Nghiên cứu phân lập và đánh giá các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh ở thực vật

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM GÂY BỆNH Ở THỰC VẬT” HÀ NỘI – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM GÂY BỆNH Ở THỰC VẬT” Người thực : Trần Thị Bảo Yến Lớp : K64CNSHB Mã số sinh viên : 640836 Người hướng dẫn : TS Đặng Thị Thanh Tâm Bộ môn : Công nghệ sinh học thực vật HÀ NỘI – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết báo cáo đề cập hồn tồn trung thực chưa sử dụng cơng bố khóa luận, luận án cơng trình nghiên cứu khoa học trước Tôi xin cam đoan thơng tin trích dẫn sử dụng khóa luận ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày … tháng 02 năm 2023 Sinh viên Trần Thị Bảo Yến i LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành báo cáo này, nỗ lực cố gắng thân, nhận nhiều giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn TS Đặng Thị Thanh Tâm ̶ Giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam ̶ người trực tiếp hướng dẫn truyền đạt nhiều kiến thức quý giá suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, tạo điều kiện sở vật chất thiết bị giúp tơi hồn thành tốt đề tài giao Đồng thời, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức quý giá cho suốt thời gian học tập học viện Cuối tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè hết lịng giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập hồn thành báo cáo Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng 02 năm 2023 Sinh viên Trần Thị Bảo Yến ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi TÓM TẮT vii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm gây bệnh 2.1.1 Giới thiệu loài vi khuẩn có khả đối kháng với nấm gây bệnh 2.1.2 Khả ứng dụng số chủng vi khuẩn có khả ức chế nấm gây bệnh, hại kích thích sinh trưởng trồng 2.2 Nấm gây bệnh 2.2.1 Nấm Alternaria alternata 2.2.2 Nấm Fusarium oxysporum 2.2.3 Nấm Fusarium solani 10 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 3.1 Vật liệu 12 3.1.1 Môi trường nuôi cấy 12 3.1.2 Các chủng nấm gây bệnh thực vật 12 3.1.3 Mẫu đất 14 3.1.4 Dụng cụ, hóa chất 15 3.2 Địa điểm nghiên cứu 15 iii 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Phương pháp phân lập 15 3.3.2 Phương pháp nuôi cấy nấm 16 3.3.3 Phương pháp nhuộm Gram 16 3.3.4 Phương pháp thử hoạt tính catalase 17 3.3.5 Phương pháp khảo sát khả tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) 18 3.3.6 Phương pháp sàng lọc chủng vi khuẩn tiềm có hoạt tính đối kháng với nấm gây bệnh 20 3.3.7 Trồng dâu tây 21 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả kháng nấm 23 4.2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc chủng vi khuẩn tiềm có hoạt tính đối kháng với nấm bệnh Alternaria alternata 24 4.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá đặc điểm hóa sinh 15 chủng vi khuẩn tiềm 27 4.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata chủng vi khuẩn tiềm 30 4.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn tiềm 32 4.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium solani chủng vi khuẩn tiềm 34 4.7 Thí nghiệm 7: Đánh giá ảnh hưởng chủng TV1.1, TV2.5, TV2.12 đến sinh trưởng dâu tây 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Các chủng vi khuẩn có khả kháng nấm 23 Bảng 4.2 Tóm tắt chủng vi khuẩn có khả kháng nấm qua sàng lọc 25 Bảng 4.3 Đặc điểm sinh hóa 15 chủng vi khuẩn tiềm 27 Bảng 4.4 Sự sản sinh IAA 15 chủng tiềm 28 Bảng 4.5 Hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata chủng vi khuẩn tiềm (3-5-7 ngày) 31 Bảng 4.6 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn tiềm (3-5-7 ngày) 33 Bảng 4.7 Hoạt tính kháng nấm Fusarium solani chủng vi khuẩn tiềm (3-5-7 ngày) 35 Bảng 4.8 Khả ức chế hàm lượng sản sinh IAA 15 chủng tiềm 37 Bảng 4.9 Đặc điểm phát triển dâu tây 39 v DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Nấm Alternaria alternata 13 Hình 3.2 Nấm Fusarium oxysporum 13 Hình 3.3 Nấm Fusarium solani 14 Hình 3.4 mẫu đất 14 Hình 3.5 Phương pháp pha loãng cấy mẫu đất 16 Hình 3.6 Các bước tiến hành nhuộm Gram 17 Hình 3.7 Thử nghiệm catalase 18 Hình 3.8 Đồ thị đường chuẩn 20 Hình 3.9 Hình ảnh bố trí thí nghiệm 21 Hình 4.1 Một số đĩa xuất chủng có khả kháng bệnh 24 Hình 4.2 Hình thiết kế thí nghiệm 24 Hình 4.3 15 chủng phân lập có khả kháng nấm Alternaria alternata sau ngày nuôi cấy 26 Hình 4.4 Kết nhuộm Gram 15 chủng soi qua kính hiển vi 29 Hình 4.5 Kết 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính catalase 29 Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc đơn 15 chủng mơi trường NA 30 Hình 4.7 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata sau ngày nuôi cấy 32 Hình 4.8 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum sau ngày nuôi 34 Hình 4.9 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Fusarium solani sau ngày nuôi cấy 36 Hình 4.10 Cây dâu tây in vitro thích nghi vườn ươm tháng tuổi 38 Hình 4.11 Cây dâu tây sau bố trí thí nghiệm 38 vi TĨM TẮT Nghiên cứu tiến hành với mục đích sàng lọc chủng vi khuẩn tiềm ức chế nấm gây bệnh thực vật đánh giá đặc điểm hình thái, hóa sinh chủng phân lập Từ mẫu đất tỉnh thành (Hà Nội, Thái Bình, Phú n), chúng tơi phân lập 43 chủng vi khuẩn có khả kháng nấm bệnh thực vật Các chủng đánh giá khả ức chế nấm nấm mục tiêu Alternaria alternata Từ đó, chúng tơi đánh giá 15 chủng có khả đối kháng mạnh lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu đánh giá hình thái, đặc điểm hóa sinh (nhuộm Gram, thử nghiệm catalase khả sản sinh IAA) Để đánh giá khả ức chế nấm gây bệnh chủng vi khuẩn tiềm năng, chủng đồng nuôi cấy nấm Alternaria alternata, Fusarium oxysporum Fusarium solani môi trường PDA, SDA theo dõi thời điểm thời gian khác Kết thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn số chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ Đối với nấm Alternaria alternata, chúng tơi chọn chủng có hoạt tính ức chế nấm cao TV1.1 (68,08%), TV2.12 (67,27%), TV2.5 (66,39%), H2 (64,12%), TV2.1(63,29%) Các chủng vi khuẩn ức chế nấm Fusarium oxysporum mạnh TV2.5 (59,34%), H2 (56,47%), TV1.1 (54,40%), TV2.12 (51,78%), H1 (49,98%) Nấm Fusarium solani có chủng ức chế tỷ lệ cao TV2.5 (65,99%), TV2.12 (63,41%), H2 (59,96%), TV1.1 (57,98%), TV2.1 (57,16%) Trong số chủng trên, xác định chủng có hoạt tính ức chế ba nấm Alternaria alternata, Fusarium oxysporum Fusarium solani TV1.1, TV2.5, TV2.12 H2 Bốn chủng có hàm lượng sản sinh IAA 13,32µg/mL, 11,67 µg/mL, 17,17 µg/mL, 2,57 µg/mL Các chủng TV1.1, TV2.5, TV2.12 có hàm lượng sản sinh IAA cao nên chọn nguồn vật liệu quan trọng để tiếp tục đánh giá Ngoài ra, chủng H2 số chủng có vii khả kháng nấm cao hàm lượng sảnh sinh IAA thấp (2,57 µg/mL) nên khơng chọn lọc viii (H2), 38,82% (TV2.1) tăng dần sau 5-7 ngày đạt đến tỷ lệ 68,08%, 67,27%, 66,39%, 64,12%, 63,29% Ngược lại, H1 V7 chủng khơng có khả kháng nấm số 15 chủng thử nghiệm Trong nghiên cứu Jia cộng (2023), chủng Bacillus amyloliquefaciens có tên ký hiệu XJ-BV2007 có hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata mạnh với tỷ lệ ức chế 72,72% (Jia & cs., 2023) So sánh khả ức chế nấm chủng XJ-BV2007 với 15 chủng phân lập nghiên cứu 15 chủng mà tơi phân lập có hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata cao (>68%) Hình 4.7 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata sau ngày ni cấy 4.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn tiềm Nấm Fusarium oxysporum nấm tồn đất ký chủ cà chua, ớt… Để đánh giá hoạt tính kháng nấm điều kiện in vivo, chủng tiềm khảo sát tiếp tục đánh giá hoạt tính ức chế với nấm Fusarium oxysporum theo thời gian sử phương pháp đồng nuôi cấy Kết thể bảng 4.6 32 Bảng 4.6 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn tiềm (3-5-7 ngày) STT Tên chủng vi Khả ức chế hệ sợi so với nấm đối chứng (%) khuẩn Sau ngày Sau ngày Sau ngày Đối chứng 0 H1 11,52±0,14 28,00±0,11 49,98±0,06 H2 10.30±0,05 37,54±0,01 56,47±0,04 PY4 4,86±0,03 7,73±0,18 33,57±0,06 TV1.1 5,61±0,02 33,83±0,09 54,40±0,11 TV1.9 16,56±0,03 36,21±0,20 43,40±0,16 TV2.1 12,97±0,08 36,71±0,04 43,33±0,17 TV2.5 25,37±0,14 42,53±0,02 59,34±0,03 TV2.9 11,62±0,03 28,98±0,04 40,86±0,09 10 TV2.10 14,34±0,04 27,69±0,04 39,96±0,16 11 TV2.11 11,75±0,03 35,10±0,10 44,86±0,15 12 TV2.12 5,11±0,03 32,71±0,08 51,78±0,15 13 TV2.13 13,44±0,03 36,12±0,12 46,66±0,16 14 TV4.5 10,48±0,02 27,33±0,15 49,42±0,17 15 V7 17,04±0,03 32,67±0,02 44,09±0,07 16 V8 11,25±0,02 18,12±0,07 45,20±0,10 Kết cho thấy, 15 chủng khảo sát có khả ức chế với nấm Fusarium oxysporum dao động từ 33,57-59,35% (bảng 4.6) Trong số chủng trên, đứng đầu tỷ lệ ức chế chủng có khả đối kháng mạnh TV2.5, H2, TV1.1, TV2.12, H1 Đối với chủng trên, khả ức chế nấm Fusarium oxysporum thể rõ rệt sau ngày nuôi cấy 25,37% (TV2.5), 10,30% (H2), 5,61% (TV1.1), 5,11% (TV2.12), 11,52% (H1) tăng 33 dần sau 5-7 ngày đạt đến tỷ lệ 59,35%, 56,47%, 54,40%, 51,78%, 49,98% Ngược lại, PY4 chủng có khả kháng nấm thấp số 15 chủng thử nghiệm Tuy nhiên, 15 chủng phân lập có khả ức chế nấm nấm Fusarium oxysporum ( ˃33%) Theo nghiên cứu Venkataramanamma cộng (2022) cho kết dòng Bacillus-7, Bacillus-5, Bacillus-6, Bacillus-4 thuộc chủng Bacillus cereus có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum 74,36%, 71,63%, 57,73% 52,89% (Venkataramanamma & cs., 2022) Khả ức chế nấm Fusarium oxysporum chủng Bacillus-7, Bacillus-5, Bacillus-6, Bacillus-4 cao so với 15 chủng phân lập nghiên cứu (>59,35%) Hình 4.8 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum sau ngày ni cấy 4.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium solani chủng vi khuẩn tiềm Nấm Fusarium solani nấm tồn đất ký chủ khoai lang, cà tím, cà chua, ớt… Để đánh giá hoạt tính kháng nấm điều kiện in vivo, chủng tiềm khảo sát tiếp tục đánh giá hoạt tính ức chế 34 với nấm Fusarium solani theo thời gian sử phương pháp đồng nuôi cấy Kết thể bảng 4.7 Bảng 4.7 Hoạt tính kháng nấm Fusarium solani chủng vi khuẩn tiềm (3-5-7 ngày) STT Tên chủng vi Khả ức chế hệ sợi so với nấm đối chứng (%) khuẩn Sau ngày Sau ngày Sau ngày Đối chứng 0 H1 11,16±0,03 32,55±0,07 45,86±0,06 H2 33,31±0,05 51,37±0,05 59,96±0,09 PY4 9,21±0,03 28,03±0,06 38,47±0,24 TV1.1 32,04±0,04 50,18±0,08 57,98±0,16 TV1.9 22,72±0,01 44,59±0,02 54,35±0,05 TV2.1 21,29±0,01 47,34±0,11 57,16±0,10 TV2.5 35,91±0,04 57,29±0,05 65,99±0,10 TV2.9 20,67±0,05 45,82±0,12 56,70±0,12 10 TV2.10 23,48±0,02 41,21±0,03 47,72±0,09 11 TV2.11 17,58±0,01 43,92±0,01 52,47±0,07 12 TV2.12 36,32±0,03 52,86±0,03 63,41±0,13 13 TV2.13 21,16±0,01 45,15±0,03 55,04±0,12 14 TV4.5 4,53±0,07 38,66±0,15 51,96±0,17 15 V7 4,96±0,04 35,19±0,14 49,05±0,06 16 V8 1,19±0,01 33,00±0,13 44,03±0,18 Kết cho thấy, 15 chủng khảo sát có khả ức chế với nấm Fusarium solani dao động từ 38,47-65,99% (bảng 4.7) Trong số 15 chủng trên, đứng đầu tỷ lệ ức chế chủng có khả đối kháng mạnh TV2.5, TV2.12, H2, TV1.1, TV2.1 Đối với chủng trên, khả ức chế nấm 35 Fusarium solani thể rõ rệt sau ngày nuôi cấy 35,91% (TV2.5), 36,33% (TV2.12), 33,31% (H2), 32,04% (TV1.1), 21,29% (TV2.1) tăng dần sau 5-7 ngày đạt đến tỷ lệ 65,99%, 63,41%, 59,96%, 57,98%, 57,16% Ngược lại, PY4 chủng có khả kháng nấm với tỷ lệ thấp số 15 chủng thử nghiệm Tuy nhiên, 15 chủng phân lập có khả ức chế nấm nấm Fusarium solani ( ˃38%) Theo Trương Chí Hiền Lê Thanh Tồn (2020) đánh giá hoạt tính dịng vi khuẩn CTND-0501 lồi Pseudomonas mosselii có hoạt tính kháng nấm Fusarium solani 54,88% (Trương Chí Hiền & Lê Thanh Tồn, 2020) So sánh khả ức chế nấm chủng CTND-0501 với 15 chủng phân lập nghiên cứu 15 chủng mà tơi phân lập có hoạt tính kháng nấm Fusarium solani thấp (