virus được loại bỏ các gen GAG, POL, ENV và thay vào đó là gen cần chuyển
- Vector retrovirus được đưa vào tế bào vật chủ bằng nhiều phương pháp khác nhau
- Khi vào trong tế bào chất thì phần vỏ của vector bị phân hủy, giải phóng RNA
- Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA -> cDNA -> vào trong nhân tế bào -> enzyme cài xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ -> các sản phẩm protein của gen mục tiêu trong tế bào đích
Cấu trúc của retrovirus
Trang 10~ 10 ~
5 Bước 5: Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm
Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst) Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con
Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể tiến hành loại màng thứ cấp kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột
Cơ chế hoạt động của vector retrovirus
Trang 11~ 11 ~
6 Bước 6: Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen
Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật trưởng thành hay không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không
Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn
(Southern blot, Northern blot ) hoặc PCR
Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên mã và dịch mã Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch
mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật
Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ) để xác định gen lạ có
di truyền hay không
Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml), kỹ thuật này rẻ tiền, an toàn mà vẫn đảm bảo độ chính xác ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:
Trang 12~ 12 ~
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm
Có 2 loại ELISA là: ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp
7 Bước 7: Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục
Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen
Khái quát hoạt động của phương pháp ELISA
Tổng quan các bước chuyển gen
vào cơ thể chuột
Trang 13~ 13 ~
III ỨNG DỤNG CỦA ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN
Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen
Chuyển gen là một công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu các ngành sinh học Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen được sử dụng để phân tích sự điều hoà biểu hiện của gen để đánh giá một biến đổi di truyền đặc biệt ở mức độ toàn bộ cơ thể động vật Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng để nghiên cứu trong di truyền học phát triển ở động vật có vú
Công nghệ chuyển gen động vật ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại của phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo ra các động vật biểu hiện các tính trạng mong muốn trong một thời gian ngắn hơn và chính xác hơn Mặt khác, nó cho các nhà chăn nuôi một phương pháp dễ dàng để tăng sản lượng, tăng năng suất Các nhà khoa học đã tạo ra các vật nuôi chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng ) và chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, ít mỡ, sữa chứa ít lactose hoặc cholesterol ) Mặt khác, công nghệ chuyển gen đã cố gắng tạo ra các động vật có khả năng kháng bệnh như lợn có khả năng kháng bệnh cúm Tuy nhiên, hiện nay số lượng gen kháng bệnh ở vật nuôi đã được biết là hạn chế
1 Chuyển gen làm tăng sức sinh trưởng
Là hướng nghiên cứu làm tăng hiệu quả sản xuất thịt bằng cách chuyển gen tạo hoocmon sinh trưởng của người, cừu, bò, lợn cho thỏ, lợn, cừu, bò bẳng phương pháp vi tiêm vào nhân con của trứng đã thụ tinh
Trang 14~ 14 ~
Sẽ thu được vật nuôi chuyển gen có biểu hiện của gen chuyển nạp Ví dụ: cừu chuyển gen hoocmon sinh trưởng ngoại lai tăng kích thước và lượng sữa 18%, lợn chuyển gen
có hàm lượng hoocmon tăng trưởng trong máu sao gấp 50 lần và khối lượng tăng 28%
so với đối chứng Tỉ lệ thành công khi chuyển gen: chuột 25%, lợn 10.4%, cừu 1,3%, bò 0.6%
Tuy nhiên, cũng có báo cáo về sự phát sinh một số bệnh: viêm phổi, tiểu đường, loét
dạ dày,… mất khả năng sinh sản ở các gia súc chuyển gen hoocmon sinh trưởng thường
Chuột được chuyển gen tăng trưởng Cá hồi được chuyển gen tăng trưởng
Cừu, lợn được chuyển gen tăng trưởng
Trang 15~ 15 ~
2 Cải tiến chất lượng sản phẩm
Năm 1998, Ward và cộng sự (CSIRO) đã chuyển 2 gen mã hóa cho 2 enzyme của vi khuẩn vào cừu để biến đổi Serine thành Cystein nhằm tăng tốc độ mọc long và tăng tổng hợp collagen
Viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Pháp (INRA) đã tạo ra giống bò tiết sữa chua (yogurt) do chuyển gen sản sinh các sản phẩm lên men sữa chua vào bộ máy di truyền của bò sữa con bò này có tên là BuBu do Danny Lactaire tạo thành công
Làm giảm lượng lactose trong sữa bò và cừu bằng chuyển gen lactose kết hợp với promotor chuyên biệt để chuyển thành galactose và glucose làm tăng khả năng hấp thu sữa đối với 70% dân số Tăng hàm lượng casein trong sữa làm tăng chất lượng sữa Thay đổi thành phần các acid béo bằng chuyển gen FAD2 (fatty acid desatunase 2) từ cây spinach vào lợn để tạo acid Linoleic là thành phần dinh dưỡng thiết yếu (động vật có
vú không có enzyme này)
3 Chuyển gen tạo các động vật phát sáng
Thỏ
Việc tạo ra thỏ chuyển gen thành công đã được
công bố vào năm 1985 Vào năm 2001, đã tạo một
con thỏ chuyển gen có khả năng phát ra ánh sáng
màu lục ở trong tối
Mèo Năm 2007, các nhà khoa học phía Nam Hàn Quốc đã thay đổi ADN của một con mèo để làm cho nó phát sáng trong bóng tối Sau đó, họ mang ADN này đi nhân bản để tạo ra một tập hợp các giống mèo lông phát sáng
Trang 16~ 16 ~
Tuy nhiên, ngoài việc chuyển gen tạo ra cá cảnh phát sáng có ý nghĩa về mặt kinh tế, thì những động vật còn lại, việc chuyển gen phát sáng chỉ nhằm mục đích tạo nguồn động vật trung gian để nghiên cứu, phát triển đến các mục đích khác như chữa bệnh, nghiên cứu tế bào gốc…
4 Gia cầm chuyển gen
Việc chuyển gen ở gia cầm chủ yếu được nghiên cứu trên đối tượng là gà Gia cầm chuyển gen được nghiên cứu sử dụng để:
- Sản xuất kháng thể chống ung thư ở người
- Tiết ra hormone sinh trưởng người để chữa bệnh lùn
- Sản xuất trứng có hàm lượng cholesterol thấp hơn phục vụ cho con người
- Sản xuất isoflavon đậu nành trong trứng để bán cho người tiêu dùng
- Sản xuất các kháng thể như immoglobulin chim hoặc IgY một cách đặc biệt, thay thế cho việc sử dụng các động vật thí nghiệm
- Tạo dòng sản xuất gà thịt (broiler) Khi trứng gà mái thịt thụ tinh mang các tế bào “kiểu thịt” thì sẽ cho phép tạo dòng gà thịt Trong chương trình này, các cá thể nhất định từ các đàn gà phả hệ sẽ được tạo dòng và vật chất di truyền được đưa vào trong trứng thụ tinh Các nhà khoa học nuôi cấy tế bào mang gen ngoại lai và sau đó đưa các tế bào này vào trong phôi của trứng nhận đã thụ tinh và tạo ra được gà thể khảm Trứng nhận đã thụ tinh
có thể thu thập từ các đàn gà như Leughorn chẳng hạn Gà Leughorn có thể sinh sản một
số lượng lớn trứng với giá thành không đắt Khi các trứng chuyển gen này được ấp nở sẽ thu được gà thịt