Phân lập và định dạng một số dòng nấm có khả năng kích thích tạo trầm hương từ thân cây dó bầu tại hà tĩnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DẠNG MỘT SỐ DỊNG NẤM CĨ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TẠO TRẦM HƯƠNG TỪ THÂN CÂY DĨ BẦU TẠI HÀ TĨNH NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Hồng Gấm Sinh viên thực : Trần Thị Mai Hạnh Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI MỞ ĐẦU Trong trình thực chuyên đề nghiên cứu khoa học, để hoàn thành đề tài, Em nhận đƣợc giúp đỡ tận tình từ thầy giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - trƣờng Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Nguyễn Thị Hồng Gấm - ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báu để chúng em hồn thành đề tài Đồng thời, Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Viện nghệ sinh học Lâm nghiệp, thầy cô thuộc môn Công nghệ Vi sinh Hóa sinh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình thực đề tài Thơng qua trình thực đề tài, Em học đƣợc nhiều điều rút đƣợc nhiều học kinh nghiệm q báu Vì kiến thức thân cịn hạn chế, trình thực đề tài khơng tránh khỏi sai sót, Em kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu thầy Em xin trân thành cảm ơn ! Sinh viên thực Trần Thị Mai Hạnh i MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU i DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát Dó Bầu 1.1.1 Giới thiệu Dó Bầu 1.1.2 Đặc điểm sinh thái Dó bầu 1.1.3 Đặc điểm hình thái Dó bầu 1.1.4 Đặc điểm sinh học Dó bầu 1.1.5 Địa điểm phân bố Dó bầu 1.1.6 Cơng dụng Dó bầu 1.1.7 Triển vọng thách thức 1.2 Khái quát tinh dầu Trầm 1.2.1 Khái quát chung tinh dầu trầm 1.2.2 Tính chất hóa lý tinh dầu trầm 1.2.3 Thành phần tinh dầu trầm 1.3 Tổng quan nghiên cứu tạo trầm hƣơng 10 1.3.1 Tạo trầm hƣơng Việt Nam 10 1.3.2 Trên giới 11 1.4 Các phƣơng pháp kích thích tạo Trầm hƣơng 12 1.4.1 Phƣơng pháp tạo trầm truyền thống 13 1.4.2 Phƣơng pháp tạo trầm đại 13 CHƢƠNG II MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.1.1 Mục tiêu chung 17 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Vật liệu nghiên cứu 17 ii 2.3.1 Hóa chất, thiết bị 17 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phƣơng pháp phân lập nấm 18 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc tính sinh học 19 2.4.3 Phƣơng pháp định tên nấm 19 2.4.4 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 21 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết phân lập số chủng nấm thân Dó bầu 22 3.2 Kết nghiên cứu đặc tính sinh học 24 3.2.1 Nghiên cứu mơi trƣờng ni cấy thích hợp 24 3.2.2 Nghiên cứu pH thích hợp 26 3.2.3 Khả sinh enzym ngoại bào 29 3.3 Kết định danh nấm 32 3.3.1 Kết định danh nấm thơng qua đặc điểm hình thái 32 3.3.2 Kết định danh nấm kĩ thuật sinh học phân tử 34 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 42 Kết luận 42 Tồn 42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 iii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây Dó bầu Hình 1.2 Mặt cắt ngang thân Dó bầu tạo trầm Hình 1.3 Năm loại khung sesquiterpene tinh dầu Hình 3.1 Biểu đồ thể đƣờng kính (cm) khuẩn lạc môi trƣờng khác 25 Hình 3.2 Chủng nấm GA1 mơi trƣờng PDA Sabouround 25 Hình 3.3 Chủng nấm GA2 môi trƣờng PDA Sabouround 26 Hình 3.4 Chủng nấm GA3 mơi trƣờng PDA Sabouround 26 Hình 3.5 Biểu đồ thể đƣờng kính khuẩn lạc (cm) pH khác 27 Hình 3.6 Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) GA1 pH khác 28 Hình 3.7 Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) GA2 pH khác 28 Hình 3.8 Đƣờng kính khuẩn lạc GA3 (cm) pH khác 28 Hình 3.9 Biểu đồ thể khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 30 Hình 3.10 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm GA1 31 Hình 11 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm GA2 31 Hình 12 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm GA3 31 Hình 13 Chủng nấm GA1, a: kính hiển vi, b: đĩa thạch 32 Hình 14 Chủng nấm GA2, c: kính hiển vi, d: đĩa thạch 33 Hình 15 Chủng nấm GA3, e: hệ sợi, f: đĩa thạch, g: bào tử 34 Hình 16 Kết so sánh trình tự gen chủng GA1 BLAST NCBI 35 Hình 17 Sơ đồ di truyền chủng GA1 37 Hình 18 Kết so sánh trình tự gen chủng GA2 BLAST NCBI 38 Hình 19 Sơ đồ di truyền chủng GA2 39 Hình 20 Kết so sánh trình tự gen chủng GA3 BLAST NCBI 40 Hình 3.21 Sơ đồ di truyền chủng GA3 41 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các tiêu hóa lý tinh dầu trầm Bảng 1.2 Các thành phần gây mùi tinh dầu trầm/ trầm hƣơng 10 Bảng Các nghiên cứu tạo trâm hƣơng phƣơng pháp sinh học 14 Bảng Kết phân lập nấm từ mẫu gỗ ban đầu 23 Bảng Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) mơi trƣờng khác 24 Bảng 3 Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) pH khác 27 Bảng 3.4 Đƣờng kính vịng phân giải (cm) chất chủng nấm 29 Bảng 3.5 Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA1 với trình tự tƣơng đồng GeneBank 36 Bảng 3.6 Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA2 với trình tự tƣơng đồng GeneBank 38 Bảng 3.7 Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA3 với trình tự tƣơng đồng GeneBank 40 v ĐẶT VẤN ĐỀ Các lồi Dó có khả sinh trầm thân đƣợc gọi Dó Bầu (Aquilarria spp.) hay Trầm hƣơng, số địa phƣơng gọi Tóc, sản phẩm thƣơng mại gọi Agarwood, Agar wood oil Eaglewood Trong suốt vòng đời chúng, Aquilaria phải nhiều năm để phát triển hình thành gỗ trầm hƣơng, xảy cách ngẫu nhiên rừng tự nhiên Nhu cầu cao trầm hƣơng thị trƣờng quốc tế ảnh hƣởng nghiêm trọng đến tài nguyên thiên nhiên đặt lồi Aquilaria vào Cơng ƣớc quốc tế bn bán lồi động vật thực vật hoang dã có nguy tuyệt chủng (CITES, 2012) Để khắc phục vấn đề đáp ứng nhu cầu cao gỗ trầm hƣơng, hệ thống sản xuất thay thiếu Nuôi cấy mô thực vật kỹ thuật đầy hứa hẹn, bao gồm sản xuất liên tục chất chuyển hóa thứ cấp đặc biệt hợp chất thơm (Shrivastava et al., 2006) Nhiều chiến lƣợc công nghệ sinh học đƣợc thực để tăng cƣờng sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp trầm hƣơng Đối với loài Aquilaria, việc cảm ứng yếu tố sinh học phi sinh học điều kiện cần thiết để hình thành gỗ trầm hƣơng, nhƣ kết nghiên cứu việc nuôi cấy tế bào A sinensis chiết xuất từ nấmMelanotus flavolivensđã kích thích tổng hợp 2-(2-phenylethyl)-chromone, thành phần gỗ trầm hƣơng có hoạt tính chống dị ứng (Shu et al., 2005) Hơn nữa, theo số nghiên cứu cho thấy số loại nấm thƣờng đƣợc xem thành phần vi sinh vật kích thích hình thành trầm hƣơng đƣợc phân lập đƣợc xác định (Tamuli et al., 2000; Tabata et al., 2003; Mohamed et al., 2010) Vì đƣợc trí ban lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, môn Công nghệ tế bào, dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm, em thực đề tài:“Phân lập định danh số dịng nấm có khả kích thích tạo trầm hương từ thân Dó Bầu Hà Tĩnh” CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát Dó Bầu 1.1.1 Giới thiệu Dó Bầu Cây Dó bầu thuộc: - Lớp: Magnoliopsida - Bộ: Myrtales - Họ: Thymelaeaceae - Giống: Aquilaria - Tên khoa học: Aquitarra crassna Pierre ex Lecomte, A agallocha roxb - Tên khác: Kỳ nam, trầm, Dó bầu, rà hƣơng - Tên nƣớc ngoài: Tùy theo quốc gia có cách gọi tên khác Chẳng hạn, Anh gọi : Agarwood, malayan eaglewood, Pháp: bois d’aigle, Trung quốc: tuchenxiang (tiếng phổ thông Ch’en Hsiang), Campuchia : crassna, krassna, kresna, chan krassna, klampeok, Indonesia : gaharu, tengkaras, mengkaras,…[1] 1.1.2 Đặc điểm sinh thái Dó bầu Dó bầu trung tính, lúc cịn nhỏ ƣa bóng, lớn thiên ánh sáng, mọc rải rác khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới nguyên sinh thứ sinh, xanh quanh năm, sống thích hợp rừng hỗn giao, rộng, Dó bầu tái sinh chồi hạt, sinh trƣởng, phát triển điểu kiện, nhiệt độ từ 15-36 0C vào ban ngày, 5-25oC vào ban đêm, tối thích hợp 22-29oC, lƣợng mƣa hàng năm 1200mm, độ ẩm >80%, độ cao từ 3001000m, tập trung độ cao 500-700m, độ dốc 25 độ Cây Dó bầu sinh trƣởng nhiều loại đất núi, đất đỏ xám, đất vàng, đất feralit, thích hợp đất nâu vàng, đất thịt pha cát cịn tính chất rừng, có tầng canh tác sau nhiều mùn Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, ẩm, chua gần trung tính (pH vào khoảng từ 4-6) [17] 1.1.3 Đặc điểm hình thái Dó bầu Đây loại gỗ lớn, cao khoảng 30-40m Tuy nhiên, độ cao trung bình phổ biến 15-25m Thân có đƣờng kính khoảng 60cm với màu xám, vỏ nhẵn Bên lớp vỏ thịt gỗ màu vàng nhạt Chúng loại đơn Lá chúng có hình bầu dục, hình trứng hình giáo Mặt phiến nhẵn bóng có màu xanh đậm Mặt dƣới lại có màu nhạt phần lơng mềm Nhìn chung loại nhiều lơng Khơng phần lá, cành non phần cuống có lơng mềm Hình 1.1 Cây Dó bầu Về hoa, hoa mọc thành chùm nách Chúng có hình chng có lơng miệng Cây có tuổi từ 4-5 năm bắt đầu hoa kết trái Ở Việt Nam, khoảng tháng 2-3 có hoa đến khoảng tháng 6-7 dƣơng lịch chín Quả nhìn giống trái su su Mỗi có từ 1-2 hạt Hạt chín có màu nâu Phần ngồi cứng, bên mềm có tinh dầu nên khơng lƣu trữ đƣợc lâu [17] 1.1.4 Đặc điểm sinh học Dó bầu Hình 1.2 Mặt cắt ngang thân Dó bầu tạo trầm Cơ chế tạo trầm hƣơng Dó bầu đến điều nan giải chƣa đƣợc hiểu biết tƣờng tận Ngƣời ta cho khối trầm đƣợc tạo kết hoạt động chuyển hóa bệnh lý nơi bị bệnh, bị thƣơng,… Một số nghiên cứu cho Dó bầu sinh trầm hƣơng “sự biến đổi phân tử gỗ dƣới ảnh hƣởng loại bệnh gây ra, trầm hƣơng phần gỗ bệnh lý xuất Aquilaria dƣới tác động tác nhân gây bệnh loại nấm thuộc nhóm bất tồn Căn vào hóa nhựa (sự tụ dầu) nhiều hay phân loại trầm hƣơng thành loại khác nhƣ: - Tóc (có nguồn gốc tƣ chữ tok ngƣời campuchia), nhựa(dầu) nhiễm bên mạch gỗ - Trầm hƣơng: Do phân hóa khơng trọn vẹn phần tử gỗ, gỗ nhựa hơn, màu nâu hay có sọc đen, nhẹ đƣợc nƣớc, dùng để chƣng cất tinh dầu - Kỳ nam (nghĩa điều kỳ diệu phƣơng nam): Do biến đổi hoàn toàn phần tử gỗ (các phần tử gỗ thối hóa, biến dạng, mộc tố chứa chất nhựa thơm) có màu nâu đậm hay đen, nặng chìm nƣớc, vị đắng, thƣờng hình thành phần lõi gỗ (nhựa nhiễm bên bên mạch gỗ đậm đặc) [21] 3.3 Kết định danh nấm 3.3.1 Kết định danh nấm thông qua đặc điểm hình thái 3.3.1.1 Đặc điểm hình thái chủng GA1 Hình 13 Chủng nấm GA1, a: kính hiển vi, b: đĩa thạch Khuẩn lạc:Trên môi trƣờng PDA, nhiệt độ 25±1oC, tuổi phân loại ngày, tốc độ mọc nhanh, lúc đầu khuẩn lạc màu trắng, già bề mặt khuẩn lạc tạo thành đám conidin nhấp nhô bề mặt không đều; mặt phải màu trắng đục non, sau ngày chuyển dần sang màu xanh trắng Whitish Green, sau ngày màu xanh đậm Deep American Green; mặt trái khơng màu; khơng có sắc tố mơi trƣờng (Hình 3.13b) Cơ quan sinh sản: Sợi nấm dinh dƣỡng có vách ngăn, nhẵn có phân nhánh, màu xanh đen Thể bình mọc thành vịng quanh cuống chính, 2-4 Conidi mọc đơn độc hay tụ lại đỉnh thể bình thành đám dầu conidi, hình cầu hay hình trứng ngắn Dựa vào khóa phân loại, so sánh đặc điểm quan sát đƣợc, bƣớc đầu kết luận chủng nấm GA1 thuộc chi nấm Trichoderma Cùng với kết phân lập Nguyễn Đức Huy cộng (2018), phân lập đƣợc chủng nấm thuộc chi Trichoderma có đặc điểm nhƣ miêu tả [4] 32 3.3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm GA2 Hình 14 Chủng nấm GA2, c: kính hiển vi, d: đĩa thạch Khuẩn lạc: Chủng nấm GA2 đƣợc nuôi cấy môitrƣờng PDA nhiệt độ 25 ± 2oC, tản nấm phát triển nhanh, dầy xốp (Hình 3.14d), sau - ngày ni cấy, nấm phát triển đƣợc 9,0 cm hình thành nhiều bào tử phân sinh Cơ quan sinh sản:Thể bình mọc đối xứng thành chùm - thể bình đầu cành bào tử phân sinh (Hình 3.14c) Từ thể bình hình thành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh trịn trịn hình trứng Từ miêu tả hình thái màu sắc hệ sợi bào tử, so sánh với khóa phân loại, bƣớc đầu kết luận chủng nấm GA2 thuộc chi Trichoderma Tuy có khác biệt với chủng nấm GA1 nhƣng so sánh với kết phân lập Nguyễn Đức Huy cộng (2018), phân lập đƣợc chủng nấm Trichodermaasperellum Trichoderma harzianumvới hình thái phân chia thể bình khác quan sát kính hiển vi hệ sợi chủng T.harzianum phát triển thƣa so với chủng T asperellum.[4] 33 3.3.1.3 Đặc điểm hình thái chủng nấm GA3 Hình 15 Chủng nấm GA3, e: hệ sợi, f: đĩa thạch, g: bào tử Khuẩn lạc:Khuẩn lạc phát triển nhanh, theo hình rẻ quạt Mặt phải ban đầu có màu trắng, sau 4-5 ngày chuyển dần sang màu vàng cam Cơ quan sinh sản: Hệ sợi hình trụ, phân nhánh có vách ngăn (Hình 3.15e) Bào tử có màu vàng cam, hình trịn tới hình trứng (Hình 3.15g) Dựa vào khóa phân loại, so sánh đặc điểm quan sát đƣợc, bƣớc đầu kết luận chủng GA3 thuộc chi Rigidoporus Xuyu Chen cộng (2018) phân lập đƣợc chủng nấm Rigidoporus vinctus có đặc điểm tƣơng tự nhƣ chủng GA3 phân lập [12] 3.3.2 Kết định danh nấm kĩ thuật sinh học phân tử 3.3.2.1 Chủng nấm GA1 DNA chủng nấm GA1 tinh đƣợc định tên theo phƣơng pháp sinh học phân tử kĩ thuật PCR cặp mồi đặc hiệu Công ty Nam Khoa Biotek Kết thu đƣợc trình tự chủng GA1 nhƣ sau: GGGGCCATTCCTTACACCTGCTGCTGAGTGATATTTCCTGATGC TGCGTGTTCTTCCACTGTGGACGCGCCGCGCTCCCGATGCGAGTGTG CAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGGTTTTGATTCATTTTCGA AACGCCTACGAGAGGCGCCGAGAAGGCTCAGATTATAAAAAAACCC GCGAGGGGGTATACAATAAGAGTTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGC CTTGGTCCGCCGCCACTGTATTTCGGAGAGGCCCCCGCTGGAGGAGG GCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATG 34 ACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCTTGATTCATTTTC GAAACGCCTACGAGAGGCGCCGAGAAGGCTCAGATTATAAAAAAAC CCGCGAGGGGGTATACAATAAGAGTTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGC GCCTTGGTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCAGAGATCCCGCCGA GGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTC GGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTATGCGA TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTTACCCG Hình 16 Kết so sánh trình tự gen chủng GA1 BLAST NCBI Trình tự gen vùng ITS chủng nấm GA1 có kích thƣớc 666 Nucleotide Khi so sánh trình tự gen nhận đƣợc nghiên cứu với trình tự gen tƣơng ứng ngân hàng sở liệu GenBank cho thấy mức độ tƣơng đồng khác (Bảng 3.5) 35 Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA1 với trình tự tương đồng GeneBank Chủng nấm Trichoderma harzianum isolate 11-TTR-2 Độ tƣơng đồng (%) Mã số truy cập gen banks 100 MT341774.1 100 MT156345.1 100 MK714897.1 100 MK714894.1 100 MK714890.1 100 KY263561.1 100 MN565944.1 100 MK593904.1 Trichoderma harzianum isolate Jhabua:MadhyaPradesh Trichoderma afroharzianum strain CEN1417 Trichoderma afroharzianum strain CEN1414 Trichoderma afroharzianum strain CEN1410 Trichoderma harzianum strain PPRI 15147 Trichoderma harzianum strain omo9 Trichoderma harzianum isolate ILSO1_6_17 Từ kết so sánh mức độ tƣơng đồng trình tự vùng gen ITS chủng nấm GA1 NCBI BLAST, ta thu đƣợc di truyền nhƣ hình 3.17 36 Hình 17 Sơ đồ di truyền chủng GA1 Căn vào kết so sánh mức độ tƣơng đồng kết hợp với xây dựng di truyền từ trình tự DNA thu đƣợc chủng GA1, chủng GA1 đƣợc định tên Trichoderma harzianum Mohamed cộng (2010) phân lập đƣợc chủng nấm thuộc loài Curvularia, Cunninghamella, Trichoderma Fusariumtrong đất nhƣ thân trầm hƣơng Malaysia[22] 3.3.2.2 Chủng nấm GA2 Chủng nấm GA2 đƣợc định tên theo phƣơng pháp sinh học phân tử kĩ thuật PCR cặp mồi đặc hiệu Công ty Nam Khoa Biotek Kết thu đƣợc trình tự chủng GA2 nhƣ sau: GGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCC GGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAAC CAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTAGTT TGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGGCTGCTACTCAC CCTGTGCGTACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAA ACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCAC AGGGTGAGTAGCAGCCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCCTCACACGGG 37 TGCCGGCCCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG CAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCG TAAAACACCCAACTTGGGGACTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTAC AACTCCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGG GGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCACCTCG GATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG Hình 18 Kết so sánh trình tự gen chủng GA2 BLAST NCBI Trình tự gen vùng ITS chủng nấm GA2 có kích thƣớc 648 Nucleotide Khi so sánh trình tự gen nhận đƣợc nghiên cứu với trình tự gen tƣơng ứng ngân hàng sở liệu GenBank cho thấy mức độ tƣơng đồng khác (bảng 3.6) Bảng 3.6 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA2 với trình tự tương đồng GeneBank Chủng nấm Trichoderma asperellum Trichoderma hamatum Trichoderma asperellum isolate BTas42 Trichoderma asperellum isolate T4 Trichoderma asperellum isolate upm8 Trichoderma asperellum isolate T3 Độ tƣơng đồng (%) 100 100 Mã số truy cập gen banks MN093873.1 MH648615.1 100 MK255055.1 100 MK210428.1 100 MK027311.1 100 MH809174.1 38 Dựa vào mức độ tƣơng đồng trình tự vùng gen ITS chủng nấm GA2 sau sánh ngân hàng NCBI BLAST, xây dựng đƣợc di truyền nhƣ hình 3.19 Hình 19 Sơ đồ di truyền chủng GA2 Từ kết so sánh mức độ tƣơng đồng kết hợp với xây dựng di truyền chủng GA2, chủng GA2 đƣợc định tên Trichoderma asperellum Hemraj Chhipa Nutan Kaushik (2017) phân lập đƣợc 40 loài nấm vi khuẩn từ thân trầm hƣơng (Aquilaria malaccensis Lam) đồng thời đánh giá khả kích thích tạo Agarospirol chủng nấm phân lập Trong đó, chủng nấm Trichoderma asperellumAQGSS 11 có khả kích thích tổng hợp agarospirol khoảng 0,2% [16] 3.3.2.3 Chủng nấm GA3 Chủng nấm GA3 đƣợc định tên theo phƣơng pháp sinh học phân tử kĩ thuật PCR cặp mồi đặc hiệu Cơng ty Nam Khoa Biotek Kết thu đƣợc trình tự chủng GA3 nhƣ sau: ATACCCCAAATCTTTGCGGATAAGGGTGTGTTGGACTTGGAGG TTTTTGCAGGTAATGATTGTGTTACCTTTTCCTCTTAAATGCATTAGC AGAGATAATACTGCTACTCTCCAGTGTGATAATTGTCTACACTGTTAG TAGTGCGGTATAACAAAATGTCTATGCTTCTAATCGTCTTCTATTTGG CGGATTGTAGCTGGCCCCAACCGGGCATGTGCACATTCTGTTCATTCC ATTCTCATACACCTCTGTGCACTTTACATAGGTTTGGTATAGAAAAGG 39 TCTTTATTGACTTTGGAAATACTGACCTATGCTTTTATAAACGCTTCA GTTTTAGAATGTCATCCGCGTATAACGCAATGGCGGATTGTAGCTGG CCCCAACCGGGCATGTGCACATTCTGTTCATTCCATTCTCATACACCT CTGTGCACTTTACATAGGTTTGGTATAGAAAAGGTCTTTATTGACTTT GGAAATACTGACCTATGCTTTTATAAACGCTTCAGTTTTAGAATGTCA TCCGCGTATAACGCAATACAACTTTTGACAATCTGACCTCAAATCAG GTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAG Hình 3.20 Kết so sánh trình tự gen chủng GA3 BLAST NCBI Trình tự gen vùng ITS chủng nấm GA3 có kích thƣớc 841 Nucleotide Khi so sánh trình tự gen nhận đƣợc nghiên cứu với trình tự gen tƣơng ứng ngân hàng sở liệu GenBank cho thấy mức độ tƣơng đồng khác (bảng 3.7) Bảng 3.7 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA3 với trình tự tương đồng GeneBank Độ tƣơng đồng Mã số truy cập (%) gen banks Rigidoporus vinctus isolate 1-4-4-2 100 MF579588.1 Rigidoporus vinctus isolate L 100 MK934414.1 Fungal sp strain Q3 100 MF564090.1 Rigidoporus vinctus strain TF6 100 MH625702.1 Rigidoporus vinctus isolate 1-5-10-2 100 MF579592.1 Rigidoporus vinctus isolate 1-3-10-1 100 MF579584.1 Chủng nấm 40 Dựa vào mức độ tƣơng đồng trình tự vùng gen ITS chủng nấm GA2 sau sánh ngân hàng NCBI BLAST, xây dựng đƣợc di truyền nhƣ hình 3.21 Hình 3.21 Sơ đồ di truyền chủng GA3 Từ kết so sánh mức độ tƣơng đồng kết hợp với xây dựng di tuyền từ trình tự vùng gen ITS chủng GA3, chủng GA3 đƣợc định tên Rigidoporus vinctus Chen X cộng (2018) phân lập tuyển chọn chủng nấm có khả kích thích tạo trầm hƣơng phƣơng pháp Agarkit Trong dó, chủng nấm R.vinctuscó khả kích thích tạo trầm hƣơng cho chất lƣợng sản phẩm có chất lƣợng cao [12] 41 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu rút kết luận sau: - Từ mẫu gỗthu thập từ Dó bầu có trầm tỉnh Hà Tĩnh phân lập đƣợc chủng nấm với hình thái sợi nấm, bào tử màu sắc khuẩn lạc khác - Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng nấm cho thấy môi trƣờng thích hợp PDA Sabouround, pH thích hợp từ 6-7 Cả chủng nấm có khả sinh enzym ngoại bào, chủng nấm GA2 có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase enzyme amylase cao với đƣờng kính vịng phân giải lần lƣợt 1,9 cm 1,6 cm Chủng GA3 cho khả sinh tổng hợp enzyme pectinase enzyme protease cao với đƣờng kính vịng phân giải lần lƣợt 1,0 cm 1,75 cm - Dựa đặc điểm hình thái màu sắc hệ sợi nhƣ bào tử chủng nấm quan sát kính hiển vi, định danh sơ chủng GA1 GA2 thuộc chi Trichoderma chủng nấm GA3 thuộc chi Rigidoporus Cả chủng nấm đƣợc định tên phƣơng pháp phân tích trình tự vùng gen ITS Dựa vào kết so sánh ngân hàng GenBank, chủng nấm GA1 đƣợc xác định Trichoderma harzianum, chủng nấm GA2 làTrichoderma asperellumvà chủng nấm GA3 làRigidoporus vinctus Tồn Do thời gian thực nghiên cứu khoa học hạn chế nên chƣa sử dụng chủng nấm phân lập đƣợc để tạo chế phẩm vi sinh kích thích tạo trầm Dó bầu ngồi thực địa Kiến nghị Thời gian nghiên cứu đề tài hạn chế nên số thí nghiệm chƣa đƣợc thực đề tài, chúng tơi xin đƣa số kiến nghị sau: - Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh có khả kích thích tạo trầm hƣơng từ chủng nấm phân lập đƣợc - Đánh giá khả tạo trầm hƣơng chủng nấm đƣợc phân lập 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đỗ Tất Lợi, 1986 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà Xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, trang 435-436 Hoàng Kim Chi (2015), Nghiên cứu xác định đặc điểm sinh học số chủng nấm cộng sinh phân lập từ trầm dó Aquilaria crassna pierre ex lecomte Lê Mai Hƣơng et al (2015), Nghiên cứu xác định đặc điểm sinh học số chủng nấm cộng sinh phân lập từ trầm dó Aquilaria crassna pierre ex lecomte, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(1): 149-156, 2016 Nguyễn Đức Huy (2018), Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất – Tạp chí khoa học cơng nghệ Việt Nam,tr 1597-1599 Nguyễn Khởi Nghĩa (2017), Phân lập tuyên chọn số dịng nấm từ gỗ mục có khả loại màu thuốc nhuộm Đồng sông Cửu Long – Tạp chí Khoa học trƣờng Đại học Cần Thơ, tập 53 tr 87 Nguyễn Ngọc Trúc Ngân, Phạm Thị Ngọc Lan (2014), Tìm hiểu khả phân giải cellulose vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn nhà máy FOCOCEV – Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập số tr16, nhà xuất Đại học khoa học Huế Phạm Minh Tuấn, Phân lập đánh giá khả sinh enzyme cellulase ngooại bào chủng nấm mốc Phạm Thị Huyền cộng (2009), Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải tinh bột Phạm Thị Ngọc Lan, Ngô Thị Bảo Châu, Nguyễn Quỳnh Chi (2017), Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải pectin Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyênsinh vật lần thứ 7: trang 1304–1310 10 Vƣơng Ngọc Chính, 2005, Hương liệu mỹ phẩm, Nhà xuất đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang 17-40 TIẾNG ANH 11 Bhore, S J., Preveena, J., and Kandasamy, K I (2013) Isolation and identification of bacterial endophytes from pharmaceutical agarwood-producing Aquilaria species Pharmacognosy Res 5, 134–137 doi: 10.4103/09748490.110545 12 Chen X, Liu Y, Yang Y, Feng J, Liu P, Sui C, et al (2018) Trunk surface agarwood-inducing technique with Rigidoporus vinctus: An efficient novel method for agarwood production 13 Chen XY, Sui C, Liu YY, Yang Y, Liu PW, Zhang Z, et al Agarwood formation induced by fermentation liquid of Lasiodiplodia theobromae, the dominating fungus in wounded wood of Aquilaria sinensis Curr Microbiol 2017; 74: 460-468 14 Chen, H., Yang, Y., Xue, J., Wei, J., Zhang, Z., and Chen, H.f (2011) Comparison of compositions and antimicrobial activities of essential oils from chemically stimulated agarwood, wild agarwood and healthy Aquilaria sinensis (Lour.) 15 Chen, H.H., Zhao, G.Z., Park, D.J., Zhang, Y.Q.,Xu, L.H., Lee, J.C., Kim, C.J., Li, W.J 2009.Micrococcus endophyticus sp nov., isolated from surface-sterilized Aquilaria sinensis roots Int J.Syst Evol Microbiol 59(Pt 5):1070-5 16 Chhipa H and Kaushik N (2017), Fungal and Bacterial Diversity Isolatedwithin Months after Artificial Infection 17 Chhipa, H., Chowdhary, K., and Kaushik, N (2017) Artificial production of agarwood oil in Aquilaria sp by fungi: a review Phytochem Rev doi: 10.1007/s11101-017-9492-6 18 Hall, T.A 1999 BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucleic Acids Symp Ser 41: 95-98 19 Jayachandran K, Sekar I, Parthiban KT, Amirtham D, Suresh KK (2014) Analysis of different grades of agarwood (Aquilaria malaccensis Lamk.) oil through GCMS Indian J Nat Prod Resour 5: 44-47 20 Lai Kim Kee (2015), Isolation of endophytic fungi from agarwood, Faculty resource of Science and Technology 21 Lawrence,1998.AgarwoodChemistry.http://www.cropwatch.org/agarc hem.htm 22 Mohamed R, Jong PL, Zali MS (2010) Fungal diversity in wounded stems of Aquilaria malaccensis Fungal Divers 43: 67–74 23 Naef R (2011), The volatile and semi-volatile constituents of agarwood, the infected heartwood of Aquilaria species: a review FlavFrag J 26: 73-87 24 Qi Shu Yuan, Aquilaria species: In vitro culture and the Production of Eaglewood (agarwood) In Biotechnology in Agriculture and Forestry 33 (Medicinal and Aromatic Plants VIII), Y.B.S Bajaj, Springer - Verlag Berlin Heidelberg, New York, USA, pp 36-45 25 Rozi Mohamedel at (2017), History and perspectives of induction technology for agarwoodproduction from cultivated Aquilaria in Asia: a review, Northeast Forestry University and Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature 2018 26 Takeatsu Kimura, Ji-Xian Gou, Chung Ki Sung, 1997 International collation of traditional and folk medicine, vol (Northeast asia, part II) World Scientific Publishing Co.Pte Ltd, Bristish, pp 108-109 27 Tamuli, P., Boruah, P., Nath, S C., and Samanta, R (2000) Fungi from diseased agarwood tree (Aquilaria agallocha Roxb.): two new records Adv Forestry Res India 22, 182–187 28 Tian, J J., Gao, X X., Zhang, W M., Wang, L., and Qu, L H.(2013) Molecular identification of endophytic fungi from Aquilaria sinensis and artificial agarwood induced by pinholes-infusion technique Afr J Biotechnol 12, 3115–3131 doi: 10.5897/AJB11.3159 29 Venkataramanan, M N., Borthakur, R., and Singh, H D (1985) Occurrence of endotrophic myccorhizzal fungus in agarwood plant Aquilaria agallocha Roxb Curr Sci 54, 928 30 Wayne V (2013), Isolasi And Caharateristization Of Indophytes Isolat From Akar Gaharu (Department Of Molecular Biotecnology Faculty Of Resource Science And TecnologyUniversity Malasia Serawak, Malaysia) 31 White, T., Bruns, T., Lee, S & Taylor, J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: M Innis, D Gelfand, J Sninsky & T White (Eds.), PCR protocols A guide to methods and applications (pp 315–322) New York: Academic Press 32 Xu WN Evaluation on key technology of fungi infection induced aloes-forming effect and preliminary research on the mechanism of the eaglewood formation M.Sc Thesis, Guangdong Pharmaceutical University 2011 in Chinese 33 Zhang, L., Brockelman, W.Y., Allen, M A 2008.Matrix analysis to evaluate sustainability: the tropical tree Aquilaria crassna, a heavily poached source of agarwood Biological Conservation 141:1676– 1686