Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng để phòng trừ bệnh hại cây trồng

LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giáo viên hƣớng dẫn tiến hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả đối kháng để phòng trừ bệnh hại trồng’’ Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc tích cực đến đề tài hồn thành Để có đƣợc kết trƣớc hết chúng tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng thuộc mơn Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh – Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam ngƣời tận tình hƣớng dẫn suốt q trình chúng tơi thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ban lãnh đạo cán nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Mặc dù cố gắng để hoàn thành đề tài song hạn chế mặt thời gian, kinh nghiệm thân điều kiện nghiên cứu nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót tồn định Tơi kính mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Phạm Thị Ngọc i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi sinh vật đối kháng 1.1.1 Vai trò vi sinh vật đối kháng 1.1.2 Cơ chế tác động vi sinh vật đối kháng đến vi sinh vật gây bệnh 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển vi sinh vật 1.1.4 Các vi sinh vật đối kháng đƣợc ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây hại 1.2 Vi sinh vật gây bệnh trồng thƣờng gặp 12 1.2.1 Nấm Fusarium 12 1.2.2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae 13 1.2.3 Vi khuẩn Ewinia 15 1.3.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng 16 1.3.1 Trên giới 16 1.3.2 Việt Nam 17 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.4 Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 21 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.5.1 Thu thập chuẩn bị mẫu 22 2.5.2 Phƣơng pháp pha loãng mẫu 22 2.5.3 Phƣơng pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật khiết 22 ii 2.5.4 Phƣơng pháp bảo quản giống 23 2.5.5 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 24 2.5.6 Xác định đặc điểm hình dạng tế bào chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn 25 2.5.7 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 26 2.5.8 Xác định hoạt tính catalase 29 2.5.9 Phƣơng pháp xử lí phân tích số liệu 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng 30 3.2 Xác định hình dạng tế bào chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn 35 3.3 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn 35 3.4 Xác định hoạt tính catalase 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích BVTV Bảo vệ thực vật CMC Carboxymethyl Cellulose ĐC Đối chứng DNS Dinitrosalicylic Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) IPM Integrated Pest Management (Quản lý dịch hại tổng hợp) ISR Induced systemic resistance (Hiện tƣợng kích kháng hệ thống) LB Luria – Bertani PGA Potato - Glucose Agar PGPB Plant growth promoting bacteria (Vi khuẩn kích thích sinh trƣởng thực vật) SAR Sytemic acquired resistance (Kích kháng hệ thống có điều kiện) VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật VSVĐK Vi sinh vật đối kháng iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu đất 19 Bảng 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 21 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật 30 Bảng 3.2 Kết xác định hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với chủng vi sinh vật kiểm định 32 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái tế bào chủng tuyển chọn 35 Bảng 3.4 Kết xác định khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào chủng B1, B5, B6 36 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình dạng tế bào vi sinh vật gây bệnh 20 Hình 3.1 Khả đối kháng với vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập đƣợc 33 Hình 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn 36 Hình 3.3 Xác định hoạt tính catalase 37 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Nằm vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp, dựa vào ƣu đó, Việt Nam bƣớc trở thành số nƣớc sản xuất xuất lƣơng thực lớn giới Tuy nhiên, song song với thuận lợi cho trồng bệnh hại phát triển Hằng năm, loại nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh thực vật nhƣ đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng, héo xanh,… chiếm đến 83% số bệnh trồng, làm thiệt hại trăm tỉ đồng Bệnh hại vi sinh vật (VSV) vấn đề mà ngƣời nông dân cịn gặp nhiều khó khăn việc quản lí phịng trừ Để khắc phục thiệt hại đó, ngƣời ta sử dụng nhiều biện pháp kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học… thuốc hóa học đƣợc sử dụng phổ biến thuận tiện hiệu Theo Sarazy, Kenmor (2008 - 2011), nƣớc châu Á trồng nhiều lúa, 10 năm qua (2000 - 2010) sử dụng phân bón tăng 100%, sử dụng thuốc BVTV tăng 200 - 300% Thuốc BVTV đƣợc bắt đầu đƣợc sử dụng miền Bắc Việt Nam vào năm 1955 từ đến tỏ phƣơng tiện định nhanh chóng dập tắt dịch sâu bệnh diện rộng Mặt khác, việc sử dụng thuốc hóa học, thuốc bảo vệ thực vật lâu dài không kiểm soát để lại hậu đáng tiếc môi trƣờng đất, nƣớc… gây ô nhiễm nghiêm trọng, làm cân sinh thái, ảnh hƣởng không nhỏ tới sức khỏe ngƣời vật nuôi lƣợng thuốc tồn dƣ để lại Theo thống kê nƣớc tồn đọng 706 thuốc cần tiêu hủy 19.600 rác bao bì thuốc bảo vệ thực vật chƣa đƣợc thu gom xử lý, hàng năm phát sinh khoảng 9.000 Vì vậy, Hội nghị tƣ vấn khu vực châu Á Thái Bình dƣơng FAO năm 1992 khẳng định đấu tranh sinh học tảng chƣơng trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế phát triển quần thể ký sinh Một hƣớng nghiên cứu theo xu hƣớng sử dụng vi sinh vật có khả đối kháng để ức chế vi sinh vật gây bệnh Huớng ph ng trừ bẹnh sinh học đuợc nhiều nhà khoa học tren giới nghien cứu cho chế phẩm sinh học có nhiều triển vọng Đay mọt phuong pháp ph ng chống có hiẹu khả quan Tìm chủng vi sinh vạt có khả nang kháng nấm bẹnh gi p cay trồng phát triển tốt hon, làm cho tác nhan gay bẹnh khong kháng thuốc, an toàn với moi truờng sinh thái, phù hợp với xu huớng an toàn nong nghiẹp hiẹn biẹn pháp phổ biến cong tác ph ng trừ sinh học Co chế đối kháng với vi sinh vạt gay bẹnh chủng vi sinh vạt tiết chất kháng sinh, cạnh tranh dinh du ng hoạc cong trực tiếp len to nấm gay bẹnh, hay tiết chất kích thích sinh truởng gi p cho cay trồng tang khả nang kháng bẹnh Do đó, việc phân lập tuyển chọn thƣờng xuyên chủng vi sinh vật đối kháng có tính độc cao cần thiết Chúng đối tƣợng cho việc tuyển chọn chủng VSV vừa có khả đối kháng cao vừa cạnh tranh tốt với VSV gây bệnh trồng để sản xuất chế phẩm sinh học, góp phần nâng cao suất, chất lƣợng nông sản, giảm thiệt hại kinh tế nhƣ bảo vệ môi trƣờng, cân hệ sinh thái Từ lý trên, tiến hành đề tài: “Phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả đối kháng để phòng trừ bệnh hại trồng” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi sinh vật đối kháng Trong tự nhiên nhiều lồi vi sinh vật có khả ức chế sinh trƣởng phát triển loài vi sinh vật khác ch ng thƣờng đƣợc gọi vi sinh vật đối kháng Việc sử dụng tƣợng đối kháng công tác bảo vệ thực vật đƣợc gọi biện pháp phòng trừ sinh học Biện pháp đƣợc cho phƣơng pháp quản lý bệnh trồng trực tiếp, cách sử dụng thành phần hệ sinh thái để giúp trồng chống lại tác nhân gây bệnh, chìa khóa để tạo nơng nghiệp bền vững [3, 9, 13] 1.1.1 Vai trò vi sinh vật đối kháng Các lồi vi khuẩn đối kháng ln tồn tự nhiên, đa số ch ng có lợi cho ngƣời Đối với nơng nghiệp vi khuẩn đối kháng thuộc hệ vi sinh vật sống vùng rễ trồng sống hoại sinh đất Trong trình sinh trƣởng chúng tiết chất trao đổi thứ cấp nhƣ: kháng sinh, enzyme, siderophore, chất điều h a sinh trƣởng, acid v.v Những chất có lợi cho phát triển trồng nhƣ: kháng bệnh, tăng khả hấp thu dinh dƣ ng trồng, kích thích sinh trƣởng cây, h a tan dinh dƣ ng đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu để trồng hấp thụ đƣợc v.v [3, 9, 13] 1.1.2 Cơ chế tác động vi sinh vật đối kháng đến vi sinh vật gây bệnh VSV đối kháng có khả cạnh tranh trực tiếp với vi sinh vật khác hệ sinh thái dinh dƣ ng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh, tạo siderophore vv… để sinh trƣởng  Cơ chế tiết kháng sinh ức chế VSV gây bệnh Chất kháng sinh (Antibiotic) chất có tính chống lại VSV hại, ch ng có hoạt tính sinh lý cao có tác động chọn lọc đƣợc VSV tiết đƣa vào môi trƣờng sống mối quan hệ đối kháng với sinh vật khác, vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn VSV sinh nhiều chất kháng sinh (Lƣơng Đức Phẩm, 2011) CKS có tác dụng ức chế sinh trƣởng tiêu diệt số VSV khác cách có chọn lọc nồng độ thấp, can thiệp vào hoạt động sinh lý chất khác cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kềm hãm ức chế phát triển VSV khác Nhiều chủng vi sinh vật có khả tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu tr c hóa học có tác dụng tƣơng tự Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào chế điều khiển đa gen, gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, c n có gen chịu trách nhiệm tổng hợp tiền chất, enzyme cofactor [9, 18]  Cơ chế siderophore Siderophore loại protein sinh trình sinh trƣởng VSV, có khả hấp thụ ion Fe3+ môi trƣờng với lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sinh trƣởng hô hấp VSV, làm cho môi trƣờng xung quanh nghèo sắt, dẫn đến lồi VSV khác khơng có đủ sắt cho q trình sinh trƣởng mình, ch ng không sinh trƣởng đƣợc [9, 18]  Cơ chế tăng cường sức đề kháng (kích kháng) Tác dụng VSV kích thích sinh trƣởng thực vật: vi khuẩn (VK) kích thích sinh trƣởng thực vật (Plant growth - promoting bacteria – PGPB) VSV vùng rễ tƣơng tác với rễ tạo tính kháng chống lại VK, nấm virus gây bệnh Hiện tƣợng đƣợc gọi tính kích kháng hệ thống – ISR (Induced Systemic Resistance), giống nhƣ tính kích kháng có hệ thống có điều kiện – SAR (Systemic Acquired Resistance) (Ryu, C M cs, 2004) PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) VK sống xung quanh vùng rễ cây, dễ hình thành khuẩn lạc, nhân lên với số lƣợng lớn ảnh hƣởng trực tiếp gián tiếp gi p ngăn cản tác nhân gây bệnh thực vật, có khả ức chế tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh chất dinh cấu trúc xoắn đặc biệt, có xuất iod tạo phức màu xanh tím đặc trƣng Tiến hành: Thêm 1ml tinh bột 1% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch vi khuẩn tăng sinh 1ml NaCl 0,1%; lắc đều; ủ 30oC 30 phút Nhỏ vài giọt dung dịch Lugol vào đọc kết quả: - Nếu chủng VSV có hoạt tính amylase amylase phân giải tinh bột khơng xuất màu hỗn hợp tinh bột với iod - Chủng VSV khơng có hoạt tính enzyme xuất màu hỗn hợp tinh bột iod màu xanh tím đặc trƣng 2.5.7.1.2 Xác định khả sinh tổng hợp cellulase Nguyên tắc: Phƣơng pháp dựa sở phản ứng tạo màu đƣờng khử thuốc thử Dinitrosalicylic acid (DNS) 3,5 - dinitrosalicylic acid có màu vàng môi trƣờng kiềm bị khử thành – amino - 5- nitrosalicylic có màu đỏ cam Cƣờng độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử phạm vi định Tiến hành: - Nuôi lắc vi khuẩn môi trƣờng King B lỏng xạ khuẩn môi trƣờng Gause I lỏng thay nguồn pepton glycerol môi trƣờng King B nguồn tinh bột môi trƣờng Gause I 1% CMC làm nguồn carbon Nuôi VSV 30 - 32oC vòng 72h - Hút từ - ml dung dịch nuôi cấy đem ly tâm 6000 vòng/phút v ng 15 ph t để loại bỏ sinh khối vi sinh vật, thu dịch pha - Cho - 2ml dịch vào ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS - Đun sôi v ng ph t quan sát đổi màu + Nếu vi sinh vật có hoạt tính cellulase dung dịch chuyển sang màu đỏ cam + Nếu vi sinh vật khơng có hoạt tính dung dịch có màu vàng 28 2.5.8 Xác định hoạt tính catalase Nguyên tắc: + Catalase diện vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý Catalase thủy phân hydrogen perioxide (H2O2) thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao TB Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2, đƣợc ghi nhận qua tƣợng sủi bọt khí + Phƣơng pháp thƣờng đƣợc dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với kỵ khí nhƣ phân biệt Bacillus (+) với Clostridium (-) Tiến hành: - Nuôi lắc vi sinh vật môi trƣờng King B, Gause I lỏng 18 – 24 nhiệt độ 320C - Lấy giọt canh khuẩn lên lamen - Bổ sung vài giọt hydrogen peroxid (H2O2) 3% lên giọt canh khuẩn - Quan sát ghi nhận kết quả: + Khơng có tƣợng sủi bọt, khơng sinh catalase + Có tƣợng sủi bọt O2 phóng thích, catalase dƣơng tính 2.5.9 Phương pháp xử lí phân tích số liệu Xử lý phân tích số liệu hay liệu nghiên cứu bƣớc nghiên cứu, bao gồm xác định vấn đề nghiên cứu, thu thập số liệu, phân tích số liệu báo cáo kết Đề tài tiến hành sử dụng phƣơng pháp phân tích số liệu phƣơng pháp xác định giá trị trung bình phƣơng pháp xác định sai số phép đo • Xác định giá trị trung bình Khi đo n lần đại lƣợng A, ta nhận đƣợc giá trị khác nhau: A1, A2,… An Giá trị trung bình: • Cách xác định sai số phép đo: Sai số tuyệt đối trung bình n lần đo đƣợc tính theo cơng thức: 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng Từ mẫu đất thu thập đƣợc, đề tài phân lập đƣợc 26 chủng vi sinh vật tạo khuẩn lạc môi trƣờng King B Gause I, xác định đƣợc chủng vi khuẩn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với VSV kiểm định từ mạnh đến yếu Các chủng vi khuẩn đƣợc kí hiệu từ B1 đến B7, chủng xạ khuẩn kí hiệu XK1 Thời gian trung bình để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc 36 - 48h Kết thu đƣợc thể Bảng 3.1, Bảng 3.2 Hình 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật STT Kí hiệu chủng VSV Kí hiệu mẫu đất Hình dạng Kích thƣớc (mm) B1 RL Khuẩn lạc tròn, lớn bề mặt nhầy, lồi nhăn từ đến mép, màu trắng đục - mm B2 RL Khuẩn lạc tròn, bề mặt nhầy, khơng có cƣa, có nhân giữa, màu trắng 1mm B3 SN Khuẩn lạc tròn, nhỏ, bề mặt nhầy, khơng có cƣa, màu trắng xám Dƣới 1mm 30 Hình ảnh B4 RL Khuẩn lạc trịn,lớn, có cƣa rìa, bề mặt nhầy, nhăn, màu trắng đục - mm B5 RL Khuẩn lạc trịn, có cƣa rìa, bề mặt nhầy, màu trắng đục - 1,5 mm B6 SN Khuẩn lạc nhỏ, trịn, bề mặt nhầy, khơng có cƣa, màu vàng Dƣới 1mm B7 RL Khuẩn lạc trịn, khơng nhăn, khơng có cƣa, có nhân giữa, màu trắng đục - 1,2 mm XK1 SN Khuẩn lạc trịn, nhỏ, bơng bề mặt, khơng có cƣa, màu trắng 1mm 31 Bảng 3.2 Kết xác định hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với chủng vi sinh vật kiểm định Ký hiệu chủng vi sinh vật Đƣờng kính vòng đối kháng với VSV kiểm định D - d (mm) Xanthomonas oryzae Erwinia sp Fusarium oxysprorum B1 18 15 32 B2 1,5 B3 13 B4 4,5 B5 16 14 27 B6 17,5 13 25 B7 10 XK1 2,5 - 32 Hình 3.1 Khả đối kháng với vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập A, B, C: Khả đối kháng chủng vi sinh vật với nấm Fusarium oxysprorum D: Khả đối kháng chủng vi sinh vật với vi khuẩn Erwinia carotovora sp E: Khả đối kháng chủng vi sinh vật với vi khuẩn Xanthomonas oryzae 33 Kết trình bày Bảng 3.2 Hình 3.1 cho thấy: - Đối với vi khuẩn: chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng từ mạnh đến yếu Trong có chủng B1, B5, B6 có nguồn gốc phân lập từ mẫu đất sƣờn n i Luốt ruộng l a thị trấn Xuân Mai có khả đối kháng mạnh với hầu hết với chủng vi sinh vật kiểm định + Chủng B1 có khả đối kháng mạnh so với vi khuẩn Xanthomonas oryzae, Erwinia carotovora, mạnh so với nấm Fusarium oxysprorum với D – d lần lƣợt 18; 15 32 mm + Chủng B5, B6 có khả kháng từ mạnh đến trung bình với loại vi sinh vật kiểm định với D - d = 13 ÷ 27 mm + Các chủng B2, B3, B7 có khả đối kháng từ trung bình đến yếu với loại vi sinh vật kiểm định với D – d = 1,5 mm - Đối với xạ khuẩn: chủng XK1 có hoạt tính đối kháng yếu với vi khuẩn Xanthomonas oryzae nấm Fusarium oxysprorum, khơng có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Erwinia carotovora Kết nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) kháng bệnh bạc lúa Xanthomonas oryzae” Nguyễn Thị Xuân (2014), Luận án Thạc sĩ Khoa học, cho thấy đƣờng kính v ng đối kháng cao 14mm; so sánh khả đối kháng chủng B1, B5 B6 với vi khuẩn Xanthomonas oryzae vƣợt trội so với chủng xạ khuẩn mà đề tài phân lập lần lƣợt 18, 16, 17,5mm; nhiên chủng xạ khuẩn XK1 có hoạt tính đối kháng yếu - Dựa vào kết xác định hoạt tính đối kháng, đề tài tuyển chọn chủng vi khuẩn là: B1, B5, B6 có khả đối kháng mạnh, đặc biệt chủng B1 có khả đối kháng mạnh để thực nghiên cứu 34 3.2 Xác định hình dạng tế bào chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn Nhuộm Gram phƣơng pháp nhằm phân loại vi khuẩn thành nhóm lớn dựa vào cấu tạo thành tế bào khác chúng Đây phƣơng pháp hữu hiệu bƣớc đầu định danh vi sinh vật Đặc điểm hình dạng tế bào chủng B1, B5, B6 đƣợc trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái tế bào chủng tuyển chọn Kí hiệu Hình dạng chủng VSV Gram B1 + Trực khuẩn dài, tồn riêng lẻ thành chuỗi Bầu dục, tồn B5 + riêng lẻ thành chuỗi Trực khuẩn ngắn, B6 + tồn riêng lẻ thành chuỗi 3.3 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn Từ chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn, đề tài tiến hành xác định khả sinh enzyme phƣơng pháp nhƣ mục 2.5.7, kết thu đƣợc trình bày Bảng 3.4 Hình 3.2 35 Bảng 3.4 Kết xác định khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào chủng B1, B5, B6 STT Ký hiệu chủng vi khuẩn B1 B5 B6 Đƣờng kính vòng phân giải chất (D - d) mm Casein CMC Tinh bột 23 20 18 24 22 14.5 18 16 11 Hình 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn A, E: Khả sinh enzyme cellulose C : Khả sinh enzyme protease B, D: Khả sinh enzyme amylase Kết thu đƣợc dựa phƣơng pháp xác định hoạt tính cho thấy chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả sinh loại enzyme amylase, protease, cellulase - Chủng B1, B5 có khả sinh tổng hợp enzyme protease cellulase mức mạnh, sinh enzyme amylase mạnh thể đƣờng kính 36 vịng phân giải chất casein,CMC tinh bột lần lƣợt 23mm, 24mm, 18mm chủng B1 20mm, 22mm, 16mm chủng B5 - Chủng B6 có hoạt tính protease mạnh với đƣờng kình vịng phân giải chất 18mm; sinh tổng hợp cellulose amylase trung bình với đƣờng kính vịng phân giải chất 14,5mm 11mm 3.4 Xác định hoạt tính catalase Dựa sở phƣơng pháp xác định hoạt tính nêu mục 2.5.8, đề tài tiến hành xác định hoạt tính catalase chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn Kết thu đƣợc thể Hình 3.3 Cả chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn có hoạt tính catalase Hình 3.3 Xác định hoạt tính catalase 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã phân lập đƣợc 26 chủng vi sinh vật môi trƣờng King B Gause I có chủng vi khuẩn chủng xạ khuẩn thể hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định từ yếu đến mạnh - Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật có khả đối kháng mạnh với số chủng vi sinh vật gây hại trồng (nấm Fusarium oxysprorum, vi khuẩn Xanthomonas oryzae, vi khuẩn Erwinia carotovora) chủng B1, B5, B6 - Đã xác định đƣợc hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng vi sinh vật tuyển chọn kí hiệu B1, B5 B6 Cả chủng vi khuẩn Gram dƣơng, sống riêng lẻ thành chuỗi; chủng B1 B6 trực khuẩn, chủng B5 có dạng hình bầu dục - Đã xác định đƣợc khả sinh tổng hợp loại enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease) chủng vi sinh vật đối kháng mạnh tuyển chọn với lực sinh tổng hợp amylase, cellulose, protease ngoại bào chủng lần lƣợt là: - Cả chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn B1, B5, B6 có hoạt tính catalase Kiến nghị Do thời gian điều kiện làm việc có hạn, tơi chƣa thực đƣợc số nội dung nghiên cứu chủng tuyển chọn Vì có điều kiện nghiên cứu vấn đề này, đề nghị nghiên cứu tiếp số nội dung sau: - Xác định thêm số đặc điểm sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử để định danh đến loài chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn đặc biệt chủng B1 38 - Tối ƣu số điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH…) ảnh hƣởng ngƣời, động vật chủng tuyển chọn - Dựa điều kiện nghiên cứu trƣớc tiến hành thử nghiệm sản xuất phân bón vi sinh vật đối kháng 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi, Lê Dỗn Diên (2002), Hóa Sinh Công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng (2014) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Thành Đạt (200), Sinh học Vi sinh vật Nhà xuất giáo dục Đặng Thị Ngọc Hà (2013) Nghiên cứu sàng lọc số chủng vi khuẩn nội sinh có khả kháng nấm hại Keo Khóa luận tốt nghiệp, Hà Nội Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Nguyễn Văn Hạnh, (2009), Các phản ứng sinh hóa Nhà xuất giáo dục Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Nguyễn Tiến Thắng Ngô Kế Sƣơng (2007) Khảo sát hoạt tính enzyme chitinase, β-glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease chủng Trichoderma phân lập Việt Nam Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.708 - 710 Dƣơng Minh, Lê Phƣớc Thạnh, Hồ Văn Thiệt, Lê Bảo Ti Võ Thị Gƣơng (2006) Tác động chủng nấm đối kháng Trichoderma nội địa việc phòng trị bệnh Phytophthora palmivora gây hại sầu riêng Cần Thơ Bến Tre Tạp chí khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, 6, tr.154-161 TCCS 58 - 2013/BTTV: Tiêu chuẩn khảo nghiệm đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh héo xanh Pseudomonas solanacearum Smith hại lạc thuốc trừ bệnh TCVN 9300 - 2012: Vi sinh vật – Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh trồng cạn 10 Lê Lƣơng Tề, Bùi Trọng Thủy (2007) Một số nghiên cứu Xa - gen kháng bệnh bạc lúa Tạp chí Bảo vệ thực vật, 1(1), tr - 11 Lê Lƣơng Tề, Đỗ Tấn Dũng, Ngơ Bích Hảo, Trần Nguyễn Hà, Vũ Triệu Mân, Nguyễn Kim Vân, Ngô Thị Xun (2007) Giáo trình Bệnh nơng nghiệp, Nhà xuất nông nghiệp 12 Lê Lƣơng Tề Vũ Triệu Mân (1999) Bệnh vi khuẩn vi rút hại trồng Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr7 - 118 13 Phạm Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2003) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh vùng rễ thông Thông tin khoa học kĩ thuật lâm nghiệp, tr.2-5.n Tiếng Anh 14 Anand R, Kulothungan S (2010), Antifungal metabolite Pseudomonas fluorescens against crown rot pathogen of Arachis hypogaea Annals of Biological Research 1(1):199 - 207 15 Cohen – Kupiec, R Chet, I., (1998), Bacillus species, Appl Environ Micobiol, 266, pp.147 - 159 16 Elad, Y., Chet, I and Henis, Y (1982), Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum, Canadian Journal of Microbiology 28, pp.719-725 Ganesan P and Gnanamanickam S S (1987), Biological control of Sclerotium rolfsii sacc in peanut by inoculation with Pseudomonas fluorescens Soil Biology and Biochemistry Volume 19, Issue 1, Pages 35 -38 17 H Outtrup, T.S Jorgensen ST, 2002 The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes In: Berkeley R, Heyndrickx M, Logan N, De Vos P (eds), Applications and systematics of Bacillus and relatives, Blackwell publishing, UK, pp 206-218 18 Kishore GK, Greeher WJ (1995), Managemet of stem rot of stem rot of peanuts (Arachis hypogaea) caused by Sclerotium rolfsii with fungicides Crop Protection 14: 135-141 19 Lemanceau P, Dekogel WJ, Alabouvette C and Schippers B 1993 Antagonistic effect of nonpathogenic Fusarium oxysprorum Fo47 and pseudobactin 358 upon pathogen Fusarium oxysprorum f sp dianthi Appl Envir Microbiol 59:74-82 20 Lu S-E, Woolfolk S, Caceres J 2005 Isolation and identification and genetic analysis of Rhizobacteria antagonistic to plant soilborne fungal pathogens Phytopathology.95:62-63 21 Mansour B, Martin D, Kenneth E Feb 15, 1999 Dept Conway “Evaluation of Burkholderia cepacia Strains:” Root Colonization of Catharanthus roseus and In-Vitro Inhibition of Selected Soil-Borne Fungal Pathogens” Of Entomology and Plant Pathology 22 Mason M.G., Ball A.S., Reeder B.J., Silkstone G., Nicholls P., Wilson M.T (2001) Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken indentity.Appl Environ Microbiol, 67, 4512-4519 23 Pasti M B., Pometto A P., Nuti M P., Crawford D L (1990) “Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt” Appl Environ Microbiol, 2213-2218 24 Rajebhosale, A.P.K.; Chowdari, K.V; Ramakrishma, W.; S.A.; Gupta.V.S.; Gananamanickam, S.S.; Ranjekar P.K DNA fingerprinting of Indian isolates of Xanthomonas oryzae pv Oryzae in 25 Sheela J, Packiaraj D (2000), Management of collar rot of groundnut by Pseudomonas fluorescens IAN.20, pp.50-51 26 Yedfidia, I., Shoresh, M., Kerem, Z., Benhamou, N., Kapulnik, Y., Chet, I 2003 Concomitant induction of systemic resistance to Pseudomonas syringae pv Lanchrymans in Cucumber by Trichoderma asperellum (T-203) and accumulation of phytoalexins Applied Environmental Microbiology, 69: 7343-7353