Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại tuyến trùng giống caenorhabditis (nematoda rhabditidae) phân lập từ vườn quốc gia cát tiên, việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LẠI THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI TUYẾN TRÙNG GIỐNG Caenorhabditis (Nematoda: Rhabditidae) PHÂN LẬP TỪ VƯỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN, VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỌ SƠN HÀ NỘI, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với công trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn Hội đồng khoa học Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Người cam đoan Lại Thị Phương ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu, thực đề tài hoàn thành luận văn này, nhận quan tâm giúp đỡ quan, thày cơ, gia đình bạn bè đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy giáo, cô giáo cán Phịng Sau đại học Viện Cơng nghệ sinh học thuộc trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam giúp đỡ tơi nhiều q trình học tập tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa học thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu môn Công nghệ gen Di truyền phân tử nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thày hướng dẫn TS Lê Thọ Sơn, người tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn hỗ trợ hóa chất, vật liệu tiêu hao học thuật từ Đề tài NAFOSTED (mã số 106.06-2019.27; Đa dạng chủng loài Phản ứng với vi khuẩn tuyến trùng Caenorhabditis phân lập từ rừng mưa nhiệt đới (vườn quốc gia Cúc Phương Cát Tiên) Việt Nam TS Lê Thọ Sơn làm Chủ nhiệm) Cuối gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè người bên cạnh, động viên giúp đỡ mặt trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Người thực Lại Thị Phương i MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng Caenorhabditis C elegans giới 1 Tổng quan tuyến trùng Caenorhabditis C elegans 1 Hình thái, giải phẫu tuyến trùng C elegans 10 1 Sinh sản chu kỳ phát triển tuyến trùng C elegans 12 1 Giải trình tự DNA 16 Tình hình nghiên cứu dòng tuyến trùng C elegans Việt nam 16 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Mục tiêu phạm vi nghiên cứu 18 2 Nội dung nghiên cứu 18 Đối tượng nghiên cứu 19 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 Phương pháp nghiên cứu 19 Phương pháp thu mẫu, phân lập lưu trữ tuyến trùng 19 Phương pháp quan sát mơ tả hình thái tuyến trùng 21 Phương pháp mô tả đặc điểm DNA 22 Thí nghiệm tuổi thọ 24 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Đặc điểm hình thái dịng tuyến trùng Caehanorditis kính hiển vi quang học 26 3.1.1 Dòng T48.1- CFB50 26 3.1.2 Dòng T23.1- CFB108 27 3.1.3 Dòng T48.1- CFB135 29 3.1.4 Dòng T23.1- CFB104 30 3.1.5 Dòng T48.2- CFB234 31 Phân tích phân tử 32 ii Phản ứng Multiplex-PCR 32 2 Giải trình tự DNA 33 3 Đặc điểm phân tử mối quan hệ phát sinh chủng loài chủng Caenorhabditis phân lập dựa đoạn gen 18S ADNr 43 3 Đặc điểm tuổi thọ dòng tuyến trùng Ceahanorditis 46 3 Đặc điểm tuổi thọ 46 3.3.2 So sánh tuổi thọ dòng tuyến trùng thuộc giống Caenorhabditis 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 iii DANH MỤC BẢNG Bảng Trình tự thơng tin cặp mồi sử dụng 22 Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng Số hiệu mẫu loài tuyến trùng thu 26 Bảng Giải trình tự DNA dịng C elegans 33 Bảng 3 Giải trình tự 18S dòng T48.1- CFB50 35 Bảng Giải trình tự DNA dòng T23.1- CFB108 37 Bảng Giải trình tự DNA dịng T48.1- CFB135 39 Bảng Giải trình tự DNA dịng T23.1- CFB104 41 Bảng Giải trình tự DNA dòng T48.2- CFB234 42 Bảng Thành phần nucleotit chiều dài gen 18S ADNr chủng tuyến trùng Caenorhabditis spp phân lập 44 Bảng 10 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C brenneri CFB50 47 Bảng 11 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C.sinica CFB108 …48 Bảng 12 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C brenneri CFB35 49 Bảng 13 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C brenneri CFB104 50 Bảng 14 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C brenneri CFB234 51 Bảng 15 Bảng khảo sát kết tuổi thọ dòng tuyến trùng Ceanorhaditis 52 Bảng 16 Sự so sánh tuổi thọ dòng tuyến trùng thuộc giống Caenorhabditis 53 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Địa điểm bắt gặp loài tuyến trùng Caenorhabditis trái đất Hình Cấu trúc thể lưỡng tính đực C elegans 12 Hình Sơ đồ vịng đời tuyến trùng C elegans 13 Hình Cấu trúc thể lưỡng tính đực C elegans 14 Hình Vịng đời tuyến trùng C elegans 15 Hình Chuỗi kỹ thuật phân lập tuyến trùng 20 Hình Cấu trúc thực quản dịng T48.1- CFB50 (A Chụp kính hiển vi, B Sơ đồ hóa thực quản) 27 Hình Cấu trúc Thực quản dòng T48.1- CFB50 28 Hình 3 Cấu trúc Thực quản dịng T48.1- CFB135 29 Hình Cấu trúc Thực quản dòng T48.1- CFB104 30 Hình Cấu trúc Thực quản dòng T48.1- CFB234 31 Hình Hình điện di sản phẩm MultiplexPCR số mẫu nghiên cứu 32 Hình Cây phân loại dựa trình tự 18S rDNA dịng CFB108 45 Hình Cây phân loại dựa trình tự 18S rDNA dịng CFB50, CFB104, CFB135, CFB 234 46 Hình Đồ thị tỷ lệ sống sót cá thể theo thời gian 54 MỞ ĐẦU Tuyến trùng thuộc giống Caenorhabditis nhóm tuyến trùng có kích thước nhỏ, sống tự đất dinh dưỡng vi khuẩn, có độ dài khoảng 1,0 đến 2,0mm, đường kính khoảng 50 - 70 µm tuổi trưởng thành, Lồi tuyến trùng phổ biến vùng nóng ẩm nhiệt đới Trong nhóm tuyến trùng có hai nhóm lồi theo giới tính: đực lưỡng tính đực Vì vậy, chúng có khả giao phối-thụ tinh chéo giao phối-tự thụ tinh để sinh hệ sau Thế giới tập trung nghiên cứu nhiều Caenohabditis Khoảng 60 lồi biết đến phân bố quanh vùng xích đạo nơi có nhiều nguồn thức ăn vi khuẩn Trong đó, gần 20 lồi giải mã trình tự gen Trong giống Caenorhabditis lồi C elegans giải mã chi tiết trình tự gen thức cơng bố vào năm 1998 với chất lượng hồn thiện tốt Vì vậy, có nhiều hiểu biết sâu rộng sinh lý, giải phẫu di truyền loài tuyến trùng Những quy trình kỹ thuật nói chung cần thiết cho nghiên cứu loài thuận lợi C elegans trở thành mô hình tuyến trùng điển hình cho nghiên cứu sinh học bản, nghiên cứu so sánh nghiên cứu phân loại lồi tuyến trùng có quan hệ họ hàng gần gũi C brisggsae Chương trình nghiên cứu tiếp tục với nhiều loài tuyến trùng khác giống Caenorhabditis Mặc dù loài tuyến trùng chưa có ý nghĩa trực tiếp mặt kinh tế người đối tượng nghiên cứu sinh y học có ý nghĩa khoa học to lớn Chính vậy, người muốn biết nhiều, nhiều chủng loài tuyến trùng Việt Nam quốc gia có lãnh thổ nằm vùng sinh thái nhiệt đới ẩm ướt, nguồn vi khuẩn, thức ăn tuyến trùng phong phú nên dự đốn chúng có tính đa dạng cao Tuy nhiên, nghiên cứu phân lập họ Caenorhabditis cịn hạn chế Vì vậy, điều ln muốn biết đa dạng sinh học mức độ khác lồi tuyến trùng nói chung lồi tuyến trùng thuộc giống Caenorhabditis nói riêng Hiện nay, tìm kiếm loài sinh vật cần thiết nhằm bổ sung hoàn thiện hiểu biết đa dạng sinh học dòng tuyến trùng Caenorhabditis làm sở cho sinh học sở sinh học so sánh khoa học phân loại loài Do vậy, cấu trúc phân loại nhóm tuyến trùng cần mở rộng chỉnh lại đầy đủ xác Nhiều loài cần thiết cho nghiên cứu so sánh loài Caenorhabditis chị em Trên sở thực tiễn tơi tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại tuyến trùng giống Caenorhabditis (Nematoda: Rhabditidae) phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên, Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu * Ý nghĩa khoa học: - Nghiên cứu phân lập lồi thuộc giống Caenorhabditis tự nhiên cho khu hệ - Xác định số tiêu hình thái, kích thước cấu tạo dòng tuyến trùng khác thuộc giống Caenorhabditis Làm sở cho phân loại - Giải mã trình tự DNA 18S tuyến trùng giống Caenorhabditis Từ góp phần đưa phương pháp phân loại hiệu việc tìm lồi tuyến trùng giống Caenorhabditis kỹ thuật sinh học phân tử * Ý nghĩa thực tiễn: - Xác định lồi thuộc giống Caenorhabditis tự nhiên Mỗi lồi có đặc điểm đặc trưng mà khơng giống với lồi khác Do cấu trúc phân tử nhóm tuyến trùng mở rộng điều chỉnh lại đầy đủ xác Kết nghiên cứu góp phần tạo sở liệu Việt Nam loài tuyến trùng Caenorhabditis - Kết nghiên cứu ban đầu góp phần cung cấp sở liệu hình thái sinh học phân tử dòng thuộc giống Caenorhabditis phục vụ cho tra cứu tham khảo Từ góp phần làm tăng lên lý thuyết số loài tuyến trùng Caenorhabditis phân lập tự nhiên, nhiều hệ gen giải mã hoàn thiện Với kỹ thuật sinh học phân tử liên quan tới DNA phổ biến xu hướng nghiên cứu so sánh khía cạnh sinh học loài Caenorhabditis diễn thuận lợi - Đề tài nghiên cứu thực nghiệm khởi đầu sinh học cơng nghệ sinh học cách có hệ thống đối tượng Caenorhabditis nói chung Việt Nam 48 sống trung bình cá thể thuộc dịng C brenneri CFB50 tính tốn 10,67 ngày 3 Đặc điểm tuổi thọ dòng C sinica CFB108 Trong đợt lấy mẫu đợt thu dịng C sinica CFB108 Thí nghiệm tuổi thọ với tổng số 79 cá thể dòng cho thấy: Đến ngày thứ 20 số cá thể sống sót khơng 79 cá thể có tổng thời gian sống 962 ngày Thời gian sống trung bình cá thể dòng C sinica CFB108 12,2 ngày Bảng Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C.sinica CFB108 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tổng Tổng số cá thể chết theo ngày 12 13 13 79 Trung bình Số ngày sống 0 0 0 24 108 130 143 96 52 84 105 16 85 72 40 962 12,18 Số cá thể sống theo thời gian 79 79 79 79 79 79 78 75 63 50 37 29 25 19 12 11 2 Tỷ lệ (%) sống sót 100 100 100 100 100 100 98,73 94,94 79,75 63,30 46,84 36,71 31,65 24,05 15,19 13,92 7,60 2,53 2,53 49 3 Đặc điểm tuổi thọ dòng C brenneri CFB135 Trong đợt lấy mẫu đợt thu dòng C brenneri CFB135 Thí nghiệm tuổi thọ với tổng số 64 cá thể dòng cho thấy: Tổng thời gian sống 1120 ngày Thời gian sống trung bình cá thể dòng C brenneri CFB135 17,5 ngày Bảng 10 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dòng C brenneri CFB35 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Tổng Tổng số cá thể chết theo ngày 1 1 3 3 64 Trung bình Số ngày sống 0 0 0 18 10 11 36 91 28 75 48 102 54 152 60 63 66 92 72 75 52 1120 17,5 Số cá thể sống theo thời gian 64 64 64 64 64 64 63 62 60 59 58 55 48 46 41 38 32 29 21 18 15 12 Tỷ lệ (%) sống sót 100 100 100 100 100 100 98,44 96,88 93,75 92,19 90,63 85,94 75 71,88 64,1 59,38 50 45,31 32,81 28,12 23,43 18,75 12,5 7,81 3,12 50 3 Đặc điểm tuổi thọ dòng C brenneri CFB104 Mẫu đợt thu dòng C brenneri CFB104 Thí nghiệm tuổi thọ với tổng số 46 cá thể dịng cho thấy: Thời gian sống trung bình cá thể 13,3 ngày Bảng 11 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C brenneri CFB104 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tổng Tổng số cá thể chết theo ngày 1 5 12 2 1 46 Trung bình Số ngày sống 0 0 0 50 55 72 156 28 105 32 17 36 20 22 610 13,26 Số cá thể sống theo thời gian 46 46 46 46 46 46 46 45 44 39 34 28 16 14 2 1 Tỷ lệ (%) sống sót 100 100 100 100 100 100 100 97,83 95,65 84,78 73,91 60,87 34,78 30,44 15,22 10,87 8,70 4,35 4,35 2,17 2,17 51 3 Đặc điểm tuổi thọ dòng C brenneri CFB234 Dòng C brenneri CFB234 dòng mẫu lấy đợt đợt với dòng C brenneri CFB135 Thí nghiệm tuổi thọ với tổng số 42 cá thể dòng cho thấy: Thời gian sống trung bình cá thể dịng C brenneri CFB234 cá thể 15,69 ngày Bảng 12 Thí nghiệm tuổi thọ trung bình (ngày) dịng C brenneri CFB234 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Tổng Tổng số cá thể chết theo ngày 1 2 10 2 1 42 Trung bình Số ngày sống 0 0 0 20 22 24 130 28 60 34 36 57 100 84 22 0 25 659 15,69 Số cá thể sống theo thời gian 42 42 42 42 42 42 42 41 40 38 36 34 24 22 18 18 16 14 11 1 Tỷ lệ (%) sống sót 100 100 100 100 100 100 100 97,62 95,24 90,48 85,71 80,95 57,14 52,38 42,86 42,86 38,09 33,33 26,19 14,29 4,76 2,38 2,38 2,38 52 Khảo sát tuổi thọ dòng tuyến trùng khảo sát ta thu bảng sau: Bảng 13 Bảng khảo sát kết tuổi thọ dòng tuyến trùng Ceanorhaditis Số hiệu đợt lấy mẫu Đợt 01 Đợt 02 Đợt 03 Đợt 02 Đợt 03 Tên dòng C brenneri CFB50 C sinica CFB108 C brenneri CFB135 C brenneri CFB104 C brenneri CFB234 Số mẫu thí nghiệm Ngày có cá thể chết cực đại Tuổi thọ (ngày) 70 14 10,7 79 10, 11 12,2 64 13 17,5 46 13 13,3 42 13 15,7 Các dịng tuyến trùng nghiên cứu có tuổi thọ trung bình cá thể khác nhiều nằm khoảng từ 10 đến 18 ngày Kết cho thấy 05 dòng tuyến trùng nghiên cứu thuộc giống Ceahanoditis có tuổi thọ hồn tồn phù hợp với kết nghiên cứu trước Tuy nhiên có khác dịng cho thấy chúng lồi có họ hàng gần với đặc biệt dòng C brenneri lồi chị em gần Trên thực tế độ xác kết nghiên cứu phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: Thời điểm lấy mẫu, điều kiện bảo quản mẫu, điều kiện ni… từ kết có thể có sai số định Chính việc sử dụng số phương pháp xử lý thống kê thao tác tin – sinh học thật cần thiết để đánh giá độ tin cậy kết thí nghiệm 53 3 So sánh tuổi thọ dòng tuyến trùng thuộc giống Caenorhabditis Bảng 14 Sự so sánh tuổi thọ dòng tuyến trùng thuộc giống Caenorhabditis Dòng tuyến Số cá trùng thể thí Caenorhabditis nghiệm (số hiệu) Tuổi thọ trung bình (Tuổi thọ trung bình ± độ lệch) 50 70 108 79 12,18 ± 0,35 135 64 17,5 ± 0,6 104 46 13,26 ± 0,41 234 42 15,69 ± 0,64 Giá trị P hai dòng 108 135 104 234 > 0,05 < 0,001