Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic đa chủng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc khố luận tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân Tơi cịn nhận đƣợc quan tâm giúp đỡ nhiệt tình nhiều cá nhân tập thể, tơi có lời cảm ơn sâu sắc đến ngƣời Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ban chủ nhiệm Viện Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu khố luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Văn Thắng ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung tận tình bảo, hƣớng dẫn tơi suốt thời gian thực đề tài Tôi xin cám ơn cô giáo bạn sinh viên phịng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh ,Viện Cơng nghệ sinh học lâm nghiệp nhiệt tình giúp đỡ, dẫn nhiều thời gian thực tập nghiên cứu đề tài tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, khích lệ tơi q trình thực tập, để tơi hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên Hà Thiên Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình xu hƣớng chăn nuôi Việt Nam năm gần 1.1.1 Tình hình chăn nuôi Việt Nam 1.1.2 Xu hƣớng chăn nuôi năm 2018 tƣơng lai 1.2 Tổng quan probiotic 1.2.1 Định nghĩa lịch sử nghiên cứu probiotic 1.2.2 Thành phần vi sinh vật đƣợc sử dụng probiotic 1.2.3 Đặc điểm chung vi sinh vật probiotic 1.2.4.Vai trò Probiotic với hệ tiêu hóa 10 1.2.5.Cơ chế tác động probiotic 12 1.2.6 Yêu cầu Probiotic dùng cho sản xuất thực phẩm chức 16 1.2.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng Probiotic giới nƣớc 16 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.3.1 Đối tƣợng 19 2.3.2 Dụng cụ hóa chất 19 2.3.3 Môi trƣờng nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 20 2.4.1 Xác định khả tổ hợp vi sinh vật chế phẩm 20 ii 2.4.2 Xác định chất mang thích hợp 21 2.4.3 Phƣơng pháp xác định tỉ lệ tổ hợp giống chế phẩm 21 2.4.4 Xác định tỉ lệ phối trộn sinh khối vi sinh vật với chất mang 21 2.4.5 Khảo sát nhiệt độ sấy chế phẩm 22 2.4.6 Bảo quản chế phẩm 22 2.4.7 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 22 2.4.8 Khảo sát hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định phƣơng pháp khoan lỗ thạch 23 2.4.9 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 24 2.4.10 Phƣơng pháp thử nghiệm gà tuần tuổi 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Xác định khả tổ hợp vi sinh vật chế phẩm 27 3.2 Xác định chất mang 27 3.3 Xác định tỉ lệ tổ hợp giống chế phẩm 29 3.4 Xác định tỉ lệ phối trộn sinh khối vi sinh vật với chất mang 33 3.5 Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm 34 3.6 Bảo quản chế phẩm 35 3.7 Sơ đồ tạo chế phẩm probiotic đa chủng 36 3.8 Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm Pro-NT4 gà tuần tuổi 38 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích AGP Antibiotic growth promoter CFU Colony-Forming Unit CMC Carboxymethiylcellulose ĐC Đối chứng FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc MPA Meat-Peptone Agar MRS Man, Rogosa and Sharpe TB Tế bào TSA Tryptic Soy Agar WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới AMPs Antimicrobial peptides LABs Lactic acid bacteria IECs Intestinal epithelial cells DCs Dendritic cells PAMPs Pathogen-associated molecular patterns PRR Pảhogen recognition receptors TLRs Toll-like receptor iv DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Khả phát triển chủng đĩa thạch 27 Hình 3.2: Hình ảnh chất mang đƣợc phối trộn chủng vi sinh vật 29 Hình 3.3 Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định tỉ lệ phối trộn 31 Hình 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào tỉ lệ phối trộn 32 Hình 3.5: Quy trình tạo chế phầm NT4 37 Hình 3.6: Chế phẩm Pro-NT4 38 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Mật độ vi khuẩn chất mang 28 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng tỉ lệ phối trộn chủng đến mật độ vi sinh vật , khả đối kháng vi sinh vật kiểm định khả sinh enzym ngoại bào chế phẩm 30 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng tỉ lệ phối trộn sinh khối chủng với chất mang 33 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến chế phẩm 34 Bảng 3.5 Bảo quản chế phẩm điều kiện khác 36 Bảng 3.6 Tăng trọng bình quân gà từ 28 đến 56 ngày tuổi 38 Bảng 3.7 Hệ số tiêu tốn thức ăn thời gian thí nghiệm 39 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Dân số giới dự kiến đạt 9,8 tỷ ngƣời vào năm 2050 tạo nên thách thức an ninh lƣơng thực toàn cầu, đặc biệt nƣớc phát triển Hơn tốc độ tăng trƣởng kinh tế làm tăng nhu cầu sử dụng sản phẩm chăn nuôi gây áp lực lên ngành chăn nuôi, sản xuất nhiều sản phẩm với nguồn lực hạn chế Tuy nhiên ngành chăn ni ngành có tốc độ tăng trƣởng nhanh nơng nghiệp đóng góp khoảng 40 phần trăm giá trị sản xuất nơng nghiệp tồn cầu (Bruinsma 2003) [18] hỗ trợ sinh kế an ninh lƣơng thực Tại Việt Nam, chăn nuôi cung cấp nguồn thu nhập cho nơng dân, giải đƣợc nhiều công ăn việc làm cho ngƣời lao động chống đói nghèo nơng thơn Ngồi việc nguồn thu nhập cung cấp thực phẩm dinh dƣỡng, chăn nuôi gia súc cung cấp sức kéo phân bón, nguyên liệu cho ngành sản xuất khác Mặc dù tăng sản xuất chăn nuôi mang lại nhiều lợi ích nhƣng gây hai vấn đề sức khỏe cộng đồng lớn Đầu tiên việc sử dụng kháng sinh nhƣ chất kích thích tăng trƣởng thức ăn chăn nuôi làm gia tăng diện vi khuẩn kháng thuốc gia súc, gia cầm, thủy sản sản phẩm động vật Thứ hai số bệnh từ gia súc, gia cầm lây lan sang ngƣời sử dụng thực phẩm j j j chứa mầm bệnh nhƣ campylobacteriosis salmonellosis nhiễm trùng Escherichia coli gây tổn thất đến sức khỏe cộng đồng thiệt hại kinh tế Probiotics trở nên ngày phổ biến lựa chọn thay kháng sinh kích thích tăng trƣởng (AGP) Mục tiêu quan trọng cho việc sử dụng probiotics thức ăn chăn ni để trì cải thiện hiệu suất (năng suất tăng trƣởng) vật nuôi, ngăn ngừa kiểm soát mầm bệnh đƣờng ruột Trong bối cảnh lạm dụng AGP thức ăn chăn nuôi đánh giá cao vai trò hệ sinh thái vi khuẩn đƣờng ruột việc xác định suất chăn nuôi, số lƣợng sản phẩm probiotics ngày đƣợc phát triển, tăng nhanh sử dụng chế độ dinh dƣỡng động vật Chính lý nêu trên, tơi tiến hành thực khóa luận với tiêu đề “Bƣớc đầu nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic đa chủng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.” CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình xu hƣớng chăn ni Việt Nam năm gần Trong năm gần đây, ngành chăn ni giới có nhiều biến động ngƣời tiêu dùng không đề cao hai yếu tố xanh chăn ni, mà cịn quan tâm đến phúc lợi động vật Nhiều nhân tố bất ổn nhƣ ô nhiễm môi trƣờng chăn nuôi, vệ sinh an toàn thực phẩm nhiều dịch bệnh mới…đồng thời xuất đặt vấn đề cần giải cho ngành chăn ni Nói ngắn gọn tình hình xu chung giới ảnh hƣởng đến tình hình xu chăn ni nƣớc ta 1.1.1 Tình hình chăn ni Việt Nam Theo Tổng cục Thống kê tháng 2/2018 tình hình chăn ni gia súc, gia cầm nƣớc tƣơng đối ổn định [1] Cụ thể nhƣ sau: Chăn ni trâu, bị: Ƣớc tính tổng số bị nƣớc tháng 2/2018 tăng 2,3% so với kỳ năm 2017 Chăn nuôi lợn: Ƣớc tính tổng số lợn nƣớc tháng 2/2018 giảm khoảng 5,7% so với kỳ năm 2017 Chăn ni gia cầm: Ƣớc tính tổng số gia cầm nƣớc tháng đầu năm 2018 tăng khoảng 6,9% so với kỳ năm 2017 Tuy đạt đƣợc nhiều thành tựu khả quan, chăn nuôi Việt Nam năm gần tồn nhiều vấn đề bật sau đây:  h t m t hăn nu i h ng h t m h nh s hành vi s ng m Ngày 1/4/2016, Cục Chăn nuôi có Cơng văn số 391/CN-GSN gửi Sở NN PTNT tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ƣơng việc thực phong trào k cam kết chăn nuôi an tồn, khơng sử dụng chất cấm Theo nhƣ quy định Bộ Luật Hình 2015 sửa đổi, kể từ tháng 7/ 2016 hành vi sử dụng chất cấm chăn nuôi nhƣ sản xuất buôn bán hàng giả lƣơng thực, thực phẩm, phụ gia thực phẩm, sử dụng phụ gia bị cấm thức ăn chăn ni cần cấu thành hình thức, thay cấu thành vật chất nhƣ cũ có để xử phạt Tội sử dụng chất cấm chăn ni s bị xử l hình sự, cấu thành tội liên quan đến sức khỏe, tính mạng ngƣời  Nh p h u th ăn hăn nu i tăng Theo số liệu thống kê từ Tổng cục Hải quan, 11 tháng đầu năm 2016, Việt Nam chi tỷ USD nhập thức ăn chăn nuôi nguyên liệu, tăng 1,23% so kỳ năm trƣớc  uy n hi n v i háng sinh Những năm gần việc kiểm soát kháng sinh chăn ni đƣợc đƣa vào chƣơng trình trọng điểm, tuyên chiến với kháng sinh nhƣ làm với chất cấm Mục đích để ngƣời tiêu dùng đƣợc sử dụng thực phẩm an toàn Những số thống kê cho thấy, có đến 5% thuốc kháng sinh bị lạm dụng dùng nông nghiệp, đặc biệt chăn nuôi nhằm tăng suất song lại đe dọa sức khỏe ngƣời tiêu dùng Cùng đó, kết điều tra Cục Chăn nuôi cho thấy, 94 nhà máy sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi công nghiệp địa bàn 18 tỉnh, thành phố nƣớc cho thấy, nhiều sở sử dụng hàm lƣợng kháng sinh sản xuất thức ăn cho gà, lợn cao mức quy định Điều dẫn tới nguy làm tăng tồn dƣ kháng sinh sản phẩm nhờn kháng sinh vật nuôi 1.1.2 Xu hướng chăn nuôi năm 2018 tương lai 1.1.2.1 Xu hư ng hăn nu i sản xu t th c ph m hữu Hiện thực nguồn thực phẩm bẩn lan tràn nguyên nhân khiến cho thực phẩm hữu đƣợc ƣa chuộng Thực phẩm hữu động vật vật nuôi đƣợc nuôi tự nhiên, không sử dụng chất kích thích tăng trƣởng nào, trƣờng hợp sử dụng kháng sinh để chữa bệnh đƣợc hạn chế Do đƣợc ni mơi trƣờng thiên nhiên, khơng có kích thích hay kháng sinh nên thịt hữu có ƣu điểm khơng chứa hóa chất độc hại Cũng ni tự nhiên nhƣ nên yêu cầu phải chăm sóc cẩn thận hơn, suất thấp hơn, trình nuôi kéo dài, dễ bị nhiễm bệnh nên giá thịt hữu đắt gấp nhiều lần thực phẩm thơng thƣờng Phƣơng pháp ni hữu an tồn đƣợc nhà chăn ni nƣớc ngồi áp dụng đem lại thành công Minh chứng rõ ràng hiệu thay đổi loại thịt mà ăn nhà cung cấp thịt hữu lớn nƣớc MỹApplegate Farms năm 2015 đạt đƣợc doanh thu dự kiến 340 triệu USD Đây vừa xu hƣớng vừa thách thức doanh nghiệp chăn nuôi Việt Nam tƣơng lai không xa 1.1.2.2 Xu hư ng bi n đổi gen Đây xu hƣớng cịn gây nhiều tranh cãi Nhóm ngƣời phản đối đƣa lý sinh vật biến đổi gen-GMO ngƣợc với chọn lọc tự nhiên làm cân tự nhiên, hủy hoại đa dạng sinh học Tại quốc gia Châu Âu quy định thực phẩm biến đổi gen phải dán nhãn Tại Mỹ, hầu hết thức ăn qua chế biến chứa thực phẩm biến đổi gen Các nhà khoa học l luận rằng, nhằm ứng phó với vấn đề môi trƣờng lƣơng thực biến đổi gen phƣơng án tối tân Tuy nhiên, khiến nhiều ngƣời bận tâm GMO mức độ an tồn Để dập tắt ý kiến trái chiều, tạp chí Forbes lấy nghiên cứu vào tháng 9/2014 Alison Van Eenennaam, đại học California Davis- nhà nghiên cứu di truyền học để chứng minh độ an toàn thực phẩm đột biến gen Lấy liệu thu thập từ 100 tỷ động vật, giai đoạn từ trƣớc 1996 100% thức ăn động vật chƣa có GMO, giai đoạn sau đột biến gen đƣợc phát thức giới thiệu Nghiên cứu ra, thực phẩm biến đổi gen không xuất dấu hiệu bất thƣờng nào, cực an toàn hàm lƣợng dinh dƣỡng tƣơng đƣơng với thực phẩm hữu Qua quan sát tác giả đến kết luận thực phẩm biến đổi gen không ảnh hƣởng tới giá trị dinh dƣỡng hay sức khỏe vật ni Cịn ý kiến cho ăn thực phẩm có ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời hồn tồn chƣa có chứng xác thực Mật độ vi sinh vật giảm dần tỉ lệ dịch lên men phối trộn giảm dần.Với tỉ lệ 2:1 cho mật độ vi sinh vật > 108 (CFU/g) cao thời gian sấy cao Tỉ lệ 1:1 mật độ vi sinh vật > 108 (CFU/g) thời gian sấy giảm đáng kể so với tỉ lệ phối trộn 2:1 Còn tăng tỉ lệ phối trộn lên 1:2 mật độ vi sinh vật giảm 108 (CFU/g) khả bám dinh vào chất mang chủng LT7, B.BP khơng có lợi cho việc bảo quản lâu dài Chọn tỉ lệ phối trộn 1: để tiết kiệm sinh khối, chất mang thời gian sấy mà đạt mật độ vi sinh vật tiêu chuẩn cho nghiên cứu Tóm lại, chế phẩm probiotic bƣớc đầu nghiên cứu đƣợc tạo thành từ sinh khối chủng có tỉ lệ Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP lần lƣợt 2:1:1 phối trộn chất mang cám ngô với tỉ lệ sinh khối vi sinh vật : chất mang 1:1, sấy 400C thời 24 Chế phẩm đặt tên Pro-NT4 3.5 Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm Kết xác định ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến chế phẩm đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến chế phẩm Mật độ (CFU/g) Lactobacillus Candida plantarum tropicalis LT7 N.CT 30 1.6 x 109 2,52 x 109 2,77 x 109 40 2,7 x 109 3,92 x 109 3,87 x 109 50 6,4 x 107 7,06 x 107 3,3 x 108 Nhiệt độ (0C) Bacillus subtilis B.BP Nhiệt độ sấy ảnh hƣởng đến chất lƣợng chế phẩm, sấy nhiệt độ thấp phải sấy thời gian dài tăng độ ẩm chế phẩm, enzym bị biến tính lâu dần vi sinh vật s chết, nhiệt độ cao s làm tế bào vi sinh vật chết đi, giảm mật độ, hoạt tính vi sinh vật chất mang 34 Kết xác định mật độ bảng 3.6 cho thấy chủng chịu đƣợc nhiệt độ cao Lactobacillus plantarum Candida tropicalis nhóm vi khuẩn ƣa ấm có khả sống đƣợc nhiệt độ 500C nhƣng mật độ khơng cao, Bacillus subtilis có khả sinh bào tử nên lên nhiệt độ cao sống tốt hai chủng lại Quan sát số liệu ta nhận thấy số lƣợng vi sinh vật sống sót 400C cao (Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP: 2,7 x 109 CFU/g; 3,92 x 109 CFU/g; 3,87 x 109 CFU/g) Sấy 300C mật độ đạt > 109 CFU/g nhƣng tốn thời gian, sấy 500C mật độ vi sinh vật giảm cịn 107-108 CFU/g Vì vậy, để tạo chế phẩm đạt hiệu tốt đề tài chọn 400C nhiệt độ sấy chế phẩm 3.6 Bảo quản chế phẩm Chế phẩm probiotic đa chủng đƣợc tạo thành cách phối trộn sinh khối tỉ lệ vi sinh vật Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP với cám ngô Hỗn hợp sau phối trộn đƣợc kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật đạt mật độ Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP: 2,9 x 109 CFU/g; 3,93 x 109 CFU/g; 3,8 x 109 CFU/g Chế phẩm đƣợc đóng gói túi polyetylen tráng thiếc với khối lƣợng 100g/ túi bảo quản nhiệt độ thƣờng nhiệt độ phòng ta thu đƣợc kết bảng 3.7 35 Bảng 3.5 Bảo quản chế phẩm điều kiện khác Mật độ vi sinh vật (CFU/g) Điều kiện bảo quản 4C 25-300C Lactobacillus plantarum LT7 Candida tropicalis N.CT Bacillus subtilis B.BP 2,9 x 109 3,93 x 109 3,8 x 109 9 Thời gian bảo quản 2,43 x 10 3,57 x 10 3,55 x 10 15 ngày 1,85 x 109 2.93 x 109 3.12 x 109 30 ngày 2,9 x 109 3,93 x 109 3,8 x 109 2,65 x 109 3,71 x 109 3,68 x 109 15 ngày 2,2 x 109 3,17 x 109 3,21 x 109 30 ngày Do thời gian có hạn, kiểm tra đƣợc số lƣợng tế bào chủng sau 30 ngày bảo quản Sau 30 ngày mật độ vi sinh vật hai điều kiện bảo quản giảm dần theo thời gian, hai điều kiện mật độ chế phẩm đạt > 109 CFU/g Chế phẩm túi PE mạ thiếc bảo quản nhiệt độ thƣờng đạt mật độ lớn hơn, mật độ vi sinh vật Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP: 2,2 x 109 CFU/g; 3,17 x 109 CFU/g; 3,21 x 109 CFU/g Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Trần Thị Mỹ Trang (2006); Võ Thị Thứ cs (2003); Lê Tân Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng cs Các tác giả cho rằng, số lƣợng tế bào chủng vi sinh vật chế phẩm probiotic đạt 109 CFU/g chế phẩm tốt mang lại hiệu cao [13,15,4] Vì đề tài định chọn bao quản túi polyetylen tráng thiếc bảo quản nhiệt độ thƣờng 25-300C để tiết kiệm chi phí 3.7 Sơ đồ tạo chế phẩm probiotic đa chủng Quy trình tạo chế phẩm probiotic đa chủng bổ sung vào thức ăn chăn ni tóm tắt theo sơ đồ hình 3.5 36 Hình 3.5: Quy trình tạo chế phầm NT4 Chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đƣợc trình bày quy trình đƣợc đóng gói bảo quản túi polyetylen tráng thiếc với khối lƣợng 100g nhiệt độ thƣờng Chế phẩm tạo đƣợc kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật lần lƣợt Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, 37 Bacillus subtilis B.BP: 2,9 x 109 CFU/g; 3,93 x 109 CFU/g; 3,8 x 109 CFU/g đƣợc đặt tên chế phẩm Pro-NT4 Hình 3.6: Chế phẩm Pro-NT4 3.8 Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm Pro-NT4 gà tuần tuổi Mục đích thí nghiệm nghiên cứu tác dụng chế phẩm Pro-NT4 đến khả tăng trọng hệ số tiêu tốn thức ăn gà tuần tuổi (trong giai đoạn từ 28 ngày đến 56 ngày tuổi) So sánh hiệu chế phẩm Pro-NT4 so với đối chứng không sử dụng chế phẩm Sau tuần thí nghiệm chúng tơi thu đƣợc kết trình bày bảng 3.6; 3.7 sau đây: Bảng 3.6 Tăng trọng bình quân gà từ 28 đến 56 ngày tuổi Chỉ tiêu Lô ĐC Lô TN Số gà TN (con) 10 10 Thời gian TN (ngày) 28 28 Trọng lƣợng gà 28 ngày tuổi (kg/con) 0,45 ± 0,05 0,43 ± 0,07 Trọng lƣợng gà 56 ngày tuổi (kg/con) 0,80±0,055 0,90 ± 0,055 Tăng trọng bình quân (kg/con) 0,35 ± 0,08 0,47 ± 0,096 Kết khảo sát cho thấy, trọng lƣợng gà tuần tuổi trung bình lơ bố trí thí nghiệm tƣơng đối đồng Qua 28 ngày thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy tăng trọng trung bình lơ TN (0,47 kg/con) cao so 38 với lô ĐC (0,35 kg/con) Nhƣ là, lô bổ sung chế phẩm Pro-NT4 (lô TN) cho kết tăng trọng cao lô không bổ sung chế phẩm (lô ĐC) Điều đƣợc giải thích chế phẩm vào thể có tác dụng ức chế vi sinh vật có hại đƣờng ruột sản sinh số enzyme ngoại bào tiêu hóa (protease, amylase, cellulase…) nên kích thích khả tiêu hóa nâng cao hiệu sử dụng thức ăn nên gà tăng trọng nhanh Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Trần Thị Thu Thủy (2003) Trần Thị Mỹ Trang (2006) Các tác giả cho rằng, tất lơ có bổ sung chế phẩm probiotic mang lại hiệu tăng trọng nhanh so với lô ĐC (không bổ sung chế phẩm) Bảng 3.7 Hệ số tiêu tốn thức ăn thời gian thí nghiệm Lơ ĐC Lơ TN 10 10 Số kg thức ăn tiêu thụ/lô 22,4 19,6 Tăng trọng bình qn/lơ 0,8 × 10 0,9 × 10 2,75 2,2 Chỉ tiêu Số gà TN (con) Hệ số tiêu thụ thức ăn Qua kết đƣợc trình bày bảng 3.7, nhận thấy: Hệ số tiêu tốn thức ăn trung bình lơ TN có bổ sung chế phẩm Pro-NT4 (2,2) thấp so với lơ ĐC (2,75) Điều có l liên quan đến chất lƣợng enzyme chủng vi sinh vật hữu ích sản sinh ra, kích thích khả tiêu hóa thức ăn, làm gà tăng trọng nhanh Các kết cho thấy bổ sung chế phẩm probiotic vào phần ăn gà con, vi sinh vật có lợi s nhanh chóng phát triển, kết hợp với enzyme sản sinh làm gà hấp thu dƣỡng chất tốt hơn, chuyển hóa thức ăn tốt hơn, gà tăng trọng mau giảm hệ số tiêu tốn thức ăn Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Trần Thị Thu Thủy (2003) Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nguyễn Thị Thu Thảo (2007) 39 Các tác giả cho rằng, tất lơ có bổ sung chế phẩm sinh học có hệ số tiêu tốn thức ăn thấp so với lô ĐC (không bổ sung chế phẩm) Một số nghiên cứu giới cho thấy việc bổ sung probiotic có tác động tích cực đến tăng trƣởng, hiệu suất thức ăn sử dụng, giảm tỷ lệ tử vong Hiệu probiotic phụ thuộc chủ yếu vào thành phần chủng, tƣơng tác nhiều chủng …Sử dụng probiotic đa chủng đƣợc chứng minh tối ƣu tác dụng có lợi probiotics thơng qua việc cải thiện vi khuẩn có lợi đƣờng ruột, kìm hãm tác nhân gây bệnh đƣờng tiêu hóa chim [9,13,14,29,33,34,35] 40 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Xác định đƣợc điều kiện thích hợp để tạo chế phẩm vi sinh vật từ chủng Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP: chất mang cám ngô, tỷ lệ phối trộn chủng Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP lần lƣợt 2:1:1, tỉ lệ phối trộn chất mang vi sinh vật 1:1, nhiệt độ sấy chế phẩm 400C  Tạo đƣợc chế phẩm vi sinh đa chủng từ chủng Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP đƣợc đặt tên Pro- NT4 có mật độ ban đầu LT7, N.CT, B.BP lần lƣợt đạt : 2,9 x 109; 3,93 x 109; 3,8 x 109  Xác định đƣợc điều kiện bảo quản chế phẩm Pro-NT4 thích hợp túi polyetylen tráng thiếc điều kiện thƣờng 25-300C Mật độ vi sinh vật chế phẩm sau 30 ngày đạt kết Lactobacillus plantarum LT7, Candida tropicalis N.CT, Bacillus subtilis B.BP 2,2 x 109 CFU/g; 3,17 x 109 CFU/g; 3,21 x 109 CFU/g  Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm Pro-NT4 dạng bột bổ sung vào thức ăn cho gà tuần tuổi đạt kết khả quan: Tăng trọng lơ gà TN có sử dụng chế phẩm Pro-NT4 (0,47 kg/con) cao lô ĐC không sử dụng chế phẩm (0,36 kg/con), hệ số tiêu tốn thức ăn lô TN sử dụng chế phẩm Pro-NT4 (2,2) thấp lô ĐC không sử dụng chế phẩm (2,75) 4.2 Kiến nghị  Cần có thêm thí nghiệm kiểm tra tính an tồn sản phẩm để bảo đảm tuyệt đối an tồn cho vật ni, thủy sản sử dụng đặc biệt bảo đảm an toàn cho sức khỏe ngƣời sử dụng sản phẩm từ động vật đƣợc ăn thức ăn probiotic 41  Nghiên cứu thí nghiệm xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng vi sinh vật để xác định tốt thời gian hoạt hóa giống, thời gian thu nhận sinh khối, enzym thích hợp  Nghiên cứu thí nghiệm xác định thời gian, vật liệu bảo quản, chọn chất mang thích hợp, phƣơng pháp đông khô chủng vi sinh vật để tạo chế phẩm có mật độ tốt  Thử nghiệm chế phẩm quy mô lớn để đánh giá hiệu sử dụng chế phẩm làm sở cho sản xuất sử dụng chế phẩm phổ biến 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hội Chăn ni Việt Nam, Probiotic - lợi ích triển vọng, Tạp chí chăn ni: tr.5 -9, 2008 Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng, Trƣơng Thị Hồng Vân, Võ Minh Sơn (2003) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, pp 75-79 Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Yoshimi Benno (1999) Tác dụng tăng trƣởng gia cầm chế phẩm vi sinh vật PRO99 Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 1999, pp 139-144 Lê Thị Bích Phƣợng, Võ Thị Hạnh, Trƣơng Thị Hồng Vân, Lê Tấn Hƣng (2003), Khảo sát khả cạnh tranh đối kháng vi sinh vật có chế phẩm BIO II với vi khuẩn gây bệnh cho tơm , Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr 353-357 Lý Nguyễn Bình, Trần Văn Khánh, Hà Phƣơng Thảo Nguyễn Văn Thành (2015), Phân lập tuyển chọn nấm men có hoạt lực cao từ men rƣợu , Tạp ch Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 39 (2015): tr 18-28 Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ, in Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp.HCM, 2008, pp - 11, 17 - 19 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, "Một số phƣơng pháp nghiên cứu vỉ sinh vật học", Tập I, II, III, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1972, 1976, 1978 Nguyễn Thị Quỳnh Trang (2011),"Tuyển chọn chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử l nƣớc thải nuôi trồng thủy sản", Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội, pp 64 – 66 Nguyễn Thị Thu Thảo (2007), Sản xuất thử nghiệm hiệu chế phẩm probiotic phòng tiêu chảy sinh trƣởng heo sau cai sữa 103 (21 đến 58 ngày tuối) , Luận văn tốt nghiệp ngành Bác sĩ Thú y, Trƣờng ĐH Nông lâm Tp HCM 10 Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003) Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH123 CH 126 phân lập từ đƣờng ruột gà Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 101-105 11 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, Công nghệ vi sinh môi trƣờng, NXB Giáo dục, 2009 12 Trần Thị Ái Liên, "Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic" Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, 2011, pp - 9, 39 - 40 13 Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nghiên cứu sử dụng VK lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đƣờng ruột cho heo, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm tp.HCM, tr 58-60, 62-74 14 Trần Thị Thu Thủy (2003), "Khảo sát tác dụng thay Kháng sinh probiotic phòng ngừa tiêu chảy E.coli heo con," in Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Trƣờng ĐH Nông lâm Tp Hồ Chí Minh, 2003, pp 21 - 24 , 28 - 43 15 Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng (2003), Nghiên cứu tạo chế phẩm BOCHE đánh giá tác dụng chế phẩm đến môi trƣờng nƣớc nuôi tôm cá, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr 119-222 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Apajalahti J.H.A, L.K Sarkilabti, B.R.E Maki, J.P Heikkinen, P.H Nurminen and W.E Holben (1998) Effective recovery of bacteria DNA and percent- guanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens Appl Environ Microbiol, 64, pp 4084 - 4088 17 Arthur, C., Ouwehand and Salminen, S (2003) In vitro Adhesion Assays for Probiotics and their in vivo Relevance: A Review Microbial Ecology in Health and Disease 2003; 15: 175-184 18 Bruinsma, J 2003 Livestock Production In: J Bruinsma (ed.) World agriculture: towards 2015/2030 An FAO perspective Earthscan Publications Ltd, London 19 Collado MC, Gueimonde M, Hernández M, Sanz Y, Salminen S: Adhesion of selected Bifidobacterium strains to human intestinal mucus and the role of adhesion in enteropathogen exclusion J Food Prot 2005;68:2672–2678 20 Department of Biochemistry and Molecular Biology II, Institute of Nutrition and Food Technology ‘José Mataix’, Biomedical Research Center, University of Granada, Armilla, Spain, 2012 21 FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics, Food London, Ontario, Canada: April 30 and May 1, 2002, 2002.20 22 Fontaine N., Meslin J.C., Lory V and Andrieux C (1996) Intestinal mucin distribution in the germ-free and in the heteroxenic rather boring a human bacterial flora: Effect of inulin in the diet , Br J Nutr, 75, pp 881–892 23 Fuller R., Probiotics in man and animals, J Appl Bacteriol: 66, pp 65–78, 1989 24 Gueimonde, M., Sánchez, B., G de Los Reyes-Gavilán, C., Margolles, A (2013) Antibiotic resistance in probiotic bacteria Front Microbiol 18(4): 202 doi: 10.3389/fmicb.2013.00202 eCollection 2013 25 Haller D, Colbus H, Ganzle MG, Scherenbacher P, Bode C, Hammes WP: Metabolic and functional properties of lactic acid bacteria in the gastro-intestinal ecosystem: a comparative in vitro study between bacteria of intestinal and fermented food origin Syst Appl Microbiol 2001;24:218–226 26 M Garriga, M Pascual, J.M Monfort and M Hugas (1998), Selection of lactobacillus for chicken probiotic adjunts, J of Appl, Microbilol, vol 84, p 125 – 132 27 Mack DR, Ahrne S, Hyde L, Wei S, Hollingsworth MA: Extracellular MUC3 mucin secretion follows adherence of Lactobacillus strains to intestinal epithelial cells in vitro Gut 2003;52:827–833 28 Patel SG, Raval AP, Bhagwat SR, Sadrasaniya DA, Patel AP, Joshi SS (2015) Effects of probiotics supplementation on growth performance, feed conversion ratio and economics of broilers J Anim Res 5:155–16 29 Rolfe.R.D.(2000).The role of probiotic cultures in the control of gastro- intestinal health J Nutr, 130, pp 396S–402S 30 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K., Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam, Int J Syst Evol Microbiol: 59, pp 550-554, 2009 31 Schat.K.A and Myers T J (1991) Avian Intestinal Immunity Crit Rev Poult Biol, 3, pp 19–34 32 Servin, A.L (2004) Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens FEMS Microbiol Rev 28,405-440 33 Silva VK, Silva JDTD, Gravena RA, Marques RH, Hada FH, Moraes VMBD (2010) Yeast extract and prebiotic in pre-initial phase diet for broiler chickens raised under different temperatures Rev Bras Zootec 39:165–174 34 Song J, Xiao K, Ke Y, Jiao LF, Hu CH, Diao QY, Shi B, Zhou XT (2014) Effect of a probiotic mixture on intestinal microflora, morphology, and barrier interity of broilers subjected to heat stress Poult Sci 93:581–588 35 Zhu S.Y., Zhong T., Pandya Y and Joerger R D (2002) 6S rRNAbased analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens Appl Microbiol, 68, pp 124–137 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng P1: Trọng lượng gà từ 28 đến 56 ngày tuổi Trọng Lô ĐC (kg) Lô TN (kg) lƣợng gà 10 28 ngày tuổi 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,5 0,4 0,5 0,4 0,4 56 ngày tuổi 0,8 0,7 0,9 0,7 0,9 0,9 0,7 0,8 0,8 0,8 0,3 0,4 0,5 0,3 0,8 0,8 0,8 10 0,4 0,4 0,5 0,5 0,9 0,9 0,9 0,9 Thời gian thí nghiệm 0,5 0,5 1