Ứng dụng phương pháp phân tích adn góp phần nhận dạng một số loài thực vật tại quần đảo trường sa, việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP&PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN GĨP PHẦN NHẬN DẠNG MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT TẠI QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA, VIỆT NAM Họ tên học viên : Lưu Thị Phương Người hướng dẫn : TS Vũ Đình Duy PGS.TS Bùi Văn Thắng Chuyên ngành Mã số : Công nghệ sinh học : 1753070308 Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Đề tài nghiên cứu “Ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần nhận dạng số loài thực vật Quần đảo Trường Sa, Việt Nam” Đây đề tài nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Vũ Đình Duy PGS TS Bùi Văn Thắng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2021 Người thực Lưu Thị Phương I LỜI CẢM ƠN Đề tài nghiên cứu thực phịng thí nghiệm Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện tạo điều kiện để công việc chuyên môn đề tài tiến hành thuận lợi Khi thực đề tài, nhận động viên giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè đồng nghiệp Sự ủng hộ mặt tinh thần dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô quý báu khiến tơi thực cảm kích, biết ơn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đình Duy PGS.TS Bùi Văn Thắng, người thầy tận tình hướng dẫn tơi q trình hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn góp ý, dẫn, chia sẻ kinh nghiệm cán nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ nhiều q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn cán sở đào tạo trường Đại học Lâm nghiệp tận tâm truyền đạt kiến thức cho tơi suốt khóa học Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô làm việc giảng dạy Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình người thân bên tôi, động lực để vượt qua khó khăn để hồn thành luận văn Luận văn thực thông qua hỗ trợ kinh phí đề tài: “Nghiên cứu đa dạng sinh vật hệ sinh thái cạn quần đảo Trường Sa, đề xuất giải pháp quản lý, bảo tồn khai thác bền vững phục vụ cho nhiệm vụ quân sự, quốc phòng” Mã số: KCB-TS-04 Chủ nhiệm Thượng tá, TS Lê Xuân Đắc Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2021 Người thực Lưu Thị Phương II MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Các phương pháp phân loại học 1.1.1 Phương pháp phân loại học truyền thống 1.1.2 Phương pháp phân loại học đại 1.2 Hệ gen sử dụng nghiên cứu phân loại phân tử thực vật 1.2.1 Vùng đệm mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 1.2.2 Một số vùng gen thuộc hệ gen lục lạp 1.3 Ứng dụng phương pháp phân tích ADN nhận dạng loài thực vật Việt Nam giới 1.3.1 Ngoài nước 1.3.2 Trong nước 11 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.2 Địa điểm thực nghiên cứu 14 III 2.3 Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 2.3.1 Hóa chất 14 2.3.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 2.4 Phương pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm 15 2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 15 2.4.2 Tách chiết ADN tổng số: 15 2.4.3 Định lượng ADN tổng số 16 2.4.4 Trình tự mồi 16 2.4.5 Nhân dịng đoạn gen đích kỹ thuật PCR 16 2.4.6 Phương pháp điện di ADN gel agarose 1.5% 17 2.4.7 Giải trình tự nucleotide 17 2.4.8 Hiệu chỉnh trình tự nucleotide 19 2.4.9 Phân tích mối quan hệ di truyền-xây dựng phát sinh chủng loại 19 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 06 loài thu Trường Sa, Việt Nam 20 3.2 Nhân trình tự ADN đích vùng gen ITS-rDNA 06 loài Trường Sa, Việt Nam 22 3.3 Xác định trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA 06 loài nghiên cứu 22 3.4 Định danh khoa học 06 loài thực vật thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam dựa trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA 27 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 IV DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate HPLC High-Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic IGS Intergenic Spacer vùng liên gen ITS Internal Transcribed Spacer vùng DNA nằm gen kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể NAD(P)H Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng RFLP Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím V DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nguồn gốc, ký hiệu 18 mẫu sử dụng cho nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi dùng nghiên cứu 16 Bảng 3.1 Độ hàm lượng ADN 18 mẫu 06 loài quần đảo Trường Sa 21 VI DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng quát vùng rDNA thực vật Hình 1.2 Hệ gen lục lạp loài Arabidopsis thaliana Hình 2.1 Hình ảnh Hoa Quả 06 loài thực vật quần đảo Trường Sa 13 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 15 Hình 2.3 Hiển thị kết giải trình tự qua phần mềm Chromas pro 2.1.6 19 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số 18 mẫu 06 loài quần đảo Trường Sa gel agarose 1% 20 Hình 3.2 Sản phẩm PCR 06 lồi thực vật phân tích với cặp mồi ITS-rDNA điện di gel agarose 1,5% 22 Hình 3.4 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (PB) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) 28 Hình 3.5 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (BT) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) 29 Hình 3.6 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (BV) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) 30 Hình 3.7 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (NH) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) 31 Hình 3.8 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (MU) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) 32 Hình 3.9 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (TR) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) 33 VII MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mã vạch ADN (DNA barcodes) ADN môi trường (Environmental DNAeDNA) cơng cụ hỗ trợ có hiệu nghiên cứu phân loại, phát loài mới, giám định lồi mẫu có nguồn gốc từ sinh vật sống chết… dựa trình tự ADN để theo dõi đa dạng sinh học khứ (Kress Erickson, 2008; Yang et al., 2011; Thomsen Willerslev, 2015; Gao et al., 2017; Hosein et al., 2017) Sau 20 năm nghiên cứu phát triển, đến nhà khoa học công bố 620.379 cơng trình khoa học tạp chí chun ngành với 60.563.080 trình tự mã vạch ADN, đó: động vật có 26.037.155 trình tự, thực vật có 14.214.896 trình tự, nấm có 2.353.923 trình tự dạng sinh vật khác có 15.195.843 trình tự (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Trong tiến trình phát triển đó, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng sinh học đảo, quần đảo nhiều nhà nghiên cứu quan tâm (Hawlitschek et al., 2013; Li et al., 2018; Liu et al., 2018) Để hiểu rõ q trình tiến hóa loài quần thể đảo, Yi cộng (2016) phân tích liệu gồm: microsatellite (vi vệ tinh) mtDNA mẫu loài ruồi phương đông Bactrocera dorsalis thu từ đảo xa bờ miền Nam Trung Quốc Phân tích liệu microsatellite tỷ lệ gen dị hợp tử quan sát (H0), tỷ lệ gen dị hợp tử kỳ vọng (He), khoảng cách di truyền chuẩn Nei (D), tính tương đồng di truyền (I) tỷ lệ phần trăm locus đa hình (PIC) cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao số quần thể đảo nghiên cứu; phân tích liệu mtDNA vùng gen COI cho thấy, đa dạng nucleotide cao (0,9655) đa dạng haplotype (kiểu gen đơn bội) thấp (0,00680) quần thể đảo; kết làm rõ cấu trúc di truyền quần thể ruồi phương đông Bactrocera dorsalis đảo Gần đây, Li cộng (2018) ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dựng sở liệu mã vạch ADN cho thực vật có hoa từ quần đảo Hồng Sa Kết xây dựng sở liệu mã vạch cho 155 loài thực vật từ quần đảo Hoàng Sa cách sử dụng vùng gen ITS, rbcL matK; liệu lần cung cấp liệu ADN thực vật hệ sinh thái độc đáo khu vực quần đảo Hoàng Sa bổ sung đáng kể cho thư viện mã vạch ADN thực vật có hoa đảo đại dương Cho đến nay, có nhiều ứng dụng phương pháp sinh học phân tử nghiên cứu sinh thái, đa dạng sinh học đảo thu nhiều tư liệu làm sở bảo tồn, phát triển bền vững Nhưng đảo thuộc quần đảo Trường Sa đến cịn nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử làm rõ tính đa dạng, phân bố lồi thực vật đảo cịn chưa thực làm sở cho việc bảo tồn, phát triển, thích nghi chúng khu vực đặc thù Từ lý trên, thực đề tài “Ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần nhận dạng số loài thực vật Quần đảo Trường Sa, Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu Nhận dạng 06 loài thực vật đặc trưng thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam dựa giải mã trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS – rDNA) Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tách chiết ADN tổng số số loài thực vật thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam Nội dung 2: Thực phản ứng PCR số loài thực vật thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam với vùng gen nhân (ITS – rDNA) Nội dung 3: Giải mã trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS – rDNA) số loài thực vật thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam Nội dung 4: Định danh khoa học số loài thực vật thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam dựa trình tự nucleotide vùng gen nhân Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn Kết nghiên cứu góp phần bổ sung sở liệu di truyền cho danh lục loài thực vật Việt Nam, góp phần cho cơng tác bảo tồn nguồn gen, làm sở khoa học cho công tác bảo tồn phát triển bền vững loài quần đảo Trường Sa nói riêng Việt Nam nói chung đồng trình tự đoạn gen ITS – rDNA cao với mẫu nghiên cứu, xây dựng quan hệ di truyền (Hình 3.4) Hình 3.4 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (PB) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Loài Scaevola angulata (AY102731) xem lồi ngồi nhóm (outgroup) Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS – rDNA mẫu PB với trình tự đoạn gen ITS – rDNA loài T argentea (MH768076) cho thấy mức độ tương đồng đạt 100% Mẫu PB nghiên cứu có quan hệ gần với số lồi chi Vòi voi (Tournefortia): T angiospermum (HQ286121), T arborescens (HQ286112), T chenopodiaceum (EF688872), T curassavicum (KY764601), T indicum (MH768074), T paronychioides (KP027100),… Hình 3.4 thể mối quan hệ di truyền gần mẫu PB nghiên cứu với loài Tournefortia argentea ngân hàng gen quốc tế Từ kết kết luận mẫu PB nghiên cứu có tên khoa học Tournefortia argentea sử dụng thị ADN mã vạch đoạn trình tự ITS - rDNA 28 Sử dụng công cụ BLAST NCBI để so sánh trình tự đoạn gen ITS - rDNA mẫu BT với trình tự tương đồng ngân hàng gen cho thấy mẫu BT tương đồng 100% với lồi Bão táp có tên khoa học Scaevola taccada số loài thuộc chi Scaevola Lựa chọn 10 lồi có độ tương đồng trình tự đoạn gen ITS – rDNA cao với mẫu nghiên cứu, chúng tơi xây dựng quan hệ di truyền (Hình 3.5) Hình 3.5 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (BT) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Loài Barringtonia asiatica (AF208700) xem loài nhóm (outgroup) Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS – rDNA mẫu BT với trình tự đoạn gen ITS – rDNA loài Scaevola taccada (MH768165) cho thấy mức độ tương đồng đạt 100% Mẫu BT nghiên cứu có quan hệ gần với số lồi chi Scaevola: Scaevola balansae (AY102732), Scaevola nubigena (AY102763), Scaevola cylindrica (AY102741), Scaevola tahitensis (AY102783), … Hình 3.5 thể mối quan hệ di truyền gần mẫu BT nghiên cứu với loài Scaevola taccada ngân hàng gen quốc tế Từ kết kết luận mẫu BT nghiên 29 cứu có tên khoa học Scaevola taccada sử dụng thị ADN mã vạch đoạn trình tự ITS - rDNA Sử dụng cơng cụ BLAST NCBI để so sánh trình tự đoạn gen ITS - rDNA mẫu BV với trình tự tương đồng ngân hàng gen cho thấy mẫu BV tương đồng 100% với lồi Bàng vng có tên khoa học Barringtonia asiatica số loài thuộc chi Lộc vừng (Scaevola) Lựa chọn 06 lồi có độ tương đồng trình tự đoạn gen ITS – rDNA cao với mẫu nghiên cứu, xây dựng quan hệ di truyền (Hình 3.6) Hình 3.6 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (BV) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Loài Scaevola angulata (AY102731) xem lồi ngồi nhóm (outgroup) Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS – rDNA mẫu BV với trình tự đoạn gen ITS – rDNA loài Barringtonia asiatica (AF208700) cho thấy mức độ tương đồng đạt 100% Mẫu BV nghiên cứu có quan hệ gần với số loài chi Lộc vừng (Barringtonia): Barringtonia fusicarpa (MF171076), Barringtonia macrostachya (MN699336), Barringtonia thailandica (MN699342), Barringtonia schmidtii (MN699338), … Hình 3.6 thể mối 30 quan hệ di truyền gần mẫu BV nghiên cứu với loài Barringtonia asiatica ngân hàng gen quốc tế Từ kết kết luận mẫu BV nghiên cứu có tên khoa học Barringtonia asiatica sử dụng thị ADN mã vạch đoạn trình tự ITS - rDNA Sử dụng cơng cụ BLAST NCBI để so sánh trình tự đoạn gen ITS - rDNA mẫu NH với trình tự tương đồng ngân hàng gen cho thấy mẫu NH tương đồng 100% với lồi Nhàu có tên khoa học Morinda citrifolia số loài thuộc chi Morinda Lựa chọn 10 lồi có độ tương đồng trình tự đoạn gen ITS – rDNA cao với mẫu nghiên cứu, xây dựng quan hệ di truyền (Hình 3.7) Hình 3.7 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (NH) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Loài Scaevola angulata (AY102731) xem lồi ngồi nhóm (outgroup) Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS – rDNA mẫu NH với trình tự đoạn gen ITS – rDNA lồi Morinda citrifolia (MK607923) cho thấy mức độ tương đồng đạt 100% Mẫu NH nghiên cứu có quan hệ gần với số loài chi Morinda: Morinda coreia (FJ907064), Morinda lucida (FJ907073), Morinda 31 latibracteata (FJ907071), Morinda pedunculata (FJ907077), … Hình 3.7 thể mối quan hệ di truyền gần mẫu NH nghiên cứu với loài Morinda citrifolia ngân hàng gen quốc tế Từ kết kết luận mẫu NH nghiên cứu có tên khoa học Morinda citrifolia sử dụng thị ADN mã vạch đoạn trình tự ITS - rDNA Sử dụng công cụ BLAST NCBI để so sánh trình tự đoạn gen ITS - rDNA mẫu MU với trình tự tương đồng ngân hàng gen cho thấy mẫu MU tương đồng 100% với loài Mù u có tên khoa học Calophyllum inophyllum số loài thuộc chi Cồng (Morinda) Lựa chọn lồi có độ tương đồng trình tự đoạn gen ITS – rDNA cao với mẫu nghiên cứu, chúng tơi xây dựng quan hệ di truyền (Hình 3.8) Hình 3.8 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (MU) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Lồi Scaevola angulata (AY102731) xem lồi ngồi nhóm (outgroup) 32 Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS – rDNA mẫu MU với trình tự đoạn gen ITS – rDNA loài Calophyllum inophyllum (MF431619) cho thấy mức độ tương đồng đạt 100% Mẫu MU nghiên cứu có quan hệ gần với số lồi chi Cồng (Morinda): Calophyllum brasiliense (KC484699), Calophyllum membranaceum (KP092913), Calophyllum leleanii (AY625641), Calophyllum soulattri (AY625639), … Hình 3.8 thể mối quan hệ di truyền gần mẫu MU nghiên cứu với loài Morinda citrifolia ngân hàng gen quốc tế Từ kết kết luận mẫu MU nghiên cứu có tên khoa học Calophyllum inophyllum sử dụng thị ADN mã vạch đoạn trình tự ITS - rDNA Sử dụng cơng cụ BLAST NCBI để so sánh trình tự đoạn gen ITS - rDNA mẫu TR với trình tự tương đồng ngân hàng gen cho thấy mẫu MU tương đồng 100% với loài Tra (hay Nho biển) có tên khoa học Coccoloba uvifera số lồi thuộc chi Coccoloba Lựa chọn 12 lồi có độ tương đồng trình tự đoạn gen ITS – rDNA cao với mẫu nghiên cứu, xây dựng quan hệ di truyền (Hình 3.9) Hình 3.9 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu (TR) với loài chi lấy GenBank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Loài Scaevola angulata (AY102731) xem lồi ngồi nhóm (outgroup) 33 Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS – rDNA mẫu TR với trình tự đoạn gen ITS – rDNA loài Coccoloba uvifera (GQ206246) cho thấy mức độ tương đồng đạt 100% Mẫu TR nghiên cứu có quan hệ gần với số lồi chi Coccoloba: Coccoloba swartzii (FJ154469), Coccoloba tenuifolia (HM137437), Coccoloba spicata (HM137436), Coccoloba diversifolia (HM137431), … Hình 3.9 thể mối quan hệ di truyền gần mẫu TR nghiên cứu với loài Coccoloba uvifera ngân hàng gen quốc tế Từ kết kết luận mẫu TR nghiên cứu có tên khoa học Coccoloba uvifera sử dụng thị ADN mã vạch đoạn trình tự ITS - rDNA 34 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - 18 mẫu loài thực vật thu quần đảo Trường Sa, Việt Nam tách chiết ADN tổng số thực thành công phản ứng PCR nhân vùng gen ITS-rDNA - Đã xác định đoạn trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA loài đặc trưng quần đảo Trường Sa, Việt Nam: Phong ba (600bp), Bão táp (660bp), Bàng vuông (612bp), Nhàu (570bp), Mù u (595bp) Tra (589bp) - Phân tích phát sinh chủng loại mẫu nghiên cứu xác định xác tên lồi dựa kết giải mã vùng gen ITS-rDNA Nghiên cứu cung cấp thêm chứng vùng gen ITS-rDNA dấu hiệu hữu ích để xác định lồi 4.2 Kiến nghị - Chúng tơi kiến nghị cần có thêm nghiên cứu sâu sinh học phân tử tìm kiếm vùng gen khác gen lục lạp (matK, rbcL,…) để nhận dạng, định dạng loài - Cần tiến hành nghiên cứu, đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài dựa thị phân tử nhằm bảo tồn, nhân giống phát triển loài tương lai 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trần Hoàng Dũng, Lưu Phương Nam, Huỳnh Vân Hiếu (2014), “ Mã vạch DNA hướng nghiên cứu ứng dụng Việt Nam”, Hội thảo Quốc tế, Hợp tác khoa học cơng nghệ phát triển bền vững nông nghiệp Lâm Đồng - Tây Nguyên 2014 Nong Van Duy, Trieu Le Ngoc, Nguyen Duy Chinh et al (2016), "A new variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular evidence", Phytotaxa, 277 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu cộng (2003), “Tách dịng xác định trình tự gen 18S- rRNA bình vơi”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, l: 203-209 Hà Văn Huân (2014), “Phân lập gen matK từ sến mật (Madhuca pasquierii) làm ADN mã vạch (DNA barcode) phục vụ giám định lồi”, Tạp chi Nơng nghiệp PTNT, số tháng 12 năm 2014 Hoàng Đăng Hiếu (2012), “Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh tập đồn Dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh”, Luận văn Thạc sĩ Di truyền học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học QGHN Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), “ Đánh giá đa dạng di truyền số loài dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật ADN mã vạch”, Luận văn Thạc sĩ Di truyền học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học QGHN Đặng Ngọc Thanh & Trần Đức Lương (2018), "Thực trạng xu hướng phát triển phân loại học sinh vật", Khoa học & Công nghệ Việt Nam Nguyễn Đức Thành (2014), "Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật", Tạp chí Sinh học, 36 Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết sử dụng số chuỗi gen lục lạp nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ Lâm nghiệp”, Tạp chí Công nghệ sinh học, :77-83 10.Nguyễn Thị Phương Trang, Nguyễn Minh Tâm, Phan Kế Long, Phan Ke Lộc (2009), “Góp phần xác định mức độ quan hệ họ hàng Sa mộc trông (Cunninghamict lanceolata Lamb.) Sa mộc dầu (Cunninghamỉa konishii Hayata) Việt Nam băng phương pháp xác định trình tự 18S-rDNA”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 7:85-92 36 Tài liệu Tiếng Anh 11 Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, Wojciechowski MF, Campbell CS, Donoghue MJ 1995 The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny Annals of the Missouri botanical garden, pp 247-277 12 Carew ME, Nichols SJ, Batovska J, St Clair R, Murphy NP, Blacket MJ, & Shackleton ME 2017 A DNA barcode database of Australia’s freshwater macroinvertebrate fauna Marine and Freshwater Research, 68, 1788 13 CBOL Plant Working Group 2009 A DNA barcode for land plants Proc Natl Acad Sci, 106:12794-12797 14 Chase MW, Salamin N, Wilkinson M, Dunwell JM, Kesanakurthi RP, Haider N, Savolainen V 2005 Land plants and DNA barco-des: Short-term and longterm goals Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360(1462):1889-95 15 Chen S, Han J, Liu c, Song J 2010 Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PLoS ONE, 5:e8613 16 Schoch CL, Seifert KA, Sabine Huhndorf, Vincent Robert, Spouge JL, C André Levesq 2012, Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 17 Costion C, Ford A, Cross H, Crayn D, Hawington M, Lowe A 2011 Plant DNA barcodes can accurately estimate species richness in poorly known íoras PLoS One, 6(11): e26841 18 Cuenoud P, Chatrou LW 2002 Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences, American Journalof Botany, 89:132-14 19 DeSalle R., Goldstein P 2019 Review and Interpretation of Trends in DNA Barcodin, Frontiers in Ecology and Evolution 7: 302 20 Gao L M, Li Y, Phan KL, Yan LJ, Thomas P, Möller M, Li DZ 2017 DNA Barcoding of East Asian Amentotaxus (Taxaceae): Potential New Species and Implications for Conservation J Evol & Syst 55: 16-24 21 Gao T, Yao H, Song J Zhu Y 2011 Identification of Fabaceae plants using the DNA barcode matK Planta Medica, 77:92-94 37 22 Hall TA, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/2007/NT, Nucl Acids Symp Ser, 41, 95–98 1999 23 Hammad Ismail Waleed Javed Hashmi., Furrukh Mehmood., Bushra Mirza 2018 Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ + AlCl3 induced rats model, DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 26 24 Hawlitschek O, Nagy ZT, Berger J, Glaw F 2013 Reliable DNA Barcoding Performance Proved for Species and Island Populations of Comoran Squamate Reptiles PLoS ONE, 8(9), e73368 25 Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, Waard JR 2003 Biological identifications through DNA barcodes Proc R Soc Lond B Biol Sci 270: 313– 321 26 Hendrich L, Morinière J, Haszprunar G, Hebert PDN, Hausmann A, Köhler F, Balke M 2014 A comprehensive DNA barcode database for Central European beetles with a focus on Germany: adding more than 3500 identified species to BOLD Molecular Ecology Resources, 15, 795–818 27 Hosein FN, Austin N, Maharaj S, Johnson W, Rostant L, Ramdass AC, & Rampersad SN 2017 Utility of DNA barcoding to identify rare endemic vascular plant species in Trinidad Ecology and Evolution, 7: 7311–7333 28 Hosein FN, Austin N, Maharaj S, Johnson W, Rostant L, Ramdass AC, & Rampersad SN 2017 Utility of DNA barcoding to identify rare endemic vascular plant species in Trinidad Ecology and Evolution, 7(18), 7311–7333 29 Ghosh JS, Bhattacharya S, and Amita Pal 2017 Molecular phylogeny of 21 tropical bamboo species reconstructed by integrating non-coding internal transcribed spacer (ITS1 and 2) sequences and their consensus secondary structure, Genetica, 145, pp.319-333 30 Jun Wen J, Gregory M, Plunkett, Anthony D, Mitchell & Wagstaff SJ 2001 The evolution of Araliaceae: a phylogenetic analysis based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA, Systematic Botany, 26 31 Kress JW, Erickson DL (2008) DNA barcodes: genes, genomics, and bioinformatics Proc Natl Acad Sci USA, 105(8):2761-2762 32 Kress JW, Erickson DL 2008 DNA barcodes: genes, genomics, and bioinformatics Proc Natl Acad Sci USA 105: 2761-2762 38 33 Kress JW, Rickson DL 2007 A two-locus global DNA barcode for land plants: The coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region PLoSONE; 34 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH 2005, Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci U.S.A 102: 8369–8374 35 Kollipara KP, Singh RJ, and Theodore Hymowitz 1997 Phylogenetic and genomic relationships in the genus Glycine Willd based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA, Genome, 40, pp.57-68 36 Kumar S, Stecher G and Tamura K, MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets, Molecular Biology and Evolution, 33(7), 1870–1874 (2016) 37 Laila Jafri, Samreen Saleem, Ihsan-ul-Haq, Nazif Ullah & Bushra Mirza 2017 In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K Koch", Arabian Journal of Chemistry, 10 38 Laopichienpong N, Muangmai N, Supikamolseni A, Twilprawat P, Chanhome , Suntrarachun , Srikulnath K 2016 Assessment of snake DNA barcodes based on mitochondrial COI and Cytb genes revealed multiple putative cryptic species in Thailand Gene, 594(2), 238–247 39 Li AY, Zhang XY 2002 Physical Localization of the 18S-5·8S-26S rDNA and Sequence Analysis of ITS Regions in Thinopyrum ponticum (Poaceae: Triticeae): Implications for Concerted Evolution Annals of Botany 90: 445–452 40 Li Rong and Jun Wen 2013 Phylogeny and biogeography of Dendropanax (Araliaceae), an amphi-Pacific disjunct genus between tropical/subtropical Asia and the Neotropics, Systematic Botany, 38(2) 41 Li Rong and Jun Wen 2016 Phylogeny and diversification of Chinese Araliaceae based on nuclear and plastid DNA sequence data, Journal of Systematics and Evolution, 54 42 Li SC, Qian X, Zheng ZX, Shi MM, Chang XY, Li XJ, Liu JF, Tu T, Zhang DX 2018 DNA barcoding the flowering plants from the tropical coral islands of Xisha (China), Ecology and Evolution, 8: 10587-10593 39 43 Li S, Qian X, Zheng Z, Shi M, Chang X, Li X, Liu , Tu T, Zhang D 2018 DNA barcoding the flowering plants from the tropical coral islands of Xisha (China) Ecology and Evolution: 21(8): 10587-10593 44 Liu L, Guo Z, Zhong C, Shi S 2018 DNA barcoding reveals insect diversity in the mangrove ecosystems of the Hainan Island, China Genome doi:10.1139/gen-2018-0062 45 Luo A, Zhang A, Ho SYW, Xu W, Zhang Y, Shi W, Cameron SL, Zhu C 2011 Potential effcacy of mitochondrial genes for animal DNA barcoding: A case study using eutherian mammals BMC Genomìcs, 12: 84 46 Péter Poczai and Jaakko Hyvönen 2010 Nuclear ribosomal spacer regions in plant phylogenetics: problems and prospects, Molecular biology reports, 37 47 Rivers AR, Weber KC, Gardner TG, Liu S, Armstrong SD 2018 ITSxpress: software to rapidly trim internally transcribed spacer sequences with quality scores for marker gene analysis, F1000Research: 7: 1418 48 Sun Y, Skinner DZ, Liang GH, & Hulbert SH 1994 Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA, Theoretical and applied genetics, 89 49 Bruns TD, White TJ, and Taylor JW 1991 Fungal molecular systematics, Annual Review of Ecology and systematics, 22, pp 525-564 50 Thomsen PF, Willerslev E 2015 Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity Biological Conservation, 183: 4-18 51 Eriksson T, Hibbs MS, Yoder AD, Dewiche CF & Donoghue MJ 2003 The phylogeny of Rosoideae (Rosaceae) based on sequences of the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA and the trnL/F region of chloroplast DNA, International Journal of Plant Sciences, 164, pp.197-211 52 Wong TH, But GWC, Wu HY, Tsang SSK, Lau DTW, Shaw PC 2018 Medicinal Materials DNA Barcode Database (MMDBD) version 1.5—onestop solution for storage, BLAST, alignment and primer design Database 53 Yang JB, Wang YP, Moller M, Gao LM, Wu D 2011 Applying plant DNA barcodes to identify species of Parnassia (Parnassiaceae) Molecular Ecology Resources, 12(2), 267–275 40 54 Yang JB, Wang YP, Moller M, Gao LM, Wu D 2011 Applying plant DNA barcodes to identify species of Parnassia (Parnassiaceae) Molecular Ecology Resources 12: 267–275 55 Yang Ziheng 2007 PAML 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood, Molecular biology and evolution, 24 56 Yao H, Song J, Liu C, Luo K, Han JP, Hansson B 2010 Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals PLoS ONE 5: e13102.Chromas Pro1.2.1.6 (Technelysium Pty Ltd, Helensvale, Queensland, Australia) 57 Yi C, Zheng C, Zeng L, Xu Y 2016 High genetic diversity in the offshore island populations of the tephritid fruit fly Bactrocera dorsalis, BMC Ecol., 16: 1-12 Tài liệu Internet 58 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 59 http://www.barcodeoflife.org 41 42