Sản xuất protein tái tổ hợp từ vi tảo

- Sản xuất protein tái tổ hợp ở vi khuẩn: + Ưu điểm: Nguồn dinh dưỡng đơn giản Lượng sinh khối tạo ra lớn trong một thời gian ngắn Thao tác chuyển gen tương đối dễ dàng Thời gian n

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP TỪ VI TẢO

HỌC VIÊN : TRƯƠNG VĂN PHONG GIẢNG VIÊN : TS NGUYỄN THỊ THU LIÊN

NỘI DUNG

Phương pháp chuyển gen ở vi tảo 3

Hệ thống sản xuất sinh học 2

Chọn lọc gen chỉ thị ở vi tảo 5

Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein 6

Giới thiệu về vi tảo 1

Khả năng biểu hiện gen ở vi tảo 4

Giới thiệu về vi tảo

- Vi tảo là các loại tảo rất nhỏ được quan sát dưới kính hiển vi, chúng sống trong môi trường nước

-  Tế bào nhân chuẩn, thành xenlulozo dạng sợi mảnh

Giới thiệu về vi tảo

Tại sao lại sử dụng vi tảo làm nguồn sản xuất protein tái tổ hợp?

- Sản xuất protein tái tổ hợp ở vi khuẩn:

+ Ưu điểm:

Nguồn dinh dưỡng đơn giản

Lượng sinh khối tạo ra lớn trong một thời gian ngắn

Thao tác chuyển gen tương đối dễ dàng

Thời gian nghiên cứu lâu dài

+ Nhược điểm:

Không có quá trình hậu dịch mã hoàn thiện

Các sản phẩm tạo ra hầu hết gây phản ứng không mong muốn cho người và động vật

Giới thiệu về vi tảo

Tại sao lại sử dụng vi tảo làm nguồn sản xuất protein tái tổ hợp?

- Sản xuất protein tái tổ hợp ở sinh vật bậc cao:

+ Ưu điểm:

Có quá trình hậu dịch mã hoàn thiện

Các sản phẩm tạo ra hầu như không gây ra phản ứng không mong muốn cho người và động vật Thời gian nghiên cứu lâu dài

+ Nhược điểm:

Nguồn dinh dưỡng phức tạp

Biểu hiện gen khá khó khăn

Thời gian tạo ra sản phẩm protein tái tổ hợp tương đối dài

Giới thiệu về vi tảo

Tại sao lại sử dụng vi tảo làm nguồn sản xuất protein tái tổ hợp?

Sản xuất protein tái tổ hợp ở vi tảo:

+ Ưu điểm:

-  Có khả năng tổng hợp chất hữu cơ từ nguồn năng lượng ánh sáng mặt trời

+ Nhược điểm:

- Vi tảo đại diện tốt nhất đại diện cho hai giới sinh vật dựa trên sự kết hợp của tốc độ tăng trưởng cao và dễ nuôi của vi

sinh vật có khả năng thực hiện các sửa đổi sau phiên mã giống thực vật.

- Mặc dù có những trở ngại vẫn cần phải vượt qua trước khi vi tảo trở thành hệ thống sản xuất tiêu chuẩn.

- Chuyển gen ở vi tảo đã thành công ở hệ gen của nhân,hệ gen lục lạp và ty thể , mặc dù chưa có nhiều ứng dụng nhưng

nó mở ra một con đường sản xuất protein tái tổ hợp mang lại hiệu quả cao về mặt kinh tế đầy hứa hẹn.

Giới thiệu về vi tảo

Tiềm năng từ vi tảo

-  Nhưng một đặc điểm làm cho quá trình sản xuất protein tái tổ hợp ở vi sinh vật chưa mang lại hiệu quả kinh tế cao: Không 

có quá trình biến đổi sau phiên mã và dịch mã. Nên quá trình này phải diễn ra bên ngoài tế bao vi sinh vật bằng việc sử dụng các biện pháp nhân tạo

-  Các sản phẩm protein trong nhiều nghiên cứu cho thấy gây ra những phản ứng không có lợi cho cơ thể, như: làm thay đổi cấu trúc của kháng nguyên ở chuỗi nặng làm ảnh hưởng đến chuỗi nhẹ làm giảm khả năng miễn dịch của cơ thể động vật hay con người (Wildt và Gerngross, 2005 )

- Khắc phục được sự thiếu xót sau dịch mã ở vi sinh vật

- Nhược điểm của hệ thống này đòi hỏi dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy khắt khe

- Hiệu quả kinh tế không cao mặc dù đã được thay thế bằng việc sử dụng các tế bào con trùng trong nuôi cấy

- Trong quá trình nuôi cấy dễ nhiễm các loại virut dẫn đến sản lượng protein tạo ra thấp

Hệ thống sản xuất sinh học

3

THỰC VẬT

- Quá trình hậu dịch mã ở thực vật là tương đối giống với động vật nên tế bào thực vật được sử dụng thay thế

- Nhưng nó vẫn còn mắc phải một số điểm hạn chế mang đến hiệu quả kinh tế không cao:

Môi trường dinh dưỡng vẫn yêu cầu phức tạp

Thời gian nuôi cấy dài

Dễ bị nhiễm khuẩn

Một số nghiên cứu cho thấy một số protein tạo ra từ thực vật gây phản ứng dị ứng trên người (Decker và Reski, 2004).

- Môi trường dinh dưỡng đơn giản

- Trước đây vi tảo nuôi trồng trong các hệ nuôi cấy mở

- Ứng dụng vào các hệ thống phản ứng sinh học kín hứa hẹn mang lại hiệu quả kinh tế rất cao (Mayfield, 2003)

Hệ thống sản xuất sinh học

So sánh của các hệ thống sản xuất protein tái tổ hợpprotein tái tổ

hợp

Phương pháp chuyển gen ở vi tảo

A. Kết hợp giữa việc phá vỡ cấu trúc màng tế bào và các phương pháp chuyển gen.

-. Dựa vào các nghiên cứu trong quá trình sinh sản của các loài tảo, các nhà khoa học đã sử dụng enzyme phân giải màng tế bào, sau khi mang tế bào bị phá vỡ các gen sẽ được chuyển vào nhờ các kỹ thuật chuyển gen (Buchanan và Snell )

-. Tuy nhiên hiệu quả biến nạp gen vào chưa cao

B Chuyển gen bằng súng bắn gen.

-. Các hạt vi đạn được bọc một lớp DNA sau đó được chuyển trực tiếp vào tế bào vi tảo

-. Phương pháp nay vẫn được đánh giá là hiệu quả mặc dù tỉ lệ sống xót của các tế bào chuyển thấp, do gen được biểu hiện ổn định (Boynton và Gillham, 1993).

-. Thành công trong các nghiên cứu Volvox carteri (Schiedlmeier et al., 1994), Chlorella sorokiana (Dawson et al, 1997), Chlorella ellipsoidea (Chen et al., 1998) và Chlorella kessleri (El-Sheekh, 1999)

Phương pháp chuyển gen ở vi tảo

C Sử dụng các hạt thủy tinh.

- Hạt thủy tinh có cấu tạo là polyethylen-glycon

- DNA bọc xung quanh hạt thủy tinh

- Một nghiên cứu cho thấy: hiệu quả biến nạp của gen vào DNA của nhân 10-3 thể biến nạp / µg DNA và hiệu quả biến nạp của 50 thể biến nạp /µg DNA đã đạt được đối với việc chuyển C reinhardtii vào DNA lạp lục (Kindle, 1990)

- Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng phương pháp hạt thủy tinh cũng là hiệu quả hơn so với súng bắn cho việc chuyển gen vào Dunaliella salina (Feng et al, 2009)

Phương pháp chuyển gen ở vi tảo

D Phương pháp xung điện

- Dựa trên nguyên tắc ở một cường độ điên trường và hiệu điện thế nhất định, cấu trúc phospholipid của màng tế bào sẽ tách ra trong khoảng thời gian ngắn Quá trình này diễn ra liên tục, chính cấu trúc mở giúp gen được chuyển vào hệ gen của tế bào chủ.

- Xung điện đã được sử dụng thành công cho việc chuyển gen ở D salina (Geng et al, 2004; Sun et al, 2005; Wang

et al, 2007b; CN et al, 2008; Feng et al, 2009.), Dunaliella viridis (Sun et al, 2006) và Dunaliella tertiolecta (Walker và cộng sự, 2005b) loài C reinhardtii (Tang et al, 1995; Shimogawara et al, 1998; Kovar et al, 2002; Ladygin,2003, 2004), Chlorella loài (Chow và Tùng, 1999; Wang et al,2007a), và Nannochloropsis oculata (Chen et al, 2008; Li và Tsai,2009).

Phương pháp chuyển gen ở vi tảo

E Chuyển gen vào vi tảo nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

- Do plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa các gen đặc biệt nằm ở vùng Vir, co khả năng hình thành các khối u trên tế bào đích đến, thông qua chỗ hình thành khối u màng tế bào bị phá vỡ, DNA thể cho sẽ bơm vào thể nhận.

- Một số nghiên cứu ban đầu được thục hiện bởi (Kathiresan et al, 2009), Kathiresan và Sarada (2009)

Biểu hiện gen chuyển ở vi tảo

- Một số nghiên cứu gần đây cho thấy việc biểu hiện gen chuyển vào tế bào vi tảo là tương đối thấp và khó dự đoán trước được

- Có hai giả thuyết chính được đưa ra cho việc này:

+ Các gen chuyển được chuyển vào vùng im lặng của gen, không xảy ra quá trình phiên mà, dẫn đến không xảy ra quá trình dịch mã

+ Nhờ một cơ chế bạo vệ dưới tác động của các nhân tố ngoại lai xuất hiện trong tế bào vi tảo Cũng làm hạn chế sự biểu hiện của gen.

(Muskens et al, 2000; Baulcombe, 2004; Butaye et al, 2005; Angaji et al, 2010; Teixeira và Colot, 2010; Marenkova và Deineko, 2010)

Chọn lọc gen chỉ thị ở vi tảo

- Dựa trên nguyên tắc sự biểu hiện của gen chỉ thị keo theo sự biểu hiện của gen quan tâm trong tế bào đích.

- Một số gen chỉ thị ví dụ: gen kháng kháng sinh, gen phát huỳnh quang

Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein tái tổ hợp

1. Lựa chọn các trình tự tăng cường (promoter)

-. Là các trình tự gắn trước vùng gen đích, trình tự này giúp tăng cường sự phiên mã của gen đích

-. Việc lựa chọn các trình tự promoter tối ưu giúp tăng cường sự biểu hiện của gen mặt khác Loại bỏ được trường hợp gen có xu hướng gắn vào vùng im lặng không được biểu hiện

2 Sự thay đổi kiểu gen

-. Trên giả thuyết những gen chèn vào những vị trí giống hệt nhau trong kiểu gen thì sẽ sản xuất một lượng protein tương ứng như nhau Nhưng thực tế đã chứng minh điều ngược lại Surzycki et al (2009), tuy nhiên, đã quan sát thấy sản lượng protein khác nhau từ 0,88% đến 20,9% protein tế bào tổng số (TCP)

-. Điều này chứng tỏ việc thay đổi kiểu gen, cấu trúc từng kiểu gen sẽ dẫn đến những thay đổi đáng kể trong mức biểu hiện của gen

Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein tái tổ hợp

Một số trình tự tăng cường

Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein tái tổ hợp

3 Các yếu tố nội tại trong tế bào vi tảo

- Một số trình tự intron được chèn thêm vào gen đích mang ý nghĩa quyết định đến sự biểu hiện tăng cường của gen Eichler Stahlberg (2009)

- Trong tế bào luôn giữ trạng thái cân bằng sự bất thường về những thay đổi nhỏ trong tế báo dẫn đến cơ chế bảo vệ được tái khởi động, như vậy giảm sự biểu hiện của gen

- Một số nghiên cứu đã đưa nhiều giả pháp khắc phục ví dụ: chèn một lúc hai hay nhiều gen quá trình biểu hiện tổng hợp protein ở gen này sẽ làm cho cơ chế bảo vệ không được tái khởi động dẫn đến gen đích được biểu hiện…

TRIỂN VỌNG CỦA VI TẢO TRONG SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP

TRONG TƯƠNG LAI

- Mặc dù hầu hết các sản phẩm protein tái tổ hợp đang còn trong giai đoạn nghiên cứu phát triển và còn gặp nhiều khó khăn, nhưng nhờ sự phát triển không ngừng của các ngành khoa học kĩ thuật mở ra một con đường lớn nhằm tăng hiệu xuất trong các hệ thống sinh học nhằm tạo ra một lượng lớn sản phẩm mong muốn từ vi tảo.

- Nếu xét trên mặt kinh tế và những ứng dụng rộng rãi trong y dược cho con người thì sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp từ vi tảo có rất nhiều tiềm năng, nhanh chóng ứng dụng và mở rộng sản xuất trong thực tiễn

Thank You!