Nghiên cứu cải biến chủng aureobasidium pullulans và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp b glucan tan

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu cải biến chủng Aureobasidium pullulans tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-glucan tan HOÀNG THỊ NGỌC ANH ngocanhhoang.edu@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn 1: PGS TS Nguyễn Lan Hương Viện: Giảng viên hướng dẫn 2: Viện: Viện CNSH&CNTP PGS.TS Vũ Văn Hạnh Viện CHSH - Viện HLKH CNVN HÀ NỘI, 2023 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu cải biến chủng Aureobasidium pullulans tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-glucan tan HỒNG THỊ NGỌC ANH ngocanhhoang.edu@gmail.com Ngành Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn 1: PGS TS Nguyễn Lan Hương Viện: Viện CNSH&CNTP Giảng viên hướng dẫn 2: PGS.TS Vũ Văn Hạnh Viện: Viện CHSH - Viện HLKH CNVN HÀ NỘI, 2023 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Hoàng Thị Ngọc Anh Đề tài luận văn: Nghiên cứu cải biến chủng Aureobasidium pullulans tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-glucan tan Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: 20211159M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày… .………… với nội dung sau: - Lỗi tả, thuật ngữ khoa học, số thập phân Bổ sung tổng quan EPS, β-glucan sinh tổng hợp Chỉnh sửa cơng thức tính, mô tả cụ thể phương nghiên cứu Biện luận kết chặt chẽ Chỉnh sửa chi tiết theo ý kiến thành viên hội đồng Ngày Tác giả luận văn Hoàng Thị Ngọc Anh Giáo viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Lan Hương PGS.TS Vũ Văn Hạnh tháng năm 2023 Chủ tịch hội đồng PGS.TS Quản Lê Hà Mẫu 1c MỞ ĐẦU Trong kỷ 21, mối quan tâm đến cơng thức thực phẩm có chứa polysacharide phức tạp tiếp tục tăng lên, có hoạt tính sinh học chức tăng cường sức khỏe polysacharide Polysacharide có thành phần nhiều loại thực phẩm Polysacharide nguồn cung cấp calo glucose cần thiết cho trình trao đổi chất bình thường thể β-glucan polysacharide có hoạt tính sinh học biết đến rộng rãi Cấu tạo phân tử gồm đơn vị β-D-glucose giữ liên kết glycosid β (1→3), (1→4) (1 →6) dạng phân nhánh không phân nhánh β-glucan chứng minh có số hoạt tính sinh học giảm số đường huyết cholesterol; kiểm soát bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, ung thư tăng huyết áp; đặc tính tăng cường miễn dịch; đặc tính kháng khuẩn (kháng khuẩn, kháng vi-rút) hoạt động chữa lành vết thương Aureobasidium pullulans loại nấm giống nấm men, thường biết đến với khả sản xuất β-glucan hòa tan tốt nước Năm 2013, chủng nấm A thailandense NRRL 58543 báo cáo tạo β-glucan Mặc dù suất sản xuất cịn tương đối thấp, thu độ tinh khiết cao β-glucan cách sử dụng phương pháp kết tủa ethanol đơn giản Do đó, mục đích nghiên cứu nghiên cứu cải biến chủng tự nhiên A pullulans AP4 khảo sát điều kiện phù hợp để nâng cao sản xuất β-glucan tan Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Vũ Văn Hạnh, Trưởng Phòng, Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Lan Hương tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phịng Các chất chức sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ việc tiến hành thí nghiệm Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên, hỗ trợ thời gian học tập thực luận văn Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí, từ đề tài Mã số 01C-06/01-2021-3 Sở Khoa học Công nghệ, Thành phố Hà Nội để thực cơng trình nghiên cứu Tóm tắt nội dung luận văn Trong nghiên cứu này, thực hai nội dung bao gồm cải biến chủng Aureobasidium pullulans tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp βglucan tan Đối với phương pháp thực hiện, sử dụng phương pháp vi sinh để hoạt hoá chủng, nuôi cấy đếm mật độ tế bào; phương pháp chiếu xạ gây đột biến, phương pháp xác định hàm lượng exopolysaccharide, β-glucan; phương pháp khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường, điều kiện lên men Các công cụ sử dụng nghiên cứu bao gồm xử lý số liệu phần mềm SPSS 20, phần mềm design expert 13 để thiết kế thí nghiệm box beken design Kết nghiên cứu, sử dụng liều chiếu xạ Co60 từ 0,5 kGy đến 1,5kGy để gây đột biến chủng tự nhiên A pullulans AP4 sàng lọc 100 dịng đột biến khác chọn lọc dòng A pullulans APX1.5.4.1 từ liều chiếu 1,5 kGy cho khả sinh tổng hợp exopolysacharide cao môi trường PDB cải tiến (15,89±0,25 g/L), cao gấp 1,57 lần so với chủng tự nhiên A pullulans AP4, lượng β-glucan sinh tổng hợp từ chủng A pullulans APX1.5.4.1 đạt 6,19±0,05 g/L cao gấp 1,45 lần so lượng β-glucan sản xuất từ chủng tự nhiên (4,25±0,10 g/L) Ngồi ra, chúng tơi xác định môi trường lên men phù hợp để sản xuất β-glucan tan chủng A pullulans AP1.5.4.1 môi trường chứa sucrose 64,94 g/L, KH PO 2,12 g/L peptone 4,21g/L với điều kiện lên men tối ưu gồm: pH ban đầu 6,0; nhiệt độ 28℃; thời gian lên men 72h Ở điều kiện này, lượng β-glucan thu từ chủng A pullulans APX1.5.4.1 đạt 12,10±0,23 g/L cao khoảng 2,85 lần lượng β-glucan thu từ chủng dại A pullulans AP4 (4,25±0,15 g/L) Khả hòa tan β-glucan từ chủng A pullulans APX1.5.4.1 đạt 80% Tôi cam kết kết đồng ý cho phép bên liên quan đề tài Mã số 01C-06/01-2021-3 Sở Khoa học Công nghệ, Thành phố Hà Nội để thực cơng trình nghiên cứu HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan 𝛃𝛃-glucan 1.1.1 Nguồn 𝛃𝛃-glucan 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc 1.1.3 Tính chất β-glucan 1.1.4 Chiết xuất tinh β-glucan 1.1.5 Ứng dụng β-glucan 1.2 Tổng quan chủng nấm Aureobasidium pullulans 1.2.1 Giới thiệu A pullulans 1.2.2 Ứng dụng A pullulans công nghệ sinh học 1.2.3 Sinh tổng hợp β-glucan từ chủng A pullulans 1.3 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans 1.4 Đột biến cải biến chủng A.pullulans nâng cao sản xuất β-glucan 1.4.1 Đột biến ngẫu nhiên 1.4.2 Ứng dụng tiến kĩ thuật di truyền 10 1.4.3 Các nghiên cứu cải biến chủng A pullulans liên quan đến sản xuất βglucan 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 12 2.1.1 Chủng vi sinh vật 12 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 12 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 12 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp vi sinh 13 2.2.2 Chuẩn bị giống lên men 14 2.2.3 Định lượng vi sinh vật 14 2.2.4 Gây đột biến chiếu xạ tia gamma γ 15 2.2.5 Xác định tế bào sống sót sau chiếu xạ 15 2.2.6 Xác định hàm lượng EPS thô 15 2.2.7 Sàng lọc dòng đột biến sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào (EPS) 15 2.2.8 Xác định hàm lượng β-glucan EPS 16 2.2.9 Khảo sát điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc 17 2.2.10.Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng 17 2.2.11.Tối ưu thành phần môi trường đến sản xuất β-glucan chủng đột biến A pullulans APX1.5.4.1 18 2.2.12.Đánh giá độ hoà tan β-glucan từ chủng A pullulans APX1.5.4.1 19 2.2.13.Phân tích xử lý số liệu 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 20 3.1 Nâng cao khả sinh tổng hợp β-glucan đột biến 20 3.1.1 Xác định mức độ sống sót chủng A pullulans AP4 sau chiếu xạ 20 3.1.2 Sàng lọc dịng đột biến có khả sinh tổng hợp EPS 20 3.1.3 So sánh lượng β-glucan chủng A pullulans APX1.5.4.1 A pullulans AP4 22 3.2 Khảo sát khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans APX1.5.4.1 23 3.2.1 Khảo sát điều kiện lên men 23 3.2.2 Khảo sát thành phần môi trường lên men chủng chủng A pullulans APX1.5.4.1 25 3.2.3 Tối ưu điều kiện lên men dòng đột biến A pullulans APX1.5.4.1 sinh tổng hợp β-glucan cao 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 41 DANH MỤC KÍ HIỆU Kí hiệu : Tên tiếng việt Tên tiếng anh PMA : Poly (β-L malic aicd) Poly (β-L malic aicd) EPS : Polysaccharide ngoại bào Exopolysaccharide Mw : Trọng lượng phân tử Molecular weight DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IFN-γ : Interferon-gamma Interferon-gamma Tia UV : Tia cực tím Ultra Violet EMS : Ethyl methanesulfonate Ethyl methanesulfonate MNU : N-methyl-N-nitrosourea N-methyl-N-nitrosourea MMS : Metyl methane sunfate Metyl methane sunfate MNNG : N-methyl-N’-nitro-Nnitrosoguanidine N-methyl-N’-nitro-Nnitrosoguanidine PDA : Potato dextrose agar Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth Potato dextrose broth DB : Mức độ phân nhánh Degree of branching DP : Mức độ trùng hợp Degree of polymerization WSS : Hội chứng đốm trắng White spot syndrome UDPG : Uridine diphosphate glucose Uridine diphosphate glucose PGM : α-phosphoglucose mutase α-phosphoglucose mutase UGP : β-GS : β-Glucan synthetase β-Glucan synthetase FKS : glucosyltransferase glucosyltransferase RSM : Phương pháp đáp ứng bề mặt Response surface methodology BBD : Thiết kế Box behnken Box behnken desgin APβG : UDP-glucose pyrophosphorylase Aureobasidium glucan pullulans UDP-glucose pyrophosphorylase β- Aureobasidium glucan pullulans β- DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Trọng lượng phân tử β-glucan từ nguồn khác Bảng 1.2: Các nghiên cứu chủng A pullulans liên quan đến sản xuất β-glucan 11 Bảng 2.1: Danh sách thiết bị thí nghiệm sử dụng 12 Bảng 2.2: Các thông số tối ưu điều kiện lên men 17 Bảng 2.3: Mức độ thử nghiệm khác nhân tố Box-Behnken Design (BBD) 18 Bảng 3.1: Thống kê lượng EPS thu từ dòng đột biến sau chiếu xạ 21 Bảng 3.2: Đặc điểm chủng A pullulans AP4 dòng A pullulans APX1.5.4.1 21 Bảng 3.3: Khả sinh tổng hợp EPS, β-glucan A pullulans APX1.5.4.1 qua hệ 22 Bảng 3.4: Thiết kế Box-Behnken Design (BBD) kết thực nghiệm 29 Bảng 3.5: Phân tích phương sai mơ hình bậc hai bề mặt phản ứng để sản xuất β-glucan chủng A pullulans APX1.5.4.1 30 Bảng phụ lục 1: Mật độ tế bào mức độ sống sót chủng A pullulans AP4 sau chiếu xạ 41 Bảng phụ lục 2: Kết sinh tổng hợp EPS từ dòng đột biến chiếu xạ liều chiếu 0,5 kGy 41 Bảng phụ lục 3: Kết sinh tổng hợp EPS từ dòng đột biến chiếu xạ liều chiếu 1.0 kGy 42 Bảng phụ lục 4: Kết sinh tổng hợp EPS từ dòng đột biến chiếu xạ liều chiếu 1.5 kGy 42 Bảng phụ lục 5: Kết khảo sát thời gian lên men khác đến sản xuất βglucan chủng đột biến A pullulanns APX1.5.4.1 43 Bảng phụ lục 6: Kết khảo sát nhiệt độ lên men khác đến sản xuất β-glucan 43 Bảng phụ lục 7: Kết khảo sát pH ban đầu khác đến sản xuất β-glucan 43 Bảng phụ lục 8: Kết khảo sát nguồn khoáng khác đến sản xuất β-glucan 43 Bảng phụ lục 9: Kết khảo sát nồng độ K2HPO4 đến sản xuất β-glucan 44 Bảng phụ lục 10: Kết khảo sát nguồn carbon khác đến sản xuất β-glucan 44 Bảng phụ lục 11: Kết khảo sát nồng độ sucrose khác đến sản xuất βglucan 44 Bảng phụ lục 12: Kết khảo sát nguồn nito khác đến sản xuất β-glucan45 Bảng phụ lục 13: Kết khảo sát nồng độ peptone khác đến sản xuất βglucan 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hoá học β-glucan khác [3] Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo điển hình β-glucan [5] Hình 1.3: Cấu tạo EPS từ chủng A.pullulans [43] Hình 1.4: Con đường sinh tổng hợp β-glucan [48] Hình 2.1: Quy trình xác định hàm lượng EPS thô 15 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xác định β-glucan 16 Hình 2.3: Quy trình xác định khả hồ tan β-glucan từ chủng A pullulans APX1.5.4.1 19 Hình 3.1: Khả sống sót chủng A pullulans AP4 sau chiếu xạ 20 Hình 3.2: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans APX1.5.4.1 23 Hình 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans APX1.5.4.1 24 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans APX1.5.4.1 25 Hình 3.5: Ảnh hưởng chất khống đến khả sinh tổng hợp β-glucan 25 Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ K2HPO4 đến khả sinh tổng hợp β-glucan 26 Hình 3.7: Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác 27 Hình 3.8: Khảo sát nồng độ sucrose khác 27 Hình 3.9: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp β-glucan 28 Hình 3.10: Ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả sinh tổng hợp β-glucan 29 Hình 3.11: Biểu đồ bề mặt phản ứng tương ứng tác động ba biến độc lập đến sinh tổng hợp β-glucan 32 C² Phần dư Sự không tương thích 7,800 0,742 0,668 Sai số 0,074 40,190 14 Tổng tương quan 7,800 0,149 0,223 52,560 0,0008* 5,990 0,146 0,037 *Các giá trị có ý nghĩa (P