Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn baccillus subtilis dk8, dk15 phân lập từ đất

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP  BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NĂM HỌC 2020 - 2021 Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS DK8, DK15 PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Sinh viên thực hiện: Phan Anh Tuấn Lớp: K60-CNSH Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Thu Hằng ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc đề tài tốt nghiệp này, với biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình em q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô môn Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo TS Nguyễn Thị Thu Hằng ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến q báu để em hồn thành đề tài Đồng thời, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Thơng qua q trình thực đề tài, em học đƣợc nhiều điều rút đƣợc nhiều học kinh nghiệm quý báu Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình thực đề tài khơng tránh khỏi sai sót, em kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Phan Anh Tuấn i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC ii DANH MỤC KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1 Phân loại phân bố 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm sinh trƣởng 1.1.5 Đặc điểm nuôi cấy 1.2 Cơ sở khoa học việc sử dụng Bacillus subtilis sản xuất chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn hữu ích 1.2.1 Khả sinh bào tử 1.2.2 Khả sinh enzyme phân hủy chất hữu 1.2.3 Khả đối kháng 1.2.4 Khả chịu đƣợc nồng độ muối cao, chịu acid, chịu kiềm 1.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ii 1.3.1 Trong nƣớc 1.3.2 Nƣớc 10 PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 11 2.1.1 Mục tiêu chung 11 2.2.2 Mục tiêu cụ thể 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.3 Vật liệu nghiên cứu 12 2.3.1 Chủng vi sinh vật 12 2.3.2 Hóa chất 12 2.3.3 Thiết bị 12 2.3.4 Môi trƣờng nghiên cứu 12 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Xác định hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 13 2.4.2 Xác định hình dạng tế bào vi khuẩn phƣơng pháp nhuộm Gram 13 2.4.3 Xác định khả sinh nội bào tử 14 2.4.4 Xác định khả sinh catalase 15 2.4.5 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào vi khuẩn 15 2.4.6 Xác định khả chịu NaCl 17 2.4.7 Xác định khả chịu nhiệt 17 2.4.8 Xác định khả cố định nitơ 18 2.4.9 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 19 iii 2.5 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 19 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý 20 3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào 22 3.3 Xác định khả khả chịu mặn (NaCl) 23 3.4 Xác định khả chịu nhiệt 25 3.5 Xác định khả sinh trƣởng môi trƣờng không chứa nitơ 27 3.6 Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 Kết luận 30 Tồn 30 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 iv DANH MỤC KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ CMC Carboxymethyl cellulose LB Lysogeny Broth IAA Indole-3-Acetic Acid VK Vi khuẩn v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Công thức môi trƣờng LB 13 Bảng 2.2 Công thức mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme 13 Bảng 3.1: Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 20 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme ngoại bào Bacillus subtilis DK8 DK15 22 Bảng 3.3: Khả chịu nhiệt chủng DK8 DK15 25 Bảng 3.4: Hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 28 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis DK8 (A) DK15 (B) 21 Hình 3.2: Hình dạng tế bào Bacillus subtilis DK8 (A) DK15 (B) 21 Hình 3.3: Hoạt tính Catalase Bacillus subtilis DK8 (A) DK15 (B) 21 Hình 3.4: Hoạt tính amylase Bacillus subtilis DK8 DK15 22 Hình 3.5: Hoạt tính cellulase chủng Bacillus subtilis DK8 23 Hình 3.6: Hoạt tính protease Bacillus subtilis DK8 DK15 23 Hình 3.7: Khảo sát khả chịu NaCl Bacillus subtilis DK8 DK15 24 Hình 3.8: Khảo sát khả chịu nhiệt chủng DK8 26 Hình 3.9: Khảo sát khả chịu nhiệt chủng DK15 26 Hình 3.10: Khảo sát khả cố định nitơ B subtilis DK8 DK15 27 Hình 3.11: Hoạt tính kháng B cereus B subtilis DK8 DK15 29 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Bacillus vi sinh vật đƣợc phát mô tả giai đoạn đầu tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học cuối kỷ 19 Bacillus chi lớn với gần 200 lồi vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả sinh nội bào tử để chống chịu điều kiện bất thƣờng môi trƣờng sống Bacillus phân bố rộng rãi hệ sinh thái tự nhiên: từ cạn đến dƣới nƣớc, từ nƣớc đến nƣớc mặn từ vùng ven bờ đến đáy Đại Dƣơng Các loài Bacillus đƣợc nghiên cứu toàn diện Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans Bacillus licheniformis Trong số loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc quan tâm có tiềm sản xuất sản phẩm thƣơng mại ứng dụng y học, nông nghiệp công nghiệp thực phẩm Hiện nay, Bacillus subtilis đƣợc biết đến nhƣ nguồn nguyên liệu Công nghệ sinh học, đƣợc sử dụng bổ sung vào chế phẩm sinh học lợi khuẩn, làm phân bón hữu sinh học, tạo chế phẩm xử lý ô nhiễm môi trƣờng… Tùy thuộc vào đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, nhà khoa học có định hƣớng ứng dụng lồi vi khuẩn hữu ích việc sản xuất chế phẩm vi sinh Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh-Hóa sinh phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ký hiệu DK8 DK15 Tuy nhiên, đặc điểm sinh học hai chủng vi khuẩn chƣa đƣợc xác định Với mục tiêu xác định số đặc điểm sinh học, ni cấy đặc tính sinh hóa hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15, sở đánh giá đƣợc tiềm ứng dụng hai chủng vi khuẩn quan tâm định hƣớng sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus subtilis DK8, DK15 phân lập từ đất” đƣợc thực PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1 Phân loại phân bố Theo khóa phân loại Bergey, chi Bacillus chi lớn đa dạng, đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae với chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum Các vi khuẩn đặc trƣng họ Bacillaceae hình thành nội bào tử [1, 16] Nhờ khả sinh bào tử nên Bacillus tồn thời gian dài dƣới điều kiện khác Chúng phổ biến tự nhiên nên phân lập từ nhiều nguồn khác nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, chủ yếu đất, nơi mà đóng vai trị quan trọng chu kỳ carbon nitơ [2] Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện Bacillus subtilis phân bố hầu hết môi trƣờng tự nhiên, phần lớn cƣ trú đất rơm rạ, cỏ khô nên đƣợc gọi ―trực khuẩn cỏ khô‖ Mật độ Bacillus subtilis đất trồng trọt thông thƣờng khoảng 106 – 107 CFU/g, diện đất nghèo dinh dƣỡng vùng sa mạc, đất hoang Ngoài ra, 2.4.9 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Khảo sát khả kháng khuẩn vi khuẩn Bacillus subtilis số vi khuẩn gây bệnh nhƣ: E.coli, Salmonella, Bacillus cereus, Shighella phƣơng cấy chấm điểm vi khuẩn quan tâm lên môi trƣờng cấy trải vi khuẩn kiểm định Cách tiến hành: - Cấy chủng vi sinh vật kiểm định đựng ống giống vào mơi trƣờng dịch thể bình tam giác có thành phần pepton 10 g/l + yeast extract g/l + NaCl g/l Ni cấy bình chứa vi khuẩn kiểm định nhiệt độ 30ºC 24 giờ, chế độ lắc 150 vòng/phút - Thu sinh khối vi khuẩn kiểm định xác định mật độ tế bào phƣơng pháp pha loãng cấy trải chủng vi sinh vật kiểm định môi trƣờng dinh dƣỡng agar, sau đếm số lƣợng khuẩn lạc để xác định mật độ tê bào Pha loãng chủng vi khuẩn kiểm định đến mật độ 105 -106 CFU/ml - Cấy trải chủng vi khuẩn kiểm định lên môi trƣờng LB agar - Cấy chấm điểm vi khuẩn Bacillus lên môi trƣờng cấy vi khuẩn kiểm định - Đặt đĩa thí nghiệm vào tủ ni vi sinh vật 30ºC 48h - Xác định hoạt tính đối kháng cách đo đƣờng kính ức chế vi khuẩn kiểm định xung quanh vi khuẩn Bacillus Hoạt tính đối kháng đƣợc tính theo cơng thức: D/d Trong đó: D – đƣờng kính vịng đối kháng khơng chứa vi sinh vật kiểm định;, d – đƣờng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus 2.5 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu - Thu thập số liệu từ tài liệu từ thực nghiệm: quan sát, theo dõi, đo đạc qua thí nghiệm - Sử dụng nhật ký ghi chép - Thống kê số liệu, so sánh 19 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý Hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DK8, DK15 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB agar 37°C Sau 24 quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc; làm tiêu nhuộm gram để quan sát hình dạng tế bào; xác định khả sinh enzyme catalase khả sinh bào tử Kết nhận đƣợc trình bày Bảng 3.1 Hình 3.1, 3.2, 3.3 Bảng 3.1: Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Ký hiệu Hình thái khuẩn Hình thái Tính chất lạc tế bào Gram VK Trắng đục, khuẩn DK8 lạc tròn, bề mặt trơn, nhầy Trắng sữa, Trực khuẩn ngắn Khả sinh catalase Sinh nội bào tử + + + + + + bề mặt nhăn, khuẩn DK15 lạc tròn có Trực khuẩn thể mọc lan phủ ngắn kín bề mặt môi trƣờng Kết nhận đƣợc cho thấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 trực khuẩn ngắn, tồn dạng đơn lẻ tế bào xếp cạnh nhau; vi khuẩn Gram dƣơng, dƣơng tính với catalase sinh nội bào tử 20 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis DK8 (A) DK15 (B) Hình 3.2: Hình dạng tế bào Bacillus subtilis DK8 (A) DK15 (B) Hình 3.3: Hoạt tính Catalase Bacillus subtilis DK8 (A) DK15 (B) 21 3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào Enzyme ngoại bào enzyme đƣợc vi sinh vật sinh tổng hợp sau tiết ngồi tế bào tham gia trình thủy phân chất hữu bên ngồi mơi trƣờng xung quanh Các hợp chất làm nguồn dinh dƣỡng vi sinh vật lấy từ mơi trƣờng bên ngồi khơng thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có enzyme để xúc tác phản ứng dị hóa hợp chất cao phân tử thành hợp chất có hợp chất có phân tử lƣợng thấp qua màng tế bào Kết đƣợc khảo sát hoạt tính enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 phƣơng pháp cấy chấm điểm vi khuẩn chứa chất (1%) loại enzyme sau 48h ni cấy trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme ngoại bào Bacillus subtilis DK8 DK15 Hoạt tính enzyme phân giải chất Kí hiệu chủng vi khuẩn (D/d) Amylase Cellulase Protease DK8 1,6 2,7 3,9 DK15 2,0 0,1 1,7 Hình 3.4: Hoạt tính amylase Bacillus subtilis DK8 DK15 22 Hình 3.5: Hoạt tính cellulase chủng Bacillus subtilis DK8 Hình 3.6: Hoạt tính protease Bacillus subtilis DK8 DK15 Một số hình ảnh thu nhận đƣợc trình nghiên cứu trình bày Hình 3.4, 3.5 3.6 23 Vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 có hoạt tính loại enzyme amylase, cellulase protease mức cao cao, thể khả phân giải 1% chất qua trị số D/d lần lƣợt 1,6; 2,7 3,9 Trong đó, vi khuẩn Bacillus subtilis DK15 thể hoạt tính amylase protease mức (tƣơng ứng với trị số D/d 2,0 1,7) hoạt tính cellulase yếu (D/d 0,1) 3.3 Xác định khả khả chịu mặn (NaCl) Hầu hết chủng Bacillus ƣa mặn, nhƣng chủng Bacillus lại có ngƣỡng chịu NaCl mức độ khác Mục đích thí nghiệm nhằm xác nồng độ NaCl thích hợp cho sinh trƣởng quần thể vi khuẩn kiểm tra tiềm ứng dụng hai chủng vi khuẩn có thích hợp với việc tạo chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho vùng đất, nƣớc nhiễm mặn hay khơng? Thí nghiệm nghiên cứu khả chịu mặn vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 đƣợc bố trí theo phƣơng pháp ni chủng vi khuẩn môi trƣờng bổ sung NaCl với nồng độ khác nhau, điều kiện nuôi cấy 37ºC, lắc 180 vịng/phút Sau 48h ni cấy, thu nhận canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn để đo mật độ tế bào bƣớc sóng 600nm Kết nhận đƣợc trình bày Hình 3.7 Hình 3.7: Khảo sát khả chịu NaCl Bacillus subtilis DK8 DK15 24 Cả hai chủng Bacillus subtilis sinh trƣởng tốt môi trƣờng bổ sung 1% NaCl (OD600nm chủng DK8 DK15 tƣơng ứng 1,585 1,31) Khi bổ sung NaCl với nồng độ NaCl tăng lên 2,5%, kết chủng DK8 sinh trƣởng tốt (OD600nm 1,401), nhiên lƣợng sinh khối tạo thành chủng DK15 lại giảm mạnh (OD600nm 0,833) Tiếp tục tăng lƣợng NaCl bổ sung vào môi trƣờng đến 5%, 7,5% 10%, sinh khối vi khuẩn hai chủng giảm Kết nhận đƣợc khẳng định: Trong chủng vi khuẩn, chủng Bacillus subtilis DK8 chịu mặn tốt chủng Bacillus subtilis DK15 sinh trƣởng tốt mơi trƣờng có nồng độ muối 2,5%, chủng Bacillus subtilis DK15 bị ức chế sinh trƣởng nồng độ muối này; môi trƣờng ni cấy có nồng độ NaCl thích hợp cho nhân sinh khối hai chủng vi khuẩn 1% (w/v) 3.4 Xác định khả chịu nhiệt Tiến hành khảo sát khả chịu nhiệt Bacillus subtilis DK8 DK15 nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật ƣa nhiệt phát triển (40ºC, 50ºC, 60ºC), kết thu đƣợc trình bày Bảng 3.3 Hình 3.8, Hình 3.9 Bảng 3.3: Khả chịu nhiệt chủng DK8 DK15 STT Chủng Bacillus Khả sinh trƣởng vi khuẩn nhiệt độ khác 40℃ 50℃ 60℃ DK8 ++++++ +++ + DK15 ++++++ +++ - Ghi chú: ++++++: Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh, tạo nhiểu sinh khối +++: Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng trung bình +: Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng yếu -: Vi khuẩn không sinh trưởng, phát triển 25 Khi nuôi cấy 40ºC, hai chủng DK8 DK15 sinh trƣởng mạnh, tạo nhiều sinh khối tạo thành lớp dầy bề mặt môi trƣờng, chứng tỏ nhiệt độ 40ºC thích hợp cho ni cấy hai chủng vi khuẩn Các đĩa vi khuẩn DK8 DK15 nuôi cấy 50ºC cho kết lƣợng sinh khối hai chủng vi khuẩn tạo đƣợc , nhƣng hai chủng vi khuẩn có khả chống chịu sinh sản với tốc độ trung bình nhiệt độ 50ºC Nhiệt độ ni cấy 60ºC ức chế hoàn toàn sinh trƣởng chủng Bacillus subtilis DK15, ức chế mạnh sinh trƣởng chủng Bacillus subtilis DK8 khiến cho chủng sinh trƣởng với tốc độ yếu, tạo sinh khối vi khuẩn bề mặt mơi trƣờng Hình 3.8: Khảo sát khả chịu nhiệt chủng DK8 Hình 3.9: Khảo sát khả chịu nhiệt chủng DK15 26 3.5 Xác định khả sinh trƣởng môi trƣờng không chứa nitơ Một số đặc điểm sinh học bật vi khuẩn thuộc chi Bacillus nhiều loài Bacillus có khả sinh Nitrogenase để cố định nitơ khơng khí [12] Do vậy, vi khuẩn Bacillus thƣờng đƣợc ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh để tăng cƣờng hiệu cố định nitơ, phân giải chất hữu cơ, phân giải lân… để kích thích sinh trƣởng thực vật Tiến hành cấy ria vi khuẩn môi trƣờng Winograskyi I cải tiến thành phần không chứa nitơ Kết nhận đƣợc trình bày Hình 3.10 cho thấy: Mặc dù đƣợc cấy chuyển môi trƣờng thiếu vắng nguyên tố dinh dƣỡng đa lƣợng nitơ, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 có khả sinh trƣởng, tạo sinh khối tế bào bề mặt môi trƣờng Trong số hai chủng vi khuẩn, chủng DK8 sinh trƣởng tạo nhiều sinh khối chủng DK15 môi trƣờng Winograskyi I cải tiến không chứa nitơ Kết nhận đƣợc chứng minh hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 có khả sản sinh nitrogenase để cố định N2 khơng khí thành nguồn nitơ dạng NH3 để tiến hành sinh tổng hợp amino axit tế bào sinh trƣởng Hình 3.10: Khảo sát khả cố định nitơ Bacillus subtilis DK8 DK15 27 Hai chủng Bacillus subtilis DK8 DK15 có khả cố định nitơ, kết hợp với số đặc tính khác nhƣ: Có khả sản sinh enzyme ngoại bào nhƣ amylase, cellulase; có khả chịu nhiệt, chịu NaCl, nhận định vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 có tiềm ứng dụng lĩnh vực sản xuất phân bón vi sinh Bên cạnh đó, so sánh hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn chủng Bacillus subtilis DK8 đáng ý chủng DK15 chủng DK8 sinh loại enzyme ngoại bào amylase, cellulase, protease với hoạt tính mạnh, có khả cố định nitơ khả chịu nhiệt tốt 3.6 Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định Hoạt tính đối kháng với số vi khuẩn gây bệnh (Shigella, E coli, Bacillus cereus Samonella) hai chủng Bacillus subtilis DK8 DK15 thể Bảng 3.4 Hình 3.11 Bảng 3.4: Hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 Hoạt tính kháng khuẩn chủng STT Bacillus subtilis Vi khuẩn kiểm (D/d) định DK8 DK15 Shigella 0,2 0,5 E coli 0,9 0,4 B cereus 0,7 Samonella 1,1 4,5 Vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 có khả sinh kháng sinh ức chế sinh trƣởng loài vi khuẩn gây bệnh Shigella, E coli, B cereus Samonella với hoạt tính đối kháng (D/d) 0,2 – 1,1 28 Vi khuẩn Bacillus subtilis DK15 ức chế sinh trƣởng loài vi khuẩn bệnh Shigella, E coli Samonella (hoạt tính đối kháng D/d 0,4 – 4,5), nhiên, chất ức chế chủng DK15 tiết môi trƣờng lại không ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn B cereus Hình 3.11: Hoạt tính kháng B cereus B subtilis DK8 DK15 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã xác định đặc điểm sinh học chủng B subtilis DK8: + Là trực khuẩn ngắn, Gram +, sinh nội bào tử, dƣơng tính với catalase + Hoạt tính amylase, cellulase protease (D/d) lần lƣợt 1,6; 2,7 3,9 + Có khả chịu NaCl: Sinh trƣởng tốt (OD600nm = 1,401 – 1,585) nuôi cấy môi trƣờng có nồng độ NaCl 1,0 – 2,5% (w/v) + Có khả chịu nhiệt: Sinh trƣởng mơi trƣờng nhiệt độ 40ºC - 50ºC + Sinh trƣởng tốt mơi trƣờng khơng chứa nitơ + Có hoạt tính đối kháng Shigella, E coli, B cereus Samonella: D/d 0,2 – 1,1 - Đã xác định đặc điểm sinh học chủng B subtilis DK15: + Là trực khuẩn ngắn, Gram +, sinh nội bào tử, dƣơng tính với catalase + Có hoạt tính amylase protease ngoại bào cao (D/d tƣơng ứng 2,0 1,7); hoạt tính cellulase yếu (D/d 0,1) + Khả chịu NaCl kém: Chỉ sinh trƣởng tốt nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaCl 1% (w/v) + Có khả chịu nhiệt: Sinh trƣởng môi trƣờng nhiệt độ 40ºC - 50ºC + Sinh trƣởng yếu môi trƣờng khơng chứa nitơ + Có khả đối kháng Shigella, E coli Samonella (hoạt tính đối kháng D/d 0,4 – 4,5); không kháng vi khuẩn B cereus Tồn Chƣa xác định đƣợc số đặc điểm sinh học khác hai chủng vi khuẩn, ví dụ khả đồng hóa loại đƣờng, khả phân giải lân… Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu thêm đặc điểm sinh học khác vi khuẩn Bacillus subtilis DK8 DK15 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Đức Duy Anh (2005) Phân lập khảo sát số đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Cao Ngọc Điệp, Phan Văn Tùng (2010) Vi khuẩn nội sinh thực vật NXB Đại học Cần Thơ, Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng (1972) Một số phƣơng pháp nghiên cứu VSV học NXB Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đồn, Võ Nhân Hậu, Ngơ Xn Dũng (2008) Chọn lựa điều kiện nuôi cấy tối ƣu vi khuẩn Bacillus licheniformis (chủng BCRP) để sinh tổng hợp - amylase chịu nhiệt Tạp chí Khoa học phát triển 4(5), 460-466 Nguyễn Quỳnh Nam (2006) Phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis phân heo thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy heo Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm TP HCM Đỗ Thị Thu Nga (2011) Khảo sát khả sinh tổng hợp protease số chủng Bacillus Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh Bùi Thị Phi (2007) Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học tìm hiểu khả sinh enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Phúc Phan Thị Phƣơng Trang (2017) Phân lập định danh xác định đặc tính có lợi chủng Bacillus spp từ ao ni tơm tỉnh Bến Tre Tạp chí khoa học Trường Đại học Nam Cần Thơ 31 Trịnh Thành Trung, Phan Lạc Dũng, Trần Thị Lệ Quyên, Dƣơng Văn Hợp, Đào Thị Lƣơng (2013) Đặc điểm sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1901 phân lập Rừng Quốc gia Hồng Liên Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 29(3), 59-70 Tài liệu tiếng Anh 10 Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein Analytical biochemistry, 72(1) 11 Datta N, Banik SA and Gupta NK (1982), "Studies on the efficiency of phytohormone producing phosphate solubilizing Bacillus firmus in augmenting paddy yield in acid soils of Nagaland (India)", Plant Soil 12 Garrity GM, Bell JA Taxonomic Outline of the Prokaryotes, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, Release 5.0 SpringerVerlag, New York 13 Kubo Y, Rooney AP, Tsukakoshi Y, Nakagawa R, Hasegawa H, Kimura K (2011) Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to natto (fermented soybean) production Appl Environ Microbiol 77, 64636469 14 Li-Jung Yin HHL and Zheng RX (2010) Purification and characterization of a cellulase from Bacillus subtilis YJ1 Journal of Marine Science and Technology 18(3), 466-471 15 Meena B, Radhajeyalakshmi, Vidhyasekaran P and Velazahan R (1999) Foliar application of Pseudomonas fluorescens on activi phenylalanine ammonia lyase, chitinase and beta glucanase and accumulation of phenolics in rice Actaphytopathol Entomol Hunga 16 Rooney AP, Price NP, Ehrhardt C, Swezey JL, Bannan JD (2009) Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species 32 complex and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov Int J Syst Evol Microbiol 59, 2429-2436 17 Saowapar K, Yupa Pootaeng (2014) Screening and identif producing bacteria isolated from oil palm meal Journal of Applied Pharmaceutical Science 18 Sundara B, Natarajan VH, Hari K (2002) Influence of phosphorus solubilizing bacteria on the changes in soil available phosphorus and sugarcane and sugar yields Field Crops Research 77(1), 43-49 19 Usta C (2013) Microorganisms in Biological Pest Control — A Review (Bacterial Toxin Application and Effect of Environmental Factors) Open access peer-reviewed chapter 33