Nghien cuu san xuat khang sinh vancomycin

Kho tài liệu diễn đàn Ketnooi.com Bộ Coâng Thương Trường Đại Học Coâng Nghiệp Thực Phẩm Khoa Coâng Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Môi Trường BÀI TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai Danh sách thành viên : Nguyễn Tuấn Ngọc 2013100090 Lê Hồ Thảo Nguyên 2008100132 Huỳnh Ngọc Tuyền 2008100168 Lê Thị Thúy Hằng 2008100110 Tháng 12 -2011 MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀT VẤN ĐỀN ĐỀ II NỘI DUNGI DUNG Khái quát Streptomyces orientalis Streptomyces orientalis 1.1 Streptomyces 1.2 Streptomyces orientalis 1.3 Ứng dụng sản xuất kháng sinhng dụng sản xuất kháng sinhng sản xuất kháng sinhn xuất kháng sinht kháng sinh Khái quát Streptomyces orientalis Vancomycin 2.1 Sinh tổng hợpng hợpp 2.2 Dượpc hóa họcc 2.3 Cơ chế tác dụng chế tác dụng tác dụng sản xuất kháng sinhng Quy trình cơng nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ sản xuất kháng sinhn xuất kháng sinht kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis khuẩn Streptomyces orientalisn Streptomyces orientalis 3.1 Chủng giống vi sinh vậtng giống vi sinh vậtng vi sinh vậtt 3.2 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinha chọcn mơ chế tác dụngi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhng điều kiện lên men sinh kháng sinhiề Streptomyces orientalisu kiệ sản xuất kháng sinh vancomycin từn lên men sinh kháng sinh củng giống vi sinh vậta chủng giống vi sinh vậtng S orientalis 4912 3.3 Nâng cao hoạ khuẩn Streptomyces orientalist tính kháng sinh củng giống vi sinh vậta chủng giống vi sinh vậtng S orientalis 4912 3.4 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinha chọcn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhng điều kiện lên men sinh kháng sinhiề Streptomyces orientalisu kiệ sản xuất kháng sinh vancomycin từn lên men vancomycin c ủng giống vi sinh vậta chủng giống vi sinh vậtng điều kiện lên men sinh kháng sinhột biếnt biế tác dụngn 3.5 Tách chiế tác dụngt tinh chế tác dụng vancomycin từ dịch lên mench lên men Một biếnt sống vi sinh vật ứng dụng khác Streptomycesng dụng sản xuất kháng sinhng khác củng giống vi sinh vậta Streptomyces 11 12 4.1 Các chất kháng sinht kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn phịng trừn gống vi sinh vậtc xạ khuẩn Streptomyces orientalis khuẩn Streptomyces orientalisn phòng trừ nất kháng sinhm gây bệ sản xuất kháng sinh vancomycin từnh thựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhc vậtt 12 4.2 Khuẩn Streptomyces orientalisn lạ khuẩn Streptomyces orientalisc củng giống vi sinh vậta Streptomyces sp môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinhng agar 13 4.3 Streptomyces biếnt vậtt chủng giống vi sinh vật cho việ sản xuất kháng sinh vancomycin từc tiế tác dụngt các protein dịch lên men điều kiện lên men sinh kháng sinhể sản xuất dược sinh học sản xuất kháng sinhn xuất kháng sinht dượpc sinh họcc 13 4.4 Vi sinh vậtt phân giản xuất kháng sinhi PhotPho (P) I KẾT LUẬNT LUẬNN 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢOU THAM KHẢOO 15 I ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, công nghệ sinh học được coi những ngành công nghệ hàng đầu của giới Và đó, công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin loại hoạt chất ứng dụng y học những lónh vực khác phục vụ cho đời sống nghiên cứu có bước phát triển vượt bậc Từ những phương pháp sinh tổng hợp bán tổng hợp công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của mình Trong số 10.000 chất kháng sinh được tìm thì có khoảng 2.000 chất thực vật tạo còn có khoảng 8.000 chất kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, đó xạ khuẩn tổng hợp 60% Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc trúc và đặc điểm kháng khuẩn Đặc biệt số có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò quan trọng, có nhiều ứng dụng thực tiễn đời sống Trong sống bình thường không chừa ai, vì những nhà khoa học cũng những y bác sĩ khoâng ngừng học hỏi tìm tòi để tìm phương thức để kháng bệnh, có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của các cán thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, được nhóm tâm đắc và nhóm đã định tìm hiểu cũng học hỏi phương pháp ở đề tài này + Mục tiêu : Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 phù hợp với nguyên liệu điều kiện môi trường khí hậu Việt Nam + Nội dung nghiên cứu : - Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại bảo quản chủng Streptomyces orientalis điều kiện phòng thí nghiệm - Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp nguyên liệu nước điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis phòng thí nghiệm - Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống - Nghiên cứu tối ưu môi trường điều kiện lên men có bổ sung chất - Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất lên men nhỏ - Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912 - Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na II NỘI DUNG Khái quát Streptomyces orientalis 1.1 Streptomyces - Streptomyces laø lớn chi Actinobacteria vaø chi nhập gia đình streptomycetaceae Hơn 500 loài Streptomyces vi khuẩn được mô tả Cũng với Actinobacteria khác, Streptomyces Gram dương, có gen với cao GC được tìm thấy chủ yếu đất thảm thực vật mục nát, Streptomyces sản xuất bào tử, được ghi nhận mùi họ maø kết từ sản xuất biến động chất chuyển hóa, geosmin Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi được biết đến nhiều chi họ xạ khuẩn (atinomyces) Streptomyces thường Hình 1.1 Streptomyces sống ở đất chúng nhận vai trò vi sinh vật phân hủy quan trọng Chúng sản xuất nửa số thuộc kháng sinh giới sản phẩm có giá trị lớn lónh vực y tế 1.2 Streptomyces orientalis Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh Streptomyces orientalis , được gọi laø orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn Streptomyces chủ yếu được tìm thấy đất thảm thực vật mục nát Streptomyces orientalis ban đầu được tìm thấy đất Ấn Độ Indonesia Nó được phát triển môi trường thạch men chiết xuất mạch nha có nhiệt độ tối ưu 280C Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin khaùng sinh, được sử dụng để phòng ngừa điều trị bệnh nhiễm trùng gây bởi vi khuẩn Gram dương, đặc biệt laø khuẩn tụ cầu Nó hoạt động cách ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Trong Vancomycin hữu ích để ngăn ngừa viêm nhiễm, gây vấn đề Nó báo cáo gây độc cho thận, vài trường hợp gây độc cho tai, đặc biệt dây thần kinh thính giác Do đó, Vancomycin thường được sử dụng loại thuốc cuối cuøng, được sử dụng khác 1.3 Ứng dụng sản xuaát kháng sinh Chất kháng sinh chất có nguồn gốc từ thiên nhiên sản phẩm cải biến chúng đường hóa học có khả tác dụng chọn lọc với phát triển VSV, tế bào ung thư nồng độ thấp - Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập loại xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất tiêu diệt tụ cầu kháng methicillin cầu khuẩn kháng vancomycin - Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 phương pháp sắc kí cột CKS có khả kiềm hãm phát triển nấm Aspergillus Candida albicans Chất có khả chống lại tế bào ung thư có giá trị Mic 0,01 – 0,3 mg/ml - Để tránh dịch bệnh nông nghiệp, người ta sử dụng số biện pháp kĩ thuật, thay đổi cấu trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh số bệnh mà trước gặp Việc tuyển chọn dòng kháng bệnh vài năm, sau tác nhân gây bệnh lại kháng lại Hình 1.2 Một số loại thuốc kháng sinh Hình 1.3 Khái quát Vancomycin Vancomycin chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực điều trị bệnh, coi phương thuốc cuối có khả điều trị bệnh nhiễm trùng nguy hiểm chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhiễm βlactam) gây nên Vancomycin được đưa vào chữa bệnh từ 40 năm qua, ngaøy được coi laø khaùng sinh quan trọng hiệu chữa bệnh cao dùng hoặc phối hợp với kháng sinh khác, chống lại Hình 2.1 vi khuẩn nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng Bởi vậy, việc nghieân cứu sinh tổng hợp vancomycin được quan tâm, phát triển, để từ hình thành nên hệ kháng sinh có hiệu chữa bệnh cao Hơn nghiên cứu lên men vancomycin nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh tạo tiền đề cho việc xây dựng sở sản xuất chất kháng sinh quy mô công nghiệp điều kiện Việt Nam, góp phần thực mục tiêu tới năm 2020 sản xuất 50% tổng số thuộc, Bộ Y tế đề Trong bối cảnh vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin nguyên liệu nước, phối hợp với điều kiện kinh tế môi trường khí hậu Việt Nam cần thiết Cùng với nó, việc triển khai xâây dựng sở sản xuất kháng sinh với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng 2.1 Sinh tổng hợp Vancomycin sinh tổng hợp xảy thông qua tổng hợp protein khác nonribosomal (NRPSs) Enzyme xác định trình tự axit amin trình lắp ráp đến mô-đun Trước Vancomycin được lắp ráp thông qua NRPS, axit amin được sửa đổi L-tyrosine được sửa đổi để trở thaønh β hydroxychlorotyrosine (β-hTyr) 4-hydroxyphenylglycine (HPG) dư lượng Mặt khác, acetate được sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine voøng (3,5-DPG) Tổng hợp peptide Nonribosomal xảy thông qua phân biệt mô-đun tải mở rộng protein axit amin, thông qua việc hình thành liên kết amide địa điểm liên kết phạm vi hoạt động Mỗi module thường bao gồm adenylation (A) tên miền, chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền tên miền ngưng tụ (C) hoặc kéo dài Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể được kích hoạt cách chuyển đổi thaønh phức tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền với đồng yếu tố 4'-phosphopantetheine bởi thioesterification phức tạp sau được chuyển vào miền PCP với việc đẩy AMP Trong sinh tổng hợp caùc Vancomycin, lĩnh vực sửa đổi bổ sung có mặt, chẳng hạn epimerization (E) miền, được sử dụng isomerizes axit amin từ lập thể khác, tên miền thioesterase (TE) được sử dụng chất xúc tác cho tạo vòng vận hành phân tử thông qua thioesterase phân cắt Một tập hợp multienzymes (CEPA enzym tổng hợp peptide, CepB, CepC) chịu trách nhiệm lắp ráp heptapeptide (Hình 2) Các tổ chức CEPA, CepB, CEP C chặt chẽ tương tự tổng hợp peptide khác những chất cho surfactin (SrfA1, SrfA2, SrfA3) vaø gramicidin (GrsA vaø GrsB) Mỗi enzym tổng hợp peptide kích hoạt mã hoá cho axit amin khác để để kích hoạt từng lĩnh vực CEPA mã hóa cho mô-đun 1, 2, CepB mã hóa cho mơ-đun 4, 5, và CepC mã hóa cho mơ-đun Sau phân tử heptapeptide tuyến tính được tổng hợp, Vancomycin phải trải qua thay đổi nữa, chẳng hạn oxy hóa liên kết ngang glycosyl hóa Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, taùm enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8, 9, 10, 11, 14, 18, 20, vaø 21 được sử dụng Enzyme ORF 7, 8, 9, vaø 20 laø những enzym P450 Và ORF 14 được xác định enzym thủy phân giả định Với gíup đỡ enzym này, nhóm β-hydroxyl được giới thiệu tyrosine dư lượng 6, khớp nối xảy vòng 7, vòng 6, vòng Ngồi ra, haloperoxidase được sử dụng để gắn nguyên tử clo vào vòng thông qua trình oxy hóa Hình 2.2 2.2 Dược hóa học Vancomycin nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa được sản xuất bởi trình lên men loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước định Nocardia orientalis ) Vancomycin exhibits atropisomerism – có nhiều hóa học khác biệt rotamers hạn chế luân phiên số liên kết Các hình thái diện thuốc mặt nhiệt động ổn định conformer có hoạt động mạnh 2.3 Cơ chế tác dụng Vancomycin hoạt động cách ức chế tổng hợp thích hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Do chế khác mà theo vi khuẩn Gram âm sản xuất thành tế bào yêu tố khác liên quan đến việc vào màng sinh vật gram âm, vancomycin hoạt động chống lại vi khuẩn Gram (ngoại trừ số loài lậu cầu Neisseria) Các phân tử ưa nước lớn hình thành liên kết hydro tương tác với thiết bị đầu cuối D-alanyl-D-alanine moieties caùc NAM / NAG- peptide Trong những trường hợp bình thường, tương tác năm điểm Điều ràng buộc vancomycin D-Ala-D-Ala ngăn chặn tổng hợp thành tế bào hai caùch: + Ngăn chặn tổng hợp polyme dài N-acetylmuramic acid (NAM) N-acetylglucosamine (NAG) hình thành sợi xương sống tế bào vi khuẩn + Ngăn cản polyme xương sống để kìm chế hình thành, liên kết với Hình 2.5 Cơ chế tác dụng Vancomycin Quy trình công nghệ sản xuất khaùng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 3.1 Chủng giống vi sinh vật Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea Eschrochia coli PA2, hóa chất dung để phân tích, định lượng vancomycin chuẩn (Merck) môi trường nghiên cứu Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48 Hình 3.1 Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 A Hình dạng khuẩn lạc, B Cuống sinh bào tử, C bào tử 3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh chủng S orientalis 4912 Thử nghiệm leân men treân số môi trường thường dùng lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao làm môi trường sở để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện lên men đến khả tạo kháng sinh Hình 3.2 Hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng thích hợp 3%, cho hoạt tính khaùng sinh cao Trong số caùc nguồn nitơ thử nghiệm bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ vaø pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp kháng sinh chủng S orientalis 4912 280C vaø pH từ đến Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp - 8% so với môi trường lên men Nghiên cứu động thái trình men chủng S orientalis 9412 cho thấy, sinh khối hoạt tính kháng sinh tăng dần đạt cực đại sau 120 lên men Như vậy, động thái trình lên men chủng có đặc trưng giống ở caùc chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác 3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 Trư c hết, nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngt, nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngc Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngn Công nghện Công nghệ sinh học áp dụng phương sinh học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngc áp dụng phươngng phươngng pháp gây ch ng đột biến tia UV Kết nghiên cứu khả sống sót củat biết, nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngn tia UV Kết nghiên cứu khả sống sót củang tia UV Kết, nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phươngt nghiên cứu khả sống sót nghiên cứu khả sống sót củau khả nghiên cứu khả sống soùt sống soùt củang sống soùt củang sót c a tết, nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương bào tr n vaø baøo tử chủng S orientalis 4912 sau xử lý UV độ sống sót từ ch ng S orientalis 4912 sau xử chủng S orientalis 4912 sau xử lý UV độ sống sót từ lý UV độ sống soùt từ đ ột biến tia UV Kết nghiên cứu khả sống sót sống soùt củang soùt t 1-10%, ki m tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khảt tính kháng sinh theo phươngng pháp cụng phươngc thạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khảch cho thấy, khảy, kh ả nghieân cứu khả sống soùt sống soùt củang sinh t ng h p khaùng sinh c a ch ng tăng sống sót củang lên từ 8-30,3% đống sót củai v i xử chủng S orientalis 4912 sau xử lý UV độ sống sót từ lý bào tử 66,33% đống sót củai v i xử chủng S orientalis 4912 sau xử lyù UV độ sống sót từ lý tế bào tr n Khả sống sót tế Hoạt tính kháng sinh khuẩn lạc chủng S baøo trần vaø baøo tử chủng S orientalis 4912 xaùc định phương phaùp cục thạch orientalis 4912 sau xử lý UV (A) đục lỗ (B) MNNG Hình 3.3 Sau nhà khoa học tiếp tục aùp dụng phương phaùp thứ hai, gây chủng đột biến MNNG Trên sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH vaø thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử tế bào trần tỷ lệ biến chủng hoạt tính kháng sinh cao chủng gốc 80,8 92,86 % Kết nhận được biến chủng S orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần MNNG) hoạt tính kháng sinh cao 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghieân cứu điều kiện leân men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc 866 mcg/ml) 3.4 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men vancomycin chủng đột biến Dựa môi trường lên men thích hợp cho chủng S orientalis 4912, tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương phaùp quy hoạch thực nghiệm Box-Wilson cho biến chủng S orientalis 4912-81-61 sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 g/l; CaCl2 40 mg/ l; CuSO4 10 mg/l Ảnh hưởng của yếu tố điều kiện leân men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC nồng độ pH thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng oxy hòa tan (dO2) môi trường tới sinh trưởng sinh tổng hợp vancomycin, thí nghiệm lên men biến chủng S orientalis 4912-81-61 được thực hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với điều kiện pH, nhiệt độ tỉ lệ giống xác định ở Kết xác định sinh khối khô hoạt tính kháng sinh sau 120 lên men cho thấy, dO2 được trì ở mức 20-30% lượng vancomycin sinh khối đạt cao nhất, tương ứng 2983 mcg/ml vaø 9,8 mg/ml Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan bảo đảm đảo trộn tốt bình lên men điều kiện thiết yếu sản xuất vancomycin Để xaùc định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S orientalis 4912-81-61 được ni thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với thành phần môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng phát triển tốt bình lên men, đặc biệt từ thứ 48 sinh khối chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml Cũng thời điểm naøy chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 nồng độ đạt cực đại laø 2983 mcg/ml Biến động trình lên men sinh tổng hợp vancomycin bởi biến chủng S orientalis 4912-8161 treân thiết bị Bioflo 5000 3.5 Tách chiết tinh chế vancomycin từ dịch lên men 10 Hình 3.4 Quy trình chiết xuất vancomycin Kế tác dụngt quản xuất kháng sinh kiể sản xuất dược sinh họcm tra vancomycin taùch chiế tác dụngt từ biế tác dụngn chủng giống vi sinh vậtng S orientalis 4912-81-61 b$ng sắc ký lớp mỏng hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Oc ký lớp mỏng hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Op mỏng hệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ dung môi Butanol - axit acetic - H2O (4 : : 7) cho gía trịch lên men Rf củng giống vi sinh vậta mẫu 0,75; phương pháp phổ khốiu 0,75; b $ng ph ươ chế tác dụngng pháp ph hợp kh ống vi sinh vậti Agilent 6310 Ion Trap máy HPLC-MS, trọcng lượpng phân tử 1449,27 1449,27 b$ng sắc ký lớp mỏng hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Oc ký l)ng cao caááp máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, th ờng điều kiện lên men sinh kháng sinhi gian l ưu * 4,4 phút giống vi sinh vậtng vancomycin chuẩn Streptomyces orientalisn (Merck) Sắc ký lớp mỏng hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2Oc ký điều kiện lên men sinh kháng sinhồn gốc xạ khuẩn phịng trừ HPLC cho th ất kháng sinhy caùc pic tạ khuẩn Streptomyces orientalisp chứng dụng khác Streptomycesng t) vancomycin ch ế tác dụng phẩn Streptomyces orientalism khaù tinh s khuẩn Streptomyces orientalisch, điều kiện lên men sinh kháng sinhột biến tinh khiế tác dụngt điều kiện lên men sinh kháng sinhạ khuẩn Streptomyces orientalist 95,4% Kiểm tra vancomycin sắc kyù lớp mỏng Vancomycin từ moâi trường Phỏ UV vancomycin Phỏ HPLC vancomycin nuôi cấy Vancomycin chuẩn (trên) vancomycin chuẩn (trên) vancomycin chủng S tách chiết làm tinh khiết; chủng S orientalis 4912 (dưới) orientalis 4912 (dưới) Vancomycin chuẩn (Merck) Một soá ứng dụng khác Streptomyces 11 4.1 Các chaát kháng sinh có nguồn goác xạ khuẩn phòng trừ naám gây bệnh thực vật Để tránh dịch bệnh nông nghiệp, người ta sử dụng số biện pháp kỹ thuật, thay đổi cấu trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh số bệnh mà trước gặp Việc tuyển chọn dòng kháng bệnh vài năm, sau tác nhân gây bệnh lại kháng lại Việc sử dụng CKS trồng trọt nhằm mục đích chống bệnh nấm gây rau trồng, chống bệnh vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng cỏ dại… kiềm chế bệnh thực vật sinh từ đất So với thuốc hoá học, dùng chất CKS bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân huỷ, tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp gây ô nhiễm môi trường, có khả ức chế VSV kháng thuốc hoá học CKS dịch lên men chủng sinh CKS dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên hạt, diệt bệnh phận nằm đất khử trùng đất Ngày nay, việc sử dụng CKS bảo vệ thực vật phổ biên rộng rãi giới nước Nga, Nhật, Trung Quốc, n Độ… Ở Trung Quốc tuyển chọn nhiều chủng xạ khuẩn từ đất nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh có hiệu cao policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn Năm 2002, Ấn Độ phân lập chủng Streptomyces sp.201 có khả sinh CKS z –methylheptyl iso –nicotinate, chất kháng sinh có khả kháng nhiều loại nấm gây bệnh Fusarium oxysporum, F.solani… Ở Việt Nam sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh bảo vệ thực vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản phân lập số chủng xạ khuẩn có khả chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn F.oxysporum gây bệnh thối rễ thực vật 4.2 Khuẩn lạc Streptomyces sp môi trường agar Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bào tử Trên thành sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác tuỳ loài : thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng… Bào tử hình thành cuống sinh bào tử phương pháp : phân đoạn cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường 12 kính khoảng 1,5 µm Màng tế bào nhẵn, gai khối u, nếp nhăn… Tuỳ thuộc vào lõi xạ khuẩn với môi trường nuôi cấy Thường môi trường có nguồn đạm vô glucoza bào tử thể đặc điểm rõ Màu sắc khuẩn lạc hệ sinh khí khác tuỳ theo nhóm Streptomyces, màu sắc biến đổi nuôi cấy môi trường khác Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram (+), hiếu khí, dị dưỡng chất hữu Nhiệt độ tối ưu thường 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0 Một số loài phát triển nhiệt độ cao thấp (xạ khuẩn ưa nhiệt ưa lạnh) Xạ khuẩn chi có khả tạo thành số lượng lớn CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi tế bào ung thư, virus động vật nguyên sinh 4.3 Streptomyces vật chủ cho việc tiết caùc protein dị để sản xuất dược sinh học Việc sản xuất thương mại protein chữa bệnh hoặc chẩn đoán vi sinh vật lý tổ hợp được quan tâm đáng kể Một số hệ thống sản xuất protein vi khuẩn phát triển Một số chi caùc vi khuẩn Gram dương được thử nghiệm laø vật chủ lưu trữ để sản xuất protein dị khả tiết caùc protein có hiệu môi trường nuôi cấy Trong số chi Streptomyces nhiều kể từ loài được biết tiết lượng protein cao Vì vắng mặt hệ thống hạn chế, thay đổi rộng lớn, hoạt động protease hạn chế sẵn có hệ thống vector thích hợp, Streptomyces lividans được chọn lựa cho việc tiết protein dị Các kết trình bày cho thấy lividans coù thể hoạt động vật chủ lưu trữ thuù vị để sản xuất số protein hữu ích cho số bệnh quan trọng ngành thương mại dược phẩm toàn giới là: ung thư, miễn dịch học, bệnh tim mạch bệnh truyền nhiễm 4.4 Vi sinh vật phaân giải PhotPho (P) Trong tự nhiên, P nằm nhiều dạng hợp chất khác Các hợp chất P hữu đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng… Những hợp chất P hữu vi sinh vật phân giải tạo thành hợp chất P vô khó tan, số tạo thành dạng dễ tan Hợp chất P hữu quan trọng phân giải từ tế bào vi sinh vật nucleotide Nucdeotide có thành phần nhân tế bào Nhờ tác động nhóm vi sinh vật hoại sinh đất, chất tách từ thành phần tế bào phân giải thành phần protein nuclein Protein vào vùng chuyển hoá hợp chất nitrogen, nuclein vào vòng chuyển hoá hợp chất P Sự chuyển 13 hoá hợp chất P hữu thành muối H3PO4 thực nhóm vi sinh vật phân huỷ P hữu theo sơ đồ tổng quát sau : Nucleoprotein  Nuclein  Acid.Nucleic  H2SO4 Vi sinh vật phaân hủy P hữu chủ yếu thuộc chi Bacillu Pseudomonas Các loài có khả phân giải mạnh : B.megaterium, Serratia, B.subtilis, Serratia, Proteus, Arthrobster,  Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium  Xạ khuẩn: Streptomyces III Keát luaän Vancomycin kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin penicillin Kết nghiên cứu xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao chủng gốc 344% Chất khaùng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck) Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng có đặc điểm giống loại S.orientales chủng chuẩn ISP 504 mô tả, sử dụng hầu hết nguồn đường, sinh trưởng phaùt triển tốt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 28-300C, pH thích hợp cho phát triển chủng naøy từ đến 9, chịu muối đến 6% khả tạo xenlulaza Chủng S orientalis 4912 có hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống lồi Streptomyces orientalis Pittenger & Brigham, ức chế được vi khuẩn Gram dương vi khuẩn Gram âm Đã lựa chọn môi trường thích hợp MT 48 làm môi trường sở để nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường điều kiện lên men Chủng 4912 có đặc điểm sinh học giống lồi Streptomyces orientalis hoạt tính kháng sinh cao Kết nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp khaùng sinh cho thấy nguồn dinh dưỡng thích hợp saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhiệt độ lên men 300C tỷ lệ cấy giống 10% Lượng sinh khối kháng sinh cao trình lên men ở 120 nuôi cấy Đã nghiên cứu biến động tự nhiên hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 vaø nhận thấy, chủng naøy biến động lớn hoạt tính kháng sinh; biến chủng âm tính lựa chọn được chủng có hoạt tính kháng sinh cao 14 Đã lựa chọn được chủng xạ khuẩn S orientalis 4912-81-345 có khả sinh tổng hợp vancomycin cao chủng được đột biến có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao chủng gốc Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần tia UV nâng cao được hoạt tính chủng S orientalis 4912 Được xác định được hoạt tính kháng sinh biến chủng sau xử lý UV: Hoạt tính kháng sinh chủng dương tính cao chủng gốc biến chủng âm thấp chủng gốc Đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men tổng hợp vancomycin chủng gốc chủng đột biến; Nghiên cứu động thái trình lên men nội lên men lít 80 lít Đã nghiên cứu tách chiết kháng sinh từ dịch nuoâi cấy chủng S orientalis 4912 dung môi chất hấp phụ, sản phẩm nhận được vancomycin Đã nghiên cứu tinh chế điều chế vancomycin.HC1 bào chế dạng thuốc : Thuốc tiêm viên nang TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) http://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces (2) http://www.microbiologybytes.com/video/Streptomyces.html (3) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html (4) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html (5) http://www.businesschemistry.org/article/?article=82 (6) www.en.wikipedia.org/wiki/Vancomycin (7) www.dspace.isivast.org.vn/dspace/bitstream/123456789/3266/1/dt1.doc (8) www.scribd.com/doc/35890819/STREPTOMYCES Tạp chí công nghệ sinh học 15