(Luận văn) nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng cường độc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THỊ LIÊN lu an n va NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC GÂY gh tn to HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN p ie TỪ CHỦNG CƯỜNG ĐỘC oa nl w Thú y d Chuyên ngành: lu 60 64 01 01 an Mã số: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào oi lm ul nf va Người hướng dẫn khoa học: z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 lu Tác giả luận văn an n va to p ie gh tn Đỗ Thị Liên d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hồn thành luận văn tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ quý báu quý thầy cô, anh chị bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa thú y, thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt nam chia sẻ tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y cho phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới Thầy, Cô giáo lu an Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào môn Bệnh va Lý, Khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn tơi n suốt thời gian thực tập tốt nghiệp khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, anh chị phịng thí nghiệm trung gh tn to Đồng thời bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Bệnh Lý, p ie tâm tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người Xin trân trọng cảm ơn ! oa nl w động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp d Hà Nội, ngày tháng năm 2016 lu oi lm ul nf va an Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii lu Thesis abstract xi an Phần Mở đầu n va Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu gh tn to 1.1 Lịch sử tình hình dịch bệnh PRRS lợn 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới p ie 2.1 Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS) oa nl 2.2 Tình hình dịch PRRS Việt Nam w 2.1.2 Căn bệnh 2.2.2 Đặc điểm dịch tễ học 13 2.2.3 Triệu chứng 16 2.2.4 Bệnh tích 18 2.2.5 Chẩn đoán 19 2.2.6 Biện pháp phòng điều trị 21 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nghiên cứu virus học 23 2.3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 23 2.3.2 Điều kiện nuôi cấy 24 2.3.3 Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào 25 2.3.4 Khả tiếp truyền virus PRRS dòng tế bào MARC-145 25 d 2.2.1 oi lm ul nf va an lu z at nh z l gm @ m co Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 27 Địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Thời gian nghiên cứu 27 3.3 Vật liệu nghiên cứu 27 an Lu 3.1 n va ac th iii si lu an n va Nguyên liệu 27 3.3.2 Động vật thí nghiệm 27 3.3.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 27 3.4 Nội dung nghiên cứu 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 28 3.5.1 Phương pháp tiếp truyền virus tế bào MARC-145 28 3.5.2 Giám định virus PRRS phương pháp RT-PCR 31 3.5.3 Bố trí thí nghiệm 35 3.5.4 Xác định hàm lượng kháng thể có máu 37 3.5.5 Phương pháp khám lâm sàng 38 3.5.6 Phương pháp đo tiêu huyết học 38 3.5.7 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể 38 3.5.8 Phương pháp làm tiêu bệnh lý 39 3.5.9 Phương pháp xử lý số liệu 40 gh tn to 3.3.1 p ie Phần Kết thảo luận 41 Kết đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 qua đời 4.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào CPE chủng virus d oa 4.1.1 nl w cấy chuyển 41 lu cường độc KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển 41 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 43 4.1.3 Kết xác định đường cong nhân lên môi trường tế bào 44 4.2 Kết đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 qua oi lm ul nf va an 4.1.2 đời cấy chuyển 47 Kết so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 chủng virus z at nh 4.2.1 PRRS nghiên cứu đời cấy chuyển khác 47 Kết giải trình tự amino acid 52 4.3 Kết tính kháng nguyên chủng virus KTY-PRRS-08 cấy z 4.2.2 @ Kết nghiên cứu độc lực chủng virus KTY-PRRS-08 cấy m co l 4.4 gm chuyển môi trường marc-145 đời 90 56 chuyển môi trường marc-145 đời 90 58 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước sau gây nhiễm virus 58 4.4.2 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus 60 an Lu 4.4.1 n va ac th iv si 4.4.3 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus 62 4.4.4 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus 62 4.4.5 Kết biến đổi bệnh lý đại thể lợn thí nghiệm 64 4.4.6 Kết biến đổi bệnh lý vi thể lợn thí nghiệm 65 Phần Kết luận kiến nghị 66 5.1 Kết luận 66 5.2 Kiến nghị 67 Tài liệu tham khảo 68 lu an Phụ lục 73 n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va p ie gh tn to Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DPI Day Post Inoculated DWP Deep-well-plate ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay H.E Hematoxylin & Eosin IPMA Immuno – Peroxidase Monolayer Assay LDHV Lactic dehydrogennase virus NXB Nhà xuất OIE Tổ chức thú y giới PBS Phosphate Buffer Saline w Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome d oa nl PCR Virus nf Ribonucleic Acid oi lm ul RT – PCR Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome va RNA an lu PRRSV Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction TCID50 Tryptose Phosphate Broth TMB Tissue Culture Infective fifty percent Dose z at nh TPB z 3,3’,5,5’-Tetrammethylbenzidine m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV Bảng 2.2 Sức đề kháng PRRSV 12 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 31 Bảng 3.2 Các bước thực phản ứng RT-PCR 32 Bảng 3.3 Bảng bố trí thí ngiệm 36 Bảng 4.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào (CPE) mơi trường tế lu bào MARC-145 42 an Bảng 4.2 Kết giám định bệnh tích tế bào RT-PCR 42 va n Bảng 4.3 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 43 tn to Bảng 4.4 Vị trí sai khác nucleotide chủng KTY-PRRS-08 sau đời cấy gh chuyển khác tế bào MARC-145 50 p ie Bảng 4.5 So sánh tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng KTY-PRRS- 08 đời cấy chuyển 51 nl w Bảng 4.6 Vị trí sai khác amino acid chủng KTY-PRRS-08 đời cấy oa chuyển tế bào MARC-145 54 d Bảng 4.7 So sánh tương đồng amino acid đoạn gene ORF5 chủng KTY- lu an PRRS-08 đời cấy chuyển 55 va Bảng 4.8 Kết xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV lợn trước gây ul nf nhiễm chủng virus KTY-PRRS-08 56 oi lm Bảng 4.9 Kết xét nghiệm kháng thể sau gây nhiễm chủng virus KTYPRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 57 z at nh Bảng 4.10 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước sau gây nhiễm virus 59 Bảng 4.11 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus 61 z Bảng 4.12 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus 62 @ gm Bảng 4.13 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus .63 l Bảng 4.14 Bệnh tích đại thể số khí quan lợn thí nghiệm 64 m co Bảng 4.15 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn thí nghiệm 65 Bảng 4.16 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn lơ đối chứng 65 an Lu n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao châu Á từ năm 2006 đến năm 2010 Hình 2.2 Hình thái virus PRRS .7 Hình 2.3 Cấu trúc gen PRRSV Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 Hình 4.1 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTY- lu PRRS-08-P#10 44 an Hình 4.2 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTY- va PRRS-08-P#30 45 n tn to Hình 4.3 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#90 45 gh ie Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus KTY- p PRRS-08 qua đời cấy chuyển 49 w Hình 4.5 So sánh trình tự amino acid gene ORF5 chủng virus KTY- oa nl PRRS-08 qua đời cấy chuyển 53 d Hình 4.6 Biểu đồ diễn biến hàm lượng kháng thể kháng chủng virus KTY- oi lm ul nf va an lu PRRS-08-P#90 máu lợn thí nghiệm 58 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Liên Tên Luận văn: Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu lu Tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ an chủng cường độc phân lập Việt Nam phục vụ công tác chế tạo vacxin phịng Hội n va chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn tn to Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiếp truyền virus tế bào MARC-145, phương pháp chiết tách gh ie ARN, phương pháp RT-PCR phương pháp giải trình tự gen, phương pháp đọc kết p giải trình tự gen, phương pháp ELISA, phương pháp khám lâm sàng, phương pháp đo tiêu huyết học, phương pháp xử lý số liệu w oa nl Kết kết luận d Đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển an lu Chủng KTY-PRRS-08 bắt đầu gây bệnh tích tế bào vào thời điểm 12 va bệnh tích đạt 100% vào thời điểm 60 sau gây nhiễm đời tiếp truyền nf đời tiếp truyền thứ 30 Từ đời tiếp truyền 40 đến 90, thời điểm bắt đầu xuất 48 oi lm ul bệnh tích tế bào sớm thời điểm bệnh tích đạt 100% rút ngắn xuống z at nh Chủng virus KTY-PRRS-08 có hiệu giá tương đối cao, ổn định qua đời cấy chuyển, hiệu giá virus cao xác định đời 50 với giá trị 8,12 ± 0,87 x 107 Quy luật nhân lên chủng virus KTY-PRRS-08 có thay đổi đời từ z gm @ đời 30 Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển l Đã xác định trình tự nucleotide đoạn ORF5 chủng KTY-PRRS-08 m co đời cấy chuyển Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY-PRRS-08 có kích thước 603bp mã hố cho 200 amino acid protein kháng an Lu nguyên GP5 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, n va ac th ix si Bảng 4.11 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus LôTN Lô ĐC n=3 n=3 X ± mx X ± mx 19,4 ± 0,2 17,5 ± 0,3 19,5 ± 0,3 15,6 ± 0,1 18,6 ± 0,1 18,4 ± 0,2 17,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 19,4 ± 0,2 19,5 ± 0,3 19,5 ± 0,3 15,6 ± 0,1 18,6 ± 0,1 19,4 ± 0,2 20,4 ± 0,2 15,4 ± 0,2 24,4 ± 0,2 14,5 ± 0,3 25,4 ± 0,2 19,6 ± 0,1 19,5 ± 0,3 16,4 ± 0,2 19,6 ± 0,1 19,5 ± 0,3 16,4 ± 0,2 19,6 ± 0,1 15,4 ± 0,2 19,4 ± 0,2 19,4 ± 0,2 15,5 ± 0,3 18,5 ± 0,3 18,4 ± 0,5 19,5 ± 0,3 16,5 ± 0,5 16,4 ± 0,2 19,5 ± 0,3 19,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 z at nh Thời gian theo dõi ( ngày) lu Trước gây nhiễm virus an n va p ie gh tn to d oa nl w 12 oi lm 11 ul 10 nf va an lu Sau gây nhiễm virus 14,5 ± 0,3 17,5 ± 0,3 14 15,6 ± 0,1 19,5 ± 0,2 15 19,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 16 16,4 ± 0,2 17 17,5 ± 0,3 18 16,6 ± 0,1 19 18,4 ± 0,2 20 19,5 ± 0,1 21 16,4 ± 0,1 z 13 @ 16,5 ± 0,3 16,5 ± 0,3 m co l gm 19,2 ± 0,3 19,5 ± 0,3 an Lu 16,5 ± 0,3 18,5 ± 0,3 n va ac th 61 si 4.4.3 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus Các triệu chứng lâm sàng ln có ý nghĩa vơ quan trọng góp phần tích cực cơng tác chẩn đốn nghiên cứu lĩnh vực thú y Trước gây nhiễm virus tiến hành theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn Kết cho thấy trước lợn gây nhiễm virus khơng có triệu chứng lâm sàng bệnh như: sốt, giảm ăn, bỏ ăn, táo bón, chảy nước mũi, tiêu chảy, thở khó … Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn thí nghiệm sau gây nhiễm virus động vật trình bày bảng 4.12 lu an Bảng 4.12 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus va Triệu chứng lâm sàng n Phát ban Mí mắt sưng Ho, khó thở Tím tái Chảy nước mũi Tiêu chảy Táo bón TN1 + - - - - - - - - TN2 + - - - - - - - - oa + - - - - - - - - - - - - - - - - - va to Sốt Giảm ăn, bỏ ăn - - - - - - - - - - - - - - - - - - p ie gh tn STT nl w Lô TN TN3 d ĐC2 an ĐC1 lu Lô ĐC oi lm z at nh (+) Biểu ul Ghi chú: (-) Không biểu nf ĐC3 z Qua bảng 4.12 cho thấy lợn thí nghiệm sau gây nhiễm virus sốt nhẹ lợn đối chứng khơng có biểu sốt Các triệu chứng lâm sàng khác như: bỏ ăn hay giảm ăn, ho, khó thở, mí mắt sưng, tím tai, cháy nước mũi, gm @ táo bón, ỉa chảy, không biểu lô đối chứng lơ thí nghiệm l m co 4.4.4 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus an Lu Trong thể, máu cung cấp chất dinh dưỡng, dưỡng khí cho tổ chức tế bào, đưa chất thải đến quan tiết Nó mối liên hệ bên n va ac th 62 si tỏ chức quan thể Máu cịn có chức bảo vệ thể Khi thể bị bệnh có chất lạ xâm nhập vào thể tính chất, thành phần máu có thay đổi tương ứng đặc hiệu mà dựa vào để chẩn đốn bệnh Bảng 4.13 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus Thời gian Chỉ tiêu lu SLHC (triệu/µl) (n=3) an 110,05±0,85 113,2±0,24 7,56±0,52 7,5±0,5 53,2±0,22 53,08±0,18 BCAT (%) 5,48±0,17 5,6±0,37 BCAK (%) 0,58±0,54 0,48±0,34 BCDNL (%) 6,22±0,94 6,3±0,34 34,52±0,74 34,54±0,44 6,21±0,42 6,18±0,43 115,35±0,15 112,2±0,4 11,07±0,2 7,4±0,4 55,22±0,21 53,22±0,41 5,46±0,17 5,46±0,7 0,62±0,54 0,6±0,44 6,2±0,94 6,3±0,14 32,5±0,74 34,42±0,24 va n to gh tn Trước gây BCĐNTT (%) p ie d oa nl w Tế bào Lympho (%) an lu SLHC (triệu/µl) va Hàm lượng Hb (g/l) oi lm ul nf SLBC (nghìn/µl) BCĐNTT (%) BCAT (%) BCAK (%) z BCDNL (%) z at nh nhiễm (n=3) 6,15±0,4 SLBC (nghìn/µl) Sau gây Lô ĐC 6,01±0,14 Hàm lượng Hb (g/l) nhiễm Lô TN @ l gm Tế bào Lympho (%) m co Trong số nhiều tiêu sinh lý máu tiến hành kiểm tra số tiêu quan trọng, bao gồm: số lượng hồng cầu, hàm lượng Hb, bạch cầu toan, bạch cầu kiềm, bạch cầu đơn nhân lớn, số lượng bạch cầu, bạch cầu đa an Lu nhân trung tính, tế bào lympho n va ac th 63 si Kết bảng 4.13 cho thấy, số tiêu sinh lý máu như: số lượng hồng cầu, hàm lượng Hb, bạch cầu toan, bạch cầu kiềm, bạch cầu đơn nhân lớn lợn lơ đối chứng thí nghiệm trước sau gây nhiễm virus khơng có biến đổi nhiều, dao động xung quanh số sinh lý bình thường Tuy nhiên, số lượng bạch cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho lại có thay đổi đáng kể lợn thí nghiệm sau gây nhiễm virus KTY-PRRS-08 so với lợn đối chứng số lượng bạch cầu tăng từ 7,56±0,52 nghìn/µl tới 11,07±0,2 nghìn/µl, bạch cầu đa lu nhân trung tính tăng 53,2% tới 55,22%, tế bào lympho 34,52% giảm xuống 32,5% Điều lợn gây nhiễm virus, thể tự huy động bảo vệ thể để chống lại tác nhân lạ xâm nhập vào thể Trong có an tượng thực bào, mà vai trò lớn bạch cầu đa nhân va n 4.4.5 Kết biến đổi bệnh lý đại thể lợn thí nghiệm khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể Kết thể bảng 4.14 gh tn to Đối với lợn thí nghiệm thời gian theo dõi tiến hành mổ p ie Bảng 4.14 Bệnh tích đại thể số khí quan lợn thí nghiệm 0/3 Viêm màng phổi Phổi xuất huyết 0/3 0/3 Phổi đặc căng phồng 0/3 0/3 Hạch phổi có bệnh tích 0/3 0/3 Ruột non xuất huyết 0/3 0/3 Ruột già xuất huyết 0/3 0/3 Thận xuất huyết 0/3 0/3 Tổn thương gan 0/3 0/3 Tổn thương tim 0/3 0/3 10 Tổn thương lách 0/3 0/3 11 Tổn thương hạch amidan 0/3 12 Tổn thương não 0/3 d 0/3 gm Lô đối chứng an KTY-PRRS-08 oa nl Số có biểu Bệnh tích w STT lu oi lm ul nf va z at nh z @ m co l 0/3 an Lu 0/3 n va ac th 64 si Kết quan sát bệnh tích đại thể lơ thí nghiệm gây nhiễm với chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 khơng quan sát thấy có bệnh tích đại thể quan giống với lơ đối chứng 4.4.6 Kết biến đổi bệnh lý vi thể lợn thí nghiệm Với lợn thí nghiệm, sau mổ khám quan sát biến đổi đại thể, tiến hành lấy mẫu quan: phổi, lách, hạch lâm ba, thận, ruột ngâm bảo quản formalin 10% sau làm tiêu vi thể, nhuộm đọc kính hiển vi thu kết bệnh tích vi thể lơ thí nghiệm lơ đối chứng trình bày bảng 4.15 4.16 lu an Bảng 4.15 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn thí nghiệm Hạch phổi Hạch amidan Gan lách Thận tim Sung huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 gh 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Thâm nhiễm tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Thoái hoá tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Huyết khối lòng mạch 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 va Phổi n Bệnh tích tn to Xuất huyết p ie d oa nl w va an lu Tăng sinh nang lympho Hạch Ruột ruột Bảng 4.16 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn lơ đối chứng Hạch Hạch phổi amidan Phổi Lách Thận Tim 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Xuất huyết 0/3 0/3 Thâm nhiễm tế bào 0/3 0/3 Thoái hoá tế bào 0/3 0/3 0/3 Huyết khối lòng mạch 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh nang lympho 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 z gm @ m co Sung huyết z at nh 0/3 Hạch Ruột ruột Gan l oi lm ul nf Bệnh tích an Lu Kết quan sát bệnh tích vi thể lơ đối chứng khơng quan sát thấy có bệnh tích vi thể quan giống với lô đối chứng n va ac th 65 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết thu nghiên cứu chúng tơi có số kết luận sau: Đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Chủng KTY-PRRS-08 bắt đầu gây bệnh tích tế bào vào thời điểm 12 bệnh tích đạt 100% vào thời điểm 60 sau gây nhiễm đời tiếp truyền đời tiếp truyền thứ 30 Từ đời tiếp truyền 40 đến 90, thời điểm lu an bắt đầu xuất bệnh tích tế bào sớm thời điểm bệnh tích đạt 100% n va rút ngắn xuống 48 đời cấy chuyển, hiệu giá virus cao xác định đời 50 với giá trị 8,12 ± 0,87 x 107 p ie gh tn to Chủng virus KTY-PRRS-08 có hiệu giá tương đối cao, ổn định qua Quy luật nhân lên chủng virus KTY-PRRS-08 có thay đổi đời nl w từ đời 30 d chuyển oa Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy lu an Đã xác định trình tự nucleotide đoạn ORF5 chủng KTY-PRRS- nf va 08 đời cấy chuyển Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 protein kháng nguyên GP5 oi lm ul chủng virus KTY-PRRS-08 có kích thước 603bp mã hố cho 200 amino acid Kết phân tích trình tự nucleotide amino acid cho thấy chủng virus z at nh KTY-PRRS-08 có ổn định di truyền kháng nguyên sau 90 đời cấy chuyển với mức độ tương đồng cao từ 98,67% đến 100% nucleotide từ z @ 97% đến 100% amino acid gm Tính kháng nguyên chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi m co l trường MARC-145 đời 90 Sau 10 ngày gây nhiễm có hàm lượng kháng thể máu lợn thí an Lu nghiệm gây nhiễm virus chủng KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 n va ac th 66 si Thử độc lực chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 Chủng virus cường độc KTY-PRRS-08 nhược độc sau 90 đời cấy chuyển 5.2 KIẾN NGHỊ Bệnh PRRS bệnh phổ biến, gây nhiều thiệt hại to lớn cho người chăn ni Hiện chưa có thuốc chữa trị mang lại hiệu bên cạnh chưa có nhiều chủng vacxin phịng bệnh hồn tồn lu đề tài theo dõi ngày trở nên cấp thiết bao an hết Tuy nhiên điều kiện không cho phép nên nghiên cứu va n chủng virus KTY-PRRS-08 Để nghiên cứu hoàn thiện đưa tn to kiến nghị: gh Tiếp tục thu thập thêm mẫu nghi bệnh từ thực địa để tìm thêm p ie chủng virus phục vụ cho sản xuất vacxin vô hoạt Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gen đoạn gen cịn lại virus nl w PRRS tiến tới giải trình tự tồn hệ gen virus phát biến d oa chủng để chế tạo vacin có hiệu phòng bệnh cao lu Tiếp tục nghiên cứu thêm biểu lâm sàng, tiêu huyết an học hàm lượng kháng thể lợn tiêm thử nghiệm chủng virus KTY-PRRS- oi lm ul thử nghiệm nf va 08 qua đời cấy chuyển để có tranh hoàn thiện chủng virus z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 67 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Quang Anh Nguyễn Văn Long (2007) Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (lợn tai xanh) tình hình Việt nam Diễn đàn khuyến nông công nghệ, Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn, tháng 8/2007 Cục Thú Y (2007) Báo cáo hội thảo khoa học phòng chống hội chứng Rối lu loạn hô hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội an Hồng Văn Năm (2001) Hội chứng sinh sản hơ hấp lợn (bài dịch tổng hợp) va Tạp chí khoa học thú y Số 1/2002 Tr 74- 87 n Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2009) Giáo trình Miễn dịch học thú y, tn to Nhà xuất Nơng Nghiệp Giáo trình Bệnh Truyền Nhiễm Thú Y, Nhà xuất Đại Học Nông Nghiệp ie Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh Đỗ Ngọc Thuý (2012) p gh Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh w oa nl sản, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp-sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, d ngày 11/10/2007, Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng (2012) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh an lu va sản, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp-sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, Nguyễn Văn Thanh (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS), Hội oi lm ul nf ngày 11/10/2007, Đại học Nông Nghiệp hà Nội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày z at nh 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Xuân Bảo (2013) Đánh giá hiệu sử dụng vacxin nhược độc đơng khơ z chủng JXA1-R thể độc lực cao phịng, chống hội chứng rối loạn hô hấp sinh @ gm sản lợn tỉnh Quảng Nam Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp Trường Đại học Tiêu Quang An Nguyễn Hữu Nam (2011) Một số đặc điểm bệnh lý đại thể m co 10 l Nông nghiệp Hà Nội vi thể lợn bị Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản (PRRS) Tạp chí khoa học 11 an Lu Thú y, Tập XVIII, số 6-2011, trang 24-30 Tô Long Thành, Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Khoa học kỹ n va ac th 68 si thuật Thú Y tập XIV, số 3/2007, Tr.81-88 12 William Tchristianson Han Soo Joo (2001) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) Tạp chí KHKT Thú y, (tập VIII) số - 2001, tr 74 – 86 Tiếng Anh: 13 Ansari, I H., Kwon, B., Osorio, F A & Pattnaik, A K (2006) Influence of Nlinked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies J Virol 80, 3994-4004 lu an 14 Ausvetplan (2004) Disease stratery porcine reproductive and respỉatory va syndrome n 15 Benfield DA and Nelson (1992) Characterrization of swine infertility and to tn respiratory syndrome (SIRS) virus, South Dakota; South Dakota State gh University, NPPC Final Report 1705 p ie 16 Bierk M.S., Dee, K.Rossow, J.Collins, S.Otake and T.Monitor (2011) Transmission of PRRS virus from persistently infected sows tocontact controls, Botner A, B Strandbygaard, K, J Sorensen, P Have, K G Madsen, S Madsen d oa 17 nl w Can.J.Vet.Res 65(4) 261-266 lu and S Alexandersen (1997) Appearance of acute PRRS- like symptom in sow 18 va an herds after vacinasion with a modified live vaccine, Vet Rec 141:497- 499 Bush J.A and W.N Wintrobe (1995) Blood volume Studisesn in nomal and nf 19 Coles (2004) 20 Veterinary clinical pathology, Third edition, Part 16, z at nh Microbiology oi lm ul Anemic swine, Am.J.Physilo pp, 181-192 Collins J.E., D.A Benfield, W.T Christianson, L Harris, J.C Hennings, D.P Shaw and S.M Goyal (1992) Isolation of swine intertility and expiratory z @ syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North American and experimental Dea S., C A Gagnon, H Mardassi, B Pirzadeh and D Rogan (2000) Current m co l 21 gm reproduction of the disease in gnotobiotic pigs, J.vet Diagn Invest 4, 117-126 knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory an Lu syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145, 659-688 n va ac th 69 si 22 Gao Z.Q., X Guo and H.C Yang (2004) Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Archives of virolory 149, 1341-1351 23 Gilbert S.A and R Larochelle (1996) Typing of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome viruses by a Multiplex PCR Assay, Journal or Clinical Microiology, 264-267 24 Grebennikova T.V., A.V Syroeshkin, M.I Musienko, A.D Zaberezhny and T.I Aliper (2005) Changes of microelement content in Marc-145 cells before and after infection with virulent and attenuated strains of PRRS virus 2005 lu an International PRRS Symposium Westport Conference Center, St Louis, va Missouri December 2-3, 2005 n 25 Han-kook C., C Choi, J Kim and C Chae (2002) Detection and differentiation to tn of North American and European genotypes of porcine reproductive and p ie gh respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by Han J and Y Wang (2006) Complete genome analanysis of RFLP 184 isolates 26 multiplex reverse transcription-nested PCR, p59 183 d Kappes M A and K S Faaberg (2015) PRRSV structure, replication and lu 27 oa nl w of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Virus research 122, 175- 475-486 nf va an recombination: Origin of phenotype and genotype diversity Virology 479-480, Keffaber K.K (1989) Presented at the American Swine Practioner 29 Kim H.S., J Kwang, H.S Joo and M.L Frey (1993) Enhanced replication of oi lm ul 28 z at nh porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homegenneus subpopulation of MA-104 cell line Arch Virol., 133:477-483 30 Leng X., Li Z., Xia M., He Y and Wu H (2012) Evaluation of the Efficacy of z @ an Attenuated Live Vaccine against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and gm Respiratory Syndrome Virus in Young Pigs Clinical and Vaccine Immunology m co 31 l 19 (8): 1199–1206 Meng, X.J., P S Paul, P G Halbur and I Morozov (1995) Sequence an Lu comparison of open reading frames to of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Gen n va ac th 70 si Virol 76:3181-3188 32 Murtaught M.P and M.R Elam (1995) Comparation of the structure protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus, Archives of Virology, 1451-1460 33 Nelsen C.J and GenBank (1998) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Resp PRRS MLV, complete genome, May 15 34 Nodejil G and M Nielen (2003) A review of Porcine Rproductive and Respiratory syndrome virus in Dutch breeding herd, population dynamics and clinical relevance lu an 35 Ostrowski M., J A Galeota, A M Jar, K B Platt, F A Osorio and O J Lopez va (2002) Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine n reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain J Virol 76, 424136 Prieto C and J.M Castro (2000) Pathogennesis of porcine reproductive and p ie gh tn to 4250 Rossow K.D (1998) Porcine reproductive and respiratory syndrome, Vet, 37 respiratory syndrome virus (PRRS) in gestating sows, Vet.Res, số31:56-57 Terpstra C., G Wensvoort and J.M.A Pol (1991) Experimental reproduction of d oa 38 nl w Pathol, 1-20 lu porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by va an infection with Lelystad virus: Koch’s postulates fulfilled, The Veterinary Quarterly, vol 13, No.3, pp 131 – 136, Jul nf Wang X., M Eaton, M Mayer, H Li, D He, E Nelson and H J Christopher oi lm ul 39 (2007) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus productively infects z at nh monocyte-derived dendritic cells and compromise their antigene-presenting ability, Arch Virol (2007) số 152:289-303 40 Wensvoort G., C Terpstra, J M Pol, E A ter Laak, E P M Bloemraad, de z @ Kluyver, C Kragten, L van Buiten, A den Besten and F.Wagenaar (1991) gm Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelýtad virus, Vet Q, m co 41 l số 13:121-30 Yin G., L Gao, X Shu, G Yang, S Guo and W Li (2012) Genetic diversity of in southwest China from 2007 to 2009 PLoS One 7, e33756 an Lu the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates n va ac th 71 si 42 Yoon K.J and G Stevenson (1999) Porcine reproductive and respiratory syndrome, Trends in emerging viral infection of swine, số Iowa State Press p347354 43 Yu X., Z Zhou, Z Cao, J Wu, Z Zhang, B Xu, C Wang, D Hu, X Deng, W Han, X Gu, S Zhang, X Li, X Wang and K Tian (2015) Assessment of the Safety and Efficacy of an Attenuated Live Vaccine Based on Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Clin Vaccine Immunol 22(5): 493-502 44 Zimmerman J.J., K.J Yoon, R.W Willis and S.L Swenson (1997) General lu an overview of PRRSv: a perspective from the united states, veterinary n va microbiology 55:187-196 p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 72 si PHỤ LỤC lu an n va to 48hpi p ie gh tn 36hpi d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z gm @ 60hpi 72hpi l bào MARC-145 m co Hình ảnh gây nhiễm virus chủng KTY-PRRS-08 môi trường tế an Lu n va ac th 73 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w Kính hiển vi soi ngược oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu Nuôi cấy tế bào Máy PCR n va ac th 74 si Bảng ký hiệu amino acid Tên amino acid Tên viết tắt Ký hiệu G lu an n va Gly Alanine Ala A Valine Val V Leucine Leu L Isoleucine Ile I Methionine Met M Phenylalanine Phe F Tryptophan Trp W Proline Pro P Serine Ser S Threonine Thr T Cys C Tyr Y Asn B Gln Q Asp D Glu E Lys K Arg R His H p ie gh tn to Glycine w Tyrosine d oa nl Cysteine z Histidine z at nh Arginine oi lm Lysine ul Glutamic acid nf Aspartic acid va Glutamine an lu Asparagine m co l gm @ an Lu n va ac th 75 si