Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại bào từ đất trồng rau cải ở chương mỹ hà nội

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS SUBTILIS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ ĐẤT TRỒNG RAU CẢI Ở CHƢƠNG MỸ - HÀ NỘI NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Minh Hằng Sinh viên thực : Nguyễn Phượng Chiến Mã sinh viên : 1453070468 Lớp : 59B - CNSH Khóa học : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận tốt nghiệp, cá nhân nhận đƣợc nhiều động viên, khích lệ với hƣớng dẫn nhiệt tình chu đáo thầy, giáo Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh Hóa sinh, thuộc Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Nhân dịp ngày xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thạc sỹ Nguyễn Thị Minh Hằng - Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tận tình bảo, hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Tôi chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành báo cáo cách tốt Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè luôn giúp đỡ, động viên suốt trình thực Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Phƣợng Chiến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC D NH MỤC C C HIỆU, C C CH VI T TẮT D NH MỤC HÌNH D NH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QU N 1.1 Sơ lƣợc vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 1.1.5 Đặc điểm sinh hoá 1.1.6 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.7.Tính chất đối kháng 1.1.8 Giới thiệu amylase protease CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 15 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2 Đối tƣợng vật liệu 15 2.2.1 Đối tƣợng 15 2.2.2 Vật liệu 15 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1.Phƣơng pháp lấy mẫu 17 2.3.2 Phƣơng pháp phân lập 17 2.3.3 Một số phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 18 2.3.4 Nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 19 2.3.5 Xác định số đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 19 CHƢƠNG 3: 3.1 T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 ết phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất trồng rau cải 22 3.1.1 ết phân lập quan sát khuẩn lạc 22 3.1.2 ết nhuộm gram chủng phân lập đƣợc 23 3.2 ết xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng phân lập đƣợc 24 3.2.1 ết khả sinh enzyme protease chủng phân lập đƣợc 24 3.2.2 ết khả sinh enzyme amylase chủng phân lập đƣợc 25 3.3 ết xác định số đặc điểm sinh hóa chủng phân lập đƣợc 26 3.3.1 ết xác định hoạt tính catalase 26 3.3.2 Phản ứng M.R (Methyl đỏ - Methyl Red) 27 3.3.3 Phản ứng V.P (Voges-Proskauer) 28 3.3.4 Phản ứng thử urea 29 3.3.5 Kết phản ứng khử nitrate 30 T LUẬN VÀ I N NGHỊ 32 TÀI LIỆU TH M HẢO NH MỤC C C HIỆU C C CH VI T TẮT CFU Colony Forming Unit LB LURIA- BERTANI DC Đối chứng DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Nhuộn Gram chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 23 Hình 3.2 ết khả sinh enzyme protease chủng phân lập đƣợc 25 Hình 3.3 ết khả sinh enzyme amylase chủng phân lập đƣợc 26 Hình 3.4 Xác định hoạt tính catalase 27 Hình 3.5 Phản ứng M.R (Đỏ Methyl - Methyl Red) 28 Hình 3.6 ết phản ứng V.P (Voges-Proskauer) 29 Hình 3.7 Phản ứng thử urea 30 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Kết phản ứng sinh hóa Bacillus sutillis Bảng 3.1 Đặc điểm hình dạng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 22 Bảng 3.2 Kết khả sinh enzyme protease 24 Bảng 3.3 Kết khả sinh enzyme amylase 25 Bảng 3.5 Kết phản ứng M.R (Methyl đỏ - Methyl Red) 27 Bảng 3.6 ết phản ứng V.P (Voges-Proskauer) 29 Bảng 3.7 ết phản ứng thử urea 30 Bảng 3.8 Kết phản ứng khử nitrate 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, sống ngƣời đƣợc nâng cao cải thiện rõ ràng, suy nghĩ việc sử dụng sản phẩm sinh học ngày trở nên phổ biến Chính vậy, sản phẩm ứng dụng cơng nghệ sinh học ngày đƣợc ƣa chuộng sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực đời sống nhƣ: Y học, dƣợc phẩm, xử lý môi trƣờng… Các chế phẩm sinh học dần tìm đƣợc chỗ đứng vững thị trƣờng nhờ vào lợi ích to lớn mà đem lại: Dễ sử dụng, giá thành rẻ, không độc hại đến ngƣời môi trƣờng xung quanh Trong số đó, chế phẩm sinh học mang chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có lợi đƣợc sử dung rộng rãi, kể đến nhƣ: Chế phẩm xử lý môi trƣờng ao nuôi, môi trƣờng, men vi sinh…Bacillus subtilis loại vi khuẩn hiệu an toàn sử dụng ngành cơng nghệ sinh học Bacillus subtilis có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe nhƣ kích thích hệ miễn dịch, đơng máu, phịng nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu ngƣời cao tuổi Bacillus subtilis sản sinh enzyme tiêu hóa: mylase, Protease, Cellulose … giúp cải thiện tiêu hóa tăng cƣờng hấp thụ chất dinh dƣỡng Việc bổ sung lợi khuẩn Bacillus subtilis loại men vi sinh giúp tạo hệ vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm chất dinh dƣỡng giúp hệ miễn dịch khỏe mạnh Có khả đồng hóa vài vitamin nhƣ B2 (Riboflavin) có trị quan trọng hoạt động sống thể động thực vật, có mặt tế bào, tham gia vào trình dinh dƣỡng nhƣ hô hấp sinh vật Từ thực tế trên, dƣới hƣớng dẫn Th.S Nguyễn Thị Minh Hằng, tiến hành thực đề tài: “Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus subtilis có khả sinh enzyme ngoại bào từ đất trồng rau cải Chương Mỹ - Hà Nội ” CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lƣợc vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis đƣợc phát phân ngựa năm 1941 tổ chức y học Nazi Đức Lúc đầu đƣợc sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lỵ cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến năm 1949 - 1957, Henrry cộng tách đƣợc chủng khiết Bacillus subtilis Từ “subtilis therapy” có nghĩa "thuốc subtilis" đời trị chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn trở nên phổ biến, đƣợc sử dụng rộng rãi y học, chăn ni, thực phẩm (trích Lý im Hữu, 2005) 1.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis Đặc điểm phân loại: Theo phân loại Bergy (1994) Bacillus subtilis Thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Lồi: Bacillus subtilis Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus Subtillis http://www.vids.vn/bacillus-subtilis Nguyên tắc: Urea diamid acid carbonic dễ bị thủy phân enzyme urease tạo thành NH3 H2O theo phản ứng: (NH2)2CO + H2O → 2NH3 + CO2 NH3 sinh phản ứng với muối ammonium carbonat có mơi trƣờng làm kiềm hóa mơi trƣờng, tăng pH làm cho phenol (có sẵn môi trƣờng) chuyển sang màu hồng Phƣơng pháp thực hiện: Cấy vi khuẩn chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trƣờng Để 35 - 37°C, đọc kết sau 18 – 24 Phản ứng dƣơng tính mơi trƣờng chuyển sang màu hồng cánh sen Phản ứng âm tính mơi trƣờng khơng đổi màu 2.3.5.5 Khử nitrat Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả khử nitrat (NO3-) dƣới tác dụng enzyme nitratase tạo thành nitrit (NO2-), NH3, N2, NH2OH, NO, N2O Sự xuất nitrit môi trƣờng đƣợc phát dƣới tác dụng acid sulphailamine N – naphthylenediamin hydrochloride tạo thành muối diazo có màu hồng đỏ Phƣơng pháp thực hiện: Lấy vi khuẩn cấy môi trƣờng nitrat, để 35 - 37°C 18 – 24 Nhỏ acid sulfanilic, acid acetic alpha naphthylelediamine Quan sát kết 30 giây Phản ứng dƣơng tính khí ống nghiệm xuất vịng màu đỏ Điều có nghĩa nitrat đƣợc khử thành nitrit Nếu ống nghiệm không xuất màu hồng đỏ có trƣờng hợp xảy ra: Hoặc trƣờng hợp âm tính thật: Vi khuẩn khơng có khả phân hủy nitrat Hoặc trƣờng hợp âm tính giả: Nitrat bị khử thành sản phẩm khác ( nitơ, NH3…) Trong trƣờng hợp ta phải cho thêm lƣợng nhỏ bột kẽm để định tính nitrat 21 CHƢƠNG 3: 3.1 T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ết phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất trồng rau cải 3.1.1 Kết phân lập quan sát khuẩn lạc Sau pha lỗng cấy trải mơi trƣờng LB, từ mẫu đất trồng cải là: Cải Cải 2, phân lập làm đƣợc chủng Các chủng đƣợc kí hiệu lần lƣợt là: B1, B2, B3, B4, B5, B6 Hình dạng đặc điểm chủng đƣợc mô tả qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm hình dạng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Mẫu đất Tên chủng Đặc điểm Màu trắng, bề mặt B1 trơn, rìa ngồi hình cƣa Màu trắng ngà, bề Cải B2 mặt có nếp nhăn, rìa ngồi hình cƣa Màu trắng, bề mặt B3 trơn, rìa ngồi trịn Màu vàng, bề mặt Cải B4 trơn, rìa ngồi trịn 22 Hình ảnh Màu trắng, bề mặt B5 trơn, rìa ngồi trịn Màu trắng ngà, bề B6 mặt trơn, có gợn thành vịng trịn, rìa ngồi trịn 3.1.2 Kết nhuộm gram chủng phân lập Sau 20 nuôi cấy, tiến hành nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần: Hình 3.1 Nhuộn Gram chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng tế bào phƣơng pháp nhuộm Gram qua hình 3.1 cho thấy: 23 Các chủng B1, B2 bắt màu tím, dạng hình que, đứng đơn lẻ Các chủng B3, B4 bắt màu đỏ, dạng hình cầu, đứng đơn lẻ Các chủng B5, B6 bắt màu tím, dạng hình que hình thành chuỗi ngắn Nhƣ vậy, chủng B1, B2, B5, B6 nghi ngờ vi khuẩn Bacillus subtilis Qua đó, chủng chủng đƣợc chọn để tiếp tục nghiên cứu 3.2 Kết xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng phân lập đƣợc 3.2.1 Kết khả sinh enzyme protease chủng phân lập Sau thực phƣơng pháp đục lỗ thạch nhuộm Comasin, thu đƣợc kết sau: Bảng 3.2 Kết khả sinh enzyme protease Chủng vi khuẩn Hoạt tính enzyme protease (D-d, mm) B1 19± 0,03 B2 18±0,02 B5 19± 0,01 B6 17±0,04 DC 24 Hình 3.2 ết khả sinh enzyme protease chủng phân lập đƣợc Từ kết thu đƣợc trình bày bảng 3.2 hình 3.2 cho thấy khả sinh enzyme protease chủng phân lập đƣợc ổn định Trong đó, chủng B1, B5 hai chủng có khả sinh enzyme protease lớn (19 mm) chủng B6 chủng có khả sinh enzyme protease chủng (17 mm) So sánh với chủng khác nhận thấy chủng phân lập đƣợc có khả sinh enzyme protease mức 3.2.2 Kết khả sinh enzyme amylase chủng phân lập Sau thực phƣơng pháp đục lỗ thạch nhuộm lugol 5%, thu đƣợc kết sau: Bảng 3.3 Kết khả sinh enzyme amylase Chủng vi khuẩn B1 B2 B5 B6 Chú thích: Hoạt tính enzyme ngoại bào (D-d, mm) 11± 0,02 8±0,03 10±0,03 - ( - ) : Khơng sinh enzyme 25 Hình 3.3 ết khả sinh enzyme amylase chủng phân lập đƣợc Từ kết thu đƣợc trình bày qua bảng 3.3 hình 3.3 cho thấy có chủng B1, B2, B5 chủng có khả sinh enzyme amylase Trong đó, chủng B1 chủng có khả sinh enzyme amylase lớn (11 mm) Chủng B2 chủng có vịng phân giải nhỏ (8 mm) Chủng B6 chủng khơng có khả sinh emzyme amylase So sánh với chủng khác thấy chủng phân lập đƣợc có khả sinh enzyme amylase mức trung bình 3.3 Kết xác định số đặc điểm sinh hóa chủng phân lập đƣợc 3.3.1 Kết xác định hoạt tính catalase Sau lấy lƣợng nhỏ dịch lỏng nuôi cấy chủng vi khuẩn Tiến hành thử hoạt tính chủng với H2O2, quan sát thấy: Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính Catalase Tên chủng B1 B2 B5 B6 DC Chú thích: Kết thử hoạt tính Catalase + + + + - (+): Phản ứng dƣơng tính (-) : Phản ứng âm tính 26 Hình 3.4 Xác định hoạt tính catalase Từ kết đƣợc trình bày bảng 3.4 hình 3.4 cho thấy chủng B1, B2, B5, B6 có tƣợng sủi bọt khí sau nhỏ H2O2 Nhƣ vậy, chủng B1, B2, B5, B6 có khả sinh enzyme catalase, enzyme catalase thủy phân hydrogen peroxide thành H2O O2 Điều chứng tỏ chủng vi sinh vật hiếu khí 3.3.2 Phản ứng M.R (Methyl đỏ - Methyl Red) Sau cấy vi khuẩn vào môi trƣờng (lặp lại lần), đặt nhiệt độ thích hợp 2-6 ngày Ta tiến hành nhỏ 2-3 giọt dung dịch Methyl đỏ 0,5% (trong cồn 60%), lắc nhẹ thu đƣợc kết bảng 3.5 hình 3.5 Bảng 3.5 Kết phản ứng M.R (Methyl đỏ - Methyl Red) Kết phản ứng M R + + + + - Tên chủng B1 B2 B5 B6 DC Chú thích: (+): Phản ứng dƣơng tính (-) : Phản ứng âm tính 27 Hình 3.5 Phản ứng M.R (Đỏ Methyl - Methyl Red) Từ kết qủa đƣợc trình bày bảng 3.5 hình 3.5 cho thấy sau nhỏ 2-3 giọt dung dịch Methyl đỏ 0,5%, dịch thể nuôi cấy vi khuẩn chuyển từ màu vàng(pH=7,5) sang màu đỏ(pH=4,4) Điều cho thấy chủng vi khuẩn có khả tạo trì acid đƣợc tạo từ q trình lên men glucose, pH mơi trƣờng giảm từ 7,5 xuống 4,4 Nhƣ chủng B1, B2, B5, B6 có phản ứng dƣơng tính 3.3.3 Phản ứng V.P (Voges-Proskauer) Sau cấy vi khuẩn vào mơi trƣờng, đặt nhiệt độ thích hợp 2-6 ngày Ta tiến hành nhỏ giọt dung dịch alpha naphtol 6% (trong cồn 90%, giữ độ C trƣớc dùng) giọt NaOH 16% (trong nƣớc), lắc nhẹ thu đƣợc kết bảng 3.6 hình 3.6 28 Bảng 3.6 ết phản ứng V.P (Voges-Proskauer) Tên chủng Kết phản ứng V.P B1 B2 B5 B6 + + + + DC - Chú thích: (+): Phản ứng dƣơng tính (-): Phản ứng âm tính Hình 3.6 ết phản ứng V.P (Voges-Proskauer) Từ kết đƣợc trình bày bảng 3.6 hình 3.6 cho thấy sau nhỏ giọt dung dịch alpha naphtol 6% giọt NaOH 16% , lắc nhẹ, dịch thể nuôi cấy vi khuẩn chuyển từ màu vàng sang màu đỏ nâu Nhƣ vậy, chủng vi khuẩn phân lập đƣợc cho kết phản ứng dƣơng tính 3.3.4 Phản ứng thử urea Sau cấy vi khuẩn chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trƣờng Để 35 - 37°C, sau 18 – 24 thu đƣợc kết sau: 29 Bảng 3.7 ết phản ứng thử urea Tên chủng Kết B1 + B2 + B5 + B6 + DC - Chú thích: (+): Phản ứng dƣơng tính (-): Phản ứng âm tính Hình 3.7 Phản ứng thử urea Từ kết thu đƣợc bảng 3.7 hình 3.7 cho thấy sau cấy vi khuẩn vào môi trƣờng nuôi 35 - 37°C, sau 18 – 24 Dịch thể nuôi cấy vi sinh vật chuyển từ màu vàng sang màu hồng cánh sen Nhƣ vậy, thấy xuất khả phân cắt urea thành Ammonia hoạt tính Urease từ vi sinh vật kết mơi trƣờng bị kiềm hóa NH3 đƣợc tạo Chính vậy, mơi trƣờng chuyển sang màu hồng cánh sen 3.3.5 Kết phản ứng khử nitrate Lấy vi khuẩn cấy môi trƣờng nitrat, để 35 - 37°C 18 – 24 Nhỏ Acid sulfanilic, Acid acetic Alpha naphthylelediamine Quan sát kết 30s: 30 Bảng 3.8 Kết phản ứng khử nitrate Kết phản ứng khử Tên chủng nitrate B1 + B2 + B5 + B6 + DC - Chú thích: (+): Phản ứng dƣơng tính (-): Phản ứng âm tính Từ kết thu đƣợc trình bày bảng 3.8 cho thấy sau nhỏ Acid sulfanilic, acid acetic vào Acid sulfanilic trở thành dạng sulfanilic acid bị diazo hóa Sau đó, nhỏ tiếp alpha naphthylelediamine tạo pSulfobenzene-azo- alpha naphthylelediamine có màu đỏ Nhƣng Sulfanilic acid bị diazo hóa bị gãy thành dẫn xuất Hydroxyl-azo Nitrate bị khử thành N2, tƣợng khơng có màu xảy Do kiểm tra phản ứng cách bổ sung bột kẽm vào Quan sát kết 30s, ta thấy ống nghiệm không cho màu hồng đỏ Điều cho thấy Nitrate bị Zn khử thành Nitrite, dịch thể đƣợc cấy vi sinh vật không đổi màu Nhƣ vậy, chủng vi khuẩn đem thử cho kết phản ứng dƣơng tính 31 T LUẬN VÀ I N NGHỊ ết luận Từ mẫu đất trồng rau cải Mỹ Lƣơng, Chƣơng Mỹ, Hà Nội, phân lập đƣợc chủng vi khuẩn B1, B2, B3, B4, B5, B6 Có chủng B1, B2, B5, có khả sinh enzyme amylase Trong chủng B1 chủng có khả sinh enzyme amylase lớn (11mm) Chủng B2 chủng có vịng phân giải nhỏ (8mm) Chủng B6 chủng khơng có khả sinh emzyme amylase Có chủng B1, B2, B5, B6 có khả sinh enzyme protease Trong đó, chủng B1, B5 hai chủng có khả sinh enzyme protease lớn (19 mm) chủng B6 chủng có khả sinh enzyme protease chủng (17mm) Qua phản ứng sinh hóa tuyển chọn đƣợc chủng B1, B2, B5, B6 có khả chủng Bacillus subtilis iến nghị Do thời gian tiến hành khóa luận tốt nghiệp cịn hạn chế nên chƣa thực đƣợc số nội dung nghiên cứu chuyên sâu chủng Bacillus subtillis Nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu thời gian cho phép, thực công việc nghiên cứu nhƣ: Thực phản ứng sinh hóa cịn chƣa thực đƣợc Định danh đến tên loài cho chủng Bacillus subtillis phân lập tuyển chọn đƣợc kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ pH NaCl đến khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn Bacillus subtillis phân lập tuyển chọn đƣợc Thử nghiệm khả kháng khuẩn chủng Bacillus subtillis phân lập tuyển chọn đƣợc 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Vƣơng Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM 74 trang Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu mơi trường ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm LVTN, hoa Chăn nuôi thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Đức Duy Anh, 2005 Phân lập khảo sát số đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis LVTN, Khoa Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, 2001 Giáo trình thực tập vi sinh Tủ sách trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic LVTN, khoa Chăn nuôi thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Vũ Thị Thứ, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới 33 Tô Minh Châu, 2000 Giáo trình thực tập vi sinh vật học Tủ sách trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát khả sử dụng chủng phân lập xử lý nhiễm aflatoxin nguyên liệu bắp LVTN, hoa Chăn nuôi thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Duy Khánh, 2006 Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis LVTN, khoa Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM 10 Lê Đỗ Mai Phƣơng, 2004 Phân lập giám định vi khuẩn Bacillus subtilis tự nhiên, bước đầu khảo sát khả sinh enzyme amylase enzyme protease LVTN, trƣờng Đại học Mở Bán Công TP.HCM 11 Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1976 Vi sinh vật gây bệnh thú y tập 1, 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội 12 Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III Nhà xuất khoa học kỹ thuật 13 Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lƣợng, 2004 Cơng nghệ sản xuất mì sản phẩm lên men cổ truyền Nhà xuất khoa học kỹ thuật 14 Lã Văn ính, 1998 Những tiến khoa học kỹ thuật công nghệ sản xuất thức ăn gia súc vai trò probiotic động vật Viện Khoa học Nông Nghiệp Kỹ Thuật Miền Nam 34 15 Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1977 Vi sinh vật thú y tập I Nhà xuất đại học trung học chuyên nghiệp Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 16 Trần Linh Thƣớc, 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm Nhà xuất giáo dục 17 Lƣơng Đức Phẩm, 1998 Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội 18 Nguyễn Văn Đơng, 1993 Khảo sát số tính chất vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng trị bệnh tiêu chảy heo LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM Tài liệu internet http://www.vids.vn/bacillus-subtilis 35