TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ DILTIAZEM
1.1.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất hóa lý [24,28] a Công thức cấu tạo
- Công thức phân tử: C22H26N2O4S HCl
- Khối lượng phân tử: 450.98 g/mol
- Tên khoa học: 1,5-Benzothiazepin-4(5H)-one,3-(acetyloxy)-5-[2- (dimethylamino)ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyphenyl), monohydrochloride, b Tính chất vật lý, hóa học :
- Bột kết tinh hoặc tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi
- Nhiệt độ nóng chảy: Từ 207,5 0 C đến 212,0 0 C.
- Hệ số phân bố: Log P(octanol/nước) = 2,79.
- Dạng muối tan tốt trong nước, và acid formic, it tan trong ethanol, không tan trong ether Dạng base tan tốt trong cloroform, ether Do đó khi chiếtDTZ trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng nên kiềm hóa để chuyển sang dạng base rồi chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực như cloroform, diclormethan, diethyl ether, n-hexan…
- Dạng dược dụng thường kết hợp với 1 phân tử acid hydrocloric nên có thể định lượng DTZ theo phương pháp chuẩn độ bạc nitrat.
- Phổ hấp thụ UV-Vis: Đỉnh hấp thụ trong dung dịch acid H2SO4 0,2M là
236 nm, trong dung dịch kiềm là 237 nm Do đó với dạng nguyên liệu và chế phẩm có thể định lượng bằng cách đo trực tiếp phổ hấp thụ UV hoặc HPLC với detector UV
- Góc quay cực riêng: + 110 0 đến + 116 0+
1.1.2 Tác dụng dược lý, dược động học: a Tác dụng dược lý [3,4,5,21]
Diltiazem là một dẫn chất của benzothiazepin có tác dụng chẹn kênh calci gây giãn động mạch vành và mạch ngoại vi Ngoài ra nó còn làm chậm dẫn truyền điện tử của cơ tim do đó làm chậm nhịp tim, giảm co bóp cơ tim và làm chậm dẫn truyền nút nhĩ thất Thuốc được sử dụng trong điều trị đau thắt ngực và tăng huyết áp b Dược động học [16,23,25,26]:
- Thuốc được hấp thu nhanh theo đường tiêu hóa, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Trong thực tế bệnh nhân thường được khuyên dùng ngay trước bữa ăn để tránh quên thuốc Thuốc bị chuyển hóa qua gan lần đầu, tạo thành nhiều chất chuyển hóa khác nhau Tỷ lệ thuốc liên kết với protein cao (khoảng 80 - 85%) Vì vậy khi dùng liều duy nhất 60 mg DTZ, nồng độ thuốc trong huyết tương đạt cực đại khoảng 200 ng/ml Thể tích phân bố biểu kiến từ 3 đến 8 l/kg, đào thải chủ yếu qua phân, chỉ có khoảng 2 – 4 % đào thải dạng không biến đổi qua nước tiểu Thời gian bán thải khoảng 3 - 8 giờ
- Sản phẩm chuyển hóa bao gồm: o Deacetyl diltiazem(1) o N mono demethyl diltiazem(2) o Deacetyl-N-monodemethyl diltiazem(3) o Deacetyl diltiazemN-oxid(4) o Deacetyl O-demethyl diltiazem(5) o Deacetyl N,O-didemethyl diltiazem(6)
- Khi xây dựng phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học phương pháp cần có giới hạn định lượng dưới khoảng 7 - 10 ng/ml (1/20 đến 1/30
Cmax) để đảm bảo AUCt > 80% AUC∞. c Chỉ định và cách dùng [3,4,5]
Liều thông thường: Uống 60 mg, 3 lần một ngày ngay trước khi ăn
Ðiều trị đau thắt ngực: Uống 60 mg diltiazem, 3 lần một ngày; hoặc khởi đầu bằng liều 30 mg, 4 lần một ngày, tăng liều khi cần thiết trong khoảng 1 - 2 ngày sau Ðối với người bệnh bị đau thắt ngực không ổn định, có thể dùng viên giải phóng chậm với liều từ 360 - 480 mg hàng ngày
Ðiều trị tăng huyết áp: Dùng viên nén hoặc nang giải phóng chậm với liều ban đầu khoảng 60 - 120 mg, 2 lần một ngày; cứ 14 ngày một lần, có thể tăng liều nếu cần thiết tới liều tối đa mỗi ngày là 360 mg d Lưu ý khác khi dùng thuốc [21]
- Tác dụng phụ : Thuốc có thể gây khó chịu ít nhiều ở một số người bệnh
Khoảng 30% người bệnh dùng thuốc được ghi nhận gặp tác dụng không mong muốn liên quan đến khả năng gây giãn mạch của diltiazem Những
- Chống chỉ định: o Rối loạn hoạt động nút xoang, blốc nhĩ thất độ 2 và độ 3. o Mẫn cảm với diltiazem. o Suy thất trái kèm theo sung huyết phổi o Nhịp tim chậm dưới 50 phút
1.1.3 Một số phương pháp định lượng DTZ trong dịch sinh học Đặc thù của phân tích thuốc trong dịch sinh học là phức tạp, lẫn nhiều tap chất, nồng độ hoạt chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên đòi hỏi những yêu cầu cơ bản sau:
- Tính đặc hiệu cao: phân biệt được DTZ với các tạp chất lẫn trong mẫu, đặc biệt là chất chuyển hóa có công thức tương tự.
- Độ nhạy cao: nồng độ thuốc trong dịch sinh học thường rất thấp, đòi hỏi phương pháp phải có độ nhạy cao
Thời gian phân tích mẫu càng ngắn càng tốt: số lượng mẫu phân tích trong đánh giá TĐSH rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có thể ảnh hưởng tới kết quả phân tích
Một số phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học được tổng hợp ở bảng 1.1 :
Bảng 1.1 : Một số phương pháp phân tích DTZ trong huyết tương
Stt Tài liệu Xử lý mẫu Phương pháp phân tích
Thời gian phân tích mẫu (phút)
1 [12] Kết tủa protein bằng acetonitrile LC – MS/MS
2 [32] Chiết pha rắn (SPE) HPLC – UV
3 [9] Chiết pha rắn (SPE) HPLC – UV
Chiết lỏng – lỏng bằng ethyl acetate Hiệu suất chiết 50.4-58.8%
Chiết lỏng – lỏng bằng hexane – chloroform - isopropanol
Kiềm hóa bằng dung dịch KHCO3 0,01M, rồi chiết bằng ethyl acetate Tiếp tục chiết bằng HCl 0,01 M đem bay hơi dưới dòng khí nitơ sau đó hòa tan cắn bằng HCl 0.002 M
Kiềm hóa bằng amoni sulfat rồi chiết lỏng – lỏng bằng methyl-ter- butyl ether
9 [7] Kiềm hóa bằng amoni sulfat rồi chiết bằng ethyl acetate.
10 [8] Kiềm hóa rồi chiết lỏng – lỏng bằng ter-butyl methyl ether
Từ các kết quả nghiên cứu về định lượng DTZ trong huyết tương, chúng tôi thấy:
- PP 1: Sử dụng detector khối phổ, PP này có ưu điểm giới hạn định lượng đạt yêu cầu (1ng/ml) với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản bằng tủa protein, đồng thời định lượng DTZ và 2 chất chuyển hóa chính Tuy nhiên hạn chế của phương pháp là thời gian phân tích mẫu quá dài (15 phút), nên không phù hợp để triển khai đánh giá SKD và TĐSH.
- PP 2: Định lượng được DTZ bằng HPLC với detector UV ở bước sóng
215 nm, PP này có ưu điểm là thiết bị phổ biến có thể áp dụng được ở nhiều labo phân tích Tuy nhiên, nhược điểm là thời gian phân tích mẫu dài (15 phút), giới hạn định lượng 20 ng/ml > 1/10 Cmax và phương pháp xử lý mẫu bằng chiết pha rắn với chi phí lớn không phù hợp để triển khai đánh giá SKD và TĐSH.
- PP 3: Định lượng đồng thời DTZ và các chất chuyển hóa chính của nó sử dụng detector UV ở bước sóng 238 nm, tuy nhiên phương pháp xử lý mẫu bằng chiết pha rắn khá tốn kém, thời gian phân tích mẫu lại quá dài (15 phút).
- PP 4: Sử dụng detector khối phổ với kỹ thuật xử lý mẫu bằng chiết lỏng– lỏng, giới hạn định lượng đạt yêu cầu và thời gian phân tích ngắn Tuy nhiên phương pháp này có hiệu suất chiết thấp (50.4-58.8%) và không ổn định.
- PP 5: Sử dụng detector UV ở bước sóng 239 nm và phương pháp xử lý mẫu đơn giản bằng chiết lỏng – lỏng, PP này có giới hạn định lượng phù hợp
(3 ng/ml) nhưng nhược điểm là thời gian phân tích mẫu quá dài (12 phút).
- PP 6: Sử dụng detector UV, PP này định lượng được đồng thời DTZ và 6 chất chuyển hóa của nó, giới hạn định lượng dưới phù hợp (3 ng/ml) nhưng thời gian phân tích mẫu quá dài (15 phút) và phương pháp xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng qua 2 giai đoạn gây nhiều sai số
TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC/MS
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography - HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry - MS)
Dựa vào máy phân tích khối phổ (Mass analyser), hệ thống LC/MS có 3 loại cơ bản:
- Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực.
- Bẫy ion (Ion trap): tất cả các ion di chuyển theo hình xoắn ốc, khi tần số quét RF thay đổi thì lựa chọn được ion phù hợp đi vào các lỗ nhỏ (bẫy ion)
- Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube): các ion có số khối khác nhau sẽ có thời gian bay khác nhau, các ion được phân tách theo thời gian bay. Việc kết hợp 2 hay nhiều loại trên với nhau tạo thành hệ thống MS/MS như: triple-quadrupole hoặc tandem mass spectrometer, Q-Tof,… Hệ thống MS/MS phân tích được các ion phân mảnh, rất có ý nghĩa trong định danh chất để xác định cấu trúc nâng cao khả năng phân tích định tính, định lượng
Thành phần cơ bản của hệ thống LC/MS (Hình 1.1) gồm: hệ thốngHPLC, máy MS và mặt phân giới ion hóa (trung gian gữa LC và MS).
Hình 1.1 Mô hình hệ thống LC/MS
1.2.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Tương tự như hệ thống HPLC thông thường, có vai trò phân tách các chất dựa vào tính chất lý hóa của chúng Hệ thống HPLC bao gồm: Bình chứa pha động, bơm cao áp, tiêm mẫu, cột phân tích và detector, tuy nhiên hệ thống HPLC của thiết bị LC – MS có một số đặc điểm khác:
- Pha động có thể là dung môi hữu cơ hoặc đệm Nếu pha động là đệm thì thường là đệm có khả năng bay hơi như amoniacetat, formic….
- Pha động khi ra khỏi cột phân tích thường qua bộ phận chia dòng để chỉ cú một lượng nhất định (< 50 àl/phỳt) vào MS, trỏnh lượng dung mụi quá nhiều vào MS gây bẩn và hỏng máy.
- Detector: có thể coi MS là một detector, tuy nhiên có thể nối thêm các detector khác như UV, FR… để hỗ trợ trong phân tích.
1.2.3.2 Mặt phân giới ion hóa (Ionization Interface)
Mặt phân giới ion hóa nằm giữa HPLC và MS có vai trò:
- Loại bỏ dung môi pha động không cho vào MS: các chất không ion hoá bị làm chệch hướng ra ngoài không qua được lỗ nhỏ vào MS, hoặc sử dụng khí chắn để đuổi dung môi âm để đi vào MS Có 2 kiểu tạo ion phổ biến:
+ Ion hóa bằng dòng điện tử (electron spray ionization – ESI): áp dụng cho chất các phân cực mạnh hoặc các chất tồn tại ở dạng ion. + Ion hóa bằng dòng ion (ion spray ionaziation – ISI) còn được gọi với tên khác ion hóa hóa học (atmospheric-pressure chemical ionization - APCI): áp dụng cho các chất ít phân cực hơn.
Các ion được tạo ra ở mặt phân giới khi vào trong máy phân tích MS sẽ không thể tồn tại được nếu va đập với các phân tử không khí Vì vậy yêu cầu đầu tiên để vận hành máy MS là phải đạt môi trường chân không cao.
Có 2 loại bơm tạo chân không:
- Bơm dầu: tạo áp suất chân không ban đầu 1,4 torr ở mặt phân giới và 10 -4 torr ở bộ phận dẫn đường ion Trong trường hợp máy đang chạy mà mất điện đột ngột thì dầu có thể tràn vào buồng chân không gây bẩn, hỏng thiết bị
- Bơm tua – bin: gồm hệ thống nhiều bơm phân tử tua - bin được kết nối để tạo ra mức chân không cao hơn 10 -6 Các bơm tua - bin có nhiều van được đặt trên một trục quay ở tốc độ cao Các van này loại bỏ không khí từ buồng chân không và hút không khí ra khỏi bơm Bơm này có ưu điểm là không làm bẩn máy, nhưng tuổi thọ kém.
* Máy phân tích khối và detector ion.
Mẫu sau khi bị ion hoá được hướng tới máy phân tích MS, các kiểu ion tương tự nhau được tập trung lại thành dòng (Hình 1.2).
Bề mặt tích điện trực tiếp (The direct-current dc) của máy phân tích được quét với các tần số tín hiệu (radio-frequency RF), mỗi tần số quét lựa chọn những ion có số khối khác nhau, cho phép chúng đi theo đường ổn định tới detector Các ion ổn định tại mỗi tần số được tống ra để đập vào detector ion, ở đây các ion được đếm về số lượng tạo ra tín hiệu rồi chuyển đến máy tính Những ion không được lựa chọn sẽ bị loại bỏ trong quá trình di chuyển.
Khi hạt mang điện đập vào bề mặt màng detector làm cho mặt bên kia của detector giải phóng electron Các electron này tới đập vào thành của detector làm giải phóng nhiều electron hơn sau mỗi lần va đập Từng đợt va đập electron làm tăng cường tín hiệu rồi được chuyển về hệ thống dữ liệu (Hình 1.3)
Hình 1.3 Bộ phận phát hiện ion
Hình 1.4: Hệ thống MS/MS Triple-quadrupole
Máy phân tích MS/MS thường kết hợp 2 máy phân tích MS có tế bào va đập (a collision cell) Ion đích được lựa chọn từ máy phân tích MS đầu tiên được phép va đập với phân tử khí trơ để kích thích phân mảnh Sau đó các ion mảnh đi vào trong máy phân tích MS thứ 2 để phân tách và xác định (Hình 1.4).
* Dữ liệu và hệ thống kiểm soát
Hệ thống dữ liệu ghi nhận tất cả các thông tin về phổ từ sắc ký đồ chạy ở dạng khối dữ liệu 3 chiều (Hình 1.5)
Hệ thống dữ liệu cho ta 2 loại sắc ký đồ:
+ Sắc ký đồ chiều ion, hoặc sắc ký đồ ion tổng (TIC; Hình 1.6 a) là đồ thị tổng của cường độ tất cả các ion đối với thời gian.
+ Sắc ký đồ biểu diễn cường độ tín hiệu – m/z tại một thời điểm đã
Hình 1.5 Hệ thống ghi dữ liệu
Hình 1.6: Sắc ký đồ tổng ion (a) và phổ m/z (b)
(b) của ion phân tử Để chạy sắc ký đồ một mẫu chưa biết ta đặt máy đo MS theo phương thức quét để thu nhận được dữ liệu từ dải tần số dc/RF đủ rộng để bao phủ toàn bộ dải giá trị m/z mong muốn đồng thời loại bỏ được khí và dung môi.
LC/MS được ứng dụng trong các lĩnh vực:
- Nghiên cứu hợp chất mới, đặc biệt nghiên cứu phát triển thuốc.
- Nghiên cứu xác định hợp chất sinh học phức tạp, định danh protein.
- Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng trưởng.
- Phân tích thuốc trong dịch sinh học: dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…
PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
1.3.1 Các phương pháp chiết tách thuốc trong huyết tương[1,17]:
Mẫu thuốc trong huyết tương phải được chiết tách trước khi đưa vào thiết bị phân tích Có 3 phương pháp chính được dùng để chiết tách hoạt chất ra khỏi dịch sinh học: a Phương pháp chiết pha rắn (SPE) :
- Nguyên tắc: Là phương pháp tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về ái lực của chất cần phân tích và các tạp chất đối với pha động (dạng lỏng) và pha tĩnh (dạng rắn) Mẫu được đưa vào pha tĩnh, dùng dung môI thích hợp để rửa giải tạp chất ra trước trong khi chất cần phân tích vẫn còn được lưu giữ trên cột hoặc ngược lại Sau đó rửa giải chất phân tích còn lưu giữ trên cột bằng dung môi thích hợp
- Phương pháp này có ưu điểm là hoạt chất chiết được tinh khiết, chọn lọc, thuận lợi cho các thiết bị phân tích sau đó, tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là tốn kém, khó áp dụng ở quy mô rộng. b Phương pháp kết tủa protein
- Nguyên tắc: sử dụng các tác nhân gây tủa protein (TFA, acid tricloroacetic, acid percloric, MeOH, MeCN) để làm đông vón protein trong mẫu huyết tương Một số chất phân tích dễ hỏng bởi acid có thể sử dụng kỹ thuật chiết kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ.
- Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản dễ tiến hành và chi phí thấp, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là hoạt chất chiết được có độ tinh khiết không cao. c Chiết lỏng – lỏng:
- Nguyên tắc sử dụng dung môi hữu cơ không phân cực, không đồng tan với huyết tương (ethyl acetat, diethyl ether, cloroform, diclormethan, n-hexan, cyclohexan…) để chiết tách chất phân tích Khi sử dụng kỹ thuật này cần chuyển chất phân tích sang dạng tan tốt trong dung môi hữu cơ.
- Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản dễ tiến hành và chi phí thấp, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là hiệu suất chiết thấp và hoạt chất chiết được có độ tinh khiết không cao.
Trong thực tế, người ta có thể kết hợp 2 hay nhiều kỹ thuật trên để xử lý mẫu, đặc biệt với những mẫu mà khi xử lý bằng 1 kỹ thuật không thu được kết quả mong muốn.
1.3.2 Định lượng thuốc trong huyết tương bằng sắc ký lỏng với các loại detector [10]:
Thuốc sau khi được tách loại tạp khỏi các thành phần của dịch sich học, được tiến hành định lượng bằng các kỹ thuật khác nhau, trong đó một kỹ thuật hay được dùng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng hiệu năng cao Hoạt chất sau khi đi qua cột sắc ký lỏng được đưa đến bộ phận phát hiện, gọi là detector Có nhiều loại detector được ghép nối với thiết bị sắc ký lỏng
- Detector chỉ số khúc xạ
1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [29]:
Với các ứng dụng của phép định lượng thuốc trong dịch sinh học như đã nêu ở trên, phương pháp phân tích bao gồm quy trình xử lý mẫu và kỹ thuật phân tích phải được tiến hành thẩm định đầy đủ trên các tiêu chí sau:
- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp.
- Tính thích hợp của hệ thống phân tích.
- Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính.
- Độ đúng và độ chính xác.
- Tỷ lệ thu hồi của phương pháp.
- Độ ổn định của hoạt chất.
PHẦN 2 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
- Chất chuẩn và nội chuẩn:
+ Diltiazem (DTZ): Chuẩn phòng thí nghiệm – SKS: 060909, hàm lượng 99,9%, tính theo nguyên trạng.
+ Felodipine (Felo): Chuẩn phòng thí nghiệm; hàm lượng 99,5% (nguyên trạng) Sử dụng làm chất nội chuẩn (IS) trong phương pháp phân tích.
+ MeCN, MeOH, isopropanol, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC/MS.
+ Các dung môi hóa chất khác như diethylether, cloroform, cyclohexan, dicloromethan, n-hexan, đạt tiêu chuẩn PA.
- Huyết tương trắng không có DTZ:
Cung cấp bởi Viện Huyết học và truyền máu trung ương, 06 lô bao gồm: P0906153170 - 3075, P0906113085 - 3082, P0906183211 – 3091
Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn hóa theo yêu cầu của ISO/IEC
-Thiết bị phân tích: Máy sắc ký lỏng khối phổ TSQ Quantum Ultra (Thermo
-Thiết bị dụng cụ khác:
+ Cân phân tích sartorius (d = 0,1mg; e = 0,1mg).
+ Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 – 16K.
+ Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí ni tơ có gia nhiệt Reacti-Therm III (Thermo scientific).
+ Buret tự động 725 Dosmat (d = 0,001 ml) của Metrohm (Thụy Sỹ). + Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientifica (3000 vòng/phút).
+ Máy lắc GPL 3006 – Đức (300 vòng/phút).
+ Tủ lạnh sâu (– 40 0 C), Sanyo MDF – 236.
+ Bình định mức, dụng cụ thuỷ tinh (class A) dùng trong phân tích.
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Mẫu trắng: Huyết tương trắng – Viện Huyết học và Truyền máu TW.
- Mẫu chuẩn hay mẫu thử tự tạo: Hoà tan DTZ chuẩn trong huyết tương trắng với các nồng độ thích hợp.
- Mẫu thử: Huyết tương của NTN sau khi uống thuốc DTZ chứng hoặc thử.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích
2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định DTZ và chuẩn nội
* Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội:
Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa của các chất để lựa chọn nội chuẩn, để đảm bảo IS được lựa chọn, bền vững, có thể được chiết tách cùng chuẩn, đồng thời tạo được mảnh phổ phù hợp khi phân tích cùng DTZ Các chất dự kiến làm chuẩn nội được pha trong MeOH (500 àg/ml) sau đú pha loóng với MeOH thành dung dịch cú nồng độ khoảng 1 àg/ml và bơm trực tiếp vào máy khối phổ TSQ Quantum Ultra để xác định mảnh phổ, tối ưu hóa cùng với DTZ.
* Tối ưu hoá điều kiện khối phổ xác định DTZ và nội chuẩn:
Tối ưu hóa điều kiện khối phổ sử dụng nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI– Electrospray ions) với các nội dung:
- Tối ưu hóa quá trình chuyển dòng dung môi pha động sang trạng thái khí.
- Tối ưu điều kiện ion hóa chất cần phân tích để có được lượng ion nhiều và ổn định.
- Tối ưu hóa điện thế của các điện cực trong dectector khối phổ để có được dòng ion của chất cần phân tích đi đến bộ phận phát hiện nhiều nhất và sạch nhất.
- Lựa chọn mảnh phổ thích hợp cho cho chuẩn và nội chuẩn để định lượng.
2.3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký
Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên thiết bị LC-MS/MS (TSQ Quantum Ultra – Thermo Scientific) sử dụng cột pha đảo C18 (50 x 3 mm; 2,1 àm) và pha động chứa cỏc thành phần MeOH, đệm amoni acetat 2 mM với các tỷ lệ khác nhau
Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng DTZ trong huyết tương NTN bằng phương pháp HPLC với detector MS.
2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu, đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu, chiết tách DTZ từ huyết tương trên các mẫu chuẩn DTZ hoà tan trong pha động; mẫu huyết tương trắng và các mẫu chuẩn DTZ hoà tan trong huyết tương trắng có nồng độ khoảng 100 ng/ml xấp xỉ bằng nồng độ cực đại trong huyết tương (Cmax), khi sử dụng liều đơn Diltiazem 60 mg, bằng các phương pháp như:
- Tủa protein với các tác nhân gây tủa có thể là acid (percloric,tricloracetic, trifluoracetic), hoặc dung môi (MeOH, MeCN).
- Kiềm hóa huyết tương để chuyển DTZ sang dạng base, sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng bằng các dung môi như diethyl ether, cloroform hay hỗn hợp diethyl ether – cloroform.
Từ kết quả thực nghiệm, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phù hợp vừa đơn giản, dễ thực hiện vừa có tỷ lệ thu hồi hoạt chất và nội chuẩn cao đồng thời nền mẫu không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng < 15% đến tín hiệu cường độ ion hoạt chất và nội chuẩn của detector khối phổ
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát, theo các chỉ tiêu qui định của dược điển và hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp.
Tiến hành thẩm định trên mẫu huyết tương trắng, mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra (quality control sample - QC) tự tạo.
* Chuẩn bị mẫu chuẩn tự tạo:
- Hòa tan chất chuẩn DTZ trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ DTZ chính xác khoảng 250 g/mL Từ đó pha thành các nồng độ dự kiến 5 – 500 ng/ml trong huyết tương.
- Pha loãng 1 thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc với một lượng nước cất vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc (S-W8) có nồng độ DTZ chính xác khoảng 5000 ng/mL
Bảng 2.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc DTZ trong nước (S-W)
- Pha loãng dung dịch S-W8 với nước cất để thu được các dung dịch chuẩn làm việc S-W1 đến S-W7 theo bảng 2.1.
- Từ các dung dịch chuẩn làm việc, pha các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương bằng cách phối hợp các dung dịch chuẩn làm việc trong nước (S-W) tương ứng với huyết tương trắng theo bảng 2.2
Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương
Dung dịch S-W trong nước Thể tích huyết tương trắng (L)
* Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC):
- Hòa tan chất chuẩn DTZ trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ DTZ chính xác khoảng 250 g/mL.
- Pha loãng 1 thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc với một lượng nước cất vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc (WS) có nồng độ DTZ chính xác khoảng 5000 ng/mL.
- Pha các dung dịch chuẩn trong nước QC-W, từ dung dịch WS theo bảng 2.3.
- Từ các dung dịch chuẩn trong nước, pha các mẫu QC chứa chuẩn DTZ trong huyết tương bằng cách phối hợp các dung dịch chuẩn làm việc trong nước
Bảng 2.3 Chuẩn bị các dung dịch trong nước (QC-W) để pha mẫu QC:
Ký hiệu LQC-W MQC-W HQC-W
Bảng 2.4 Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương:
Dung dịch QC-W trong nước Thể tích huyết tương trắng (L)
Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn làm việc độc lập.
2.3.2.1 Thẩm định độ đặc hiệu – chọn lọc
Xử lý mẫu theo qui trình đã được lựa chọn Tiến hành sắc ký 06 mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau; mẫu trắng có nội chuẩn; mẫu chuẩn DTZ ở nồng độ LLOQ (5 ng/ml xấp xỉ khoảng 1/20 giá trị Cmax) Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí ứng với thời gian lưu của hoạt chất và nội chuẩn
Qui trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt được DTZ và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của DTZ phải không vượt quá 20% đáp ứng của mẫu chuẩn Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của nội chuẩn phải không được vượt quá 5% đáp ứng của nội chuẩn.
2.3.2.2 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương có nồng độ tương ứng từ 5 – 500 ng/ml như ở trên Từ đáp ứng pic của DTZ và IS tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi qui giữa tỷ lệ đáp ứng pic của DTZ/IS và nồng độ DTZ có trong mẫu Đường chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%, đồng thời 4/6 điểm QC phải nằm trên đường chuẩn.
2.3.2.3 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định DTZ và chuẩn nội
3.1.1.1 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ xác định DTZ:
Pha dung dịch chuẩn DTZ trong MeOH nồng độ khoảng 1 àg/ml Bơm dung dịch chuẩn DTZ với tốc độ 5 àl/phỳt cựng với dũng dung mụi sắc ký (tốc độ dũng sắc ký khoảng 500 àl/phỳt) qua bộ trộn hỡnh chữ T (Mixing tee) vào hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa phun điện tích dương - Possitive Electro Spray Ions (ESI +) như hình 3.1
Hình 3.1 Cơ chế hoạt động của thiết bị LC/MS trong quá trình tối ưu hóa điều kiện khối phổ: - Infusion pump: Bơm dung dịch chuẩn DTZ;
-LC: Bơm dung môi sắc ký.
Lựa chọn chế độ quét toàn phổ (Full scan MS) với nguôn; xác định được mảnh ion mẹ (parent ion) của DTZ có số khối m/z là 415 Da, tương ứng với cấu trúc [DTZ-H] + (hình 3.2).
Hình 3.2 Phổ khối của DTZ
Sau khi xác định được mảnh ion mẹ m/z = 415 Da, chúng tôi tiến hành tối ưu điện thế nguồn ion hóa, tốc độ thổi khí nitrogen sương mù hóa dòng dung môi sắc ký để lượng ion mẹ đi vào detector khối phổ là lớn nhất và ổn định Kết quả thực nghiệm cho thấy:
- Điện thế của nguồn ion hóa ảnh hưởng đến số lượng tiểu phân mang điện tích tạo thành: Khi điện thế tăng lên, lượng ion có m/z = 415 đi vào dector khối phổ tăng lên đồng thời các số lượng ion khác đi vào detector cũng tăng lên và ngược lại Khi điện thế tăng quá cao thì có hiện tượng phóng hồ quang điện ở đầu phun ion làm giảm tuổi thọ của đầu phun và khi điện thế giảm quá thấp thì lượng ion đi vào detector thấp làm giảm độ nhạy của phương pháp.
- Tốc độ thổi khí nitrogen để sương mù hóa dòng dung môi sắc ký ảnh hưởng đến hiệu năng tích điện của các tiểu phân DTZ: Khi tốc độ dòng khí quá lớn, số lượng ion m/z = 415 đi vào detector khối phổ giảm đi và dòng ion đi vào detector khối phổ cũng không ổn định (do phần lớn ion bị thổi qua đường thải cùng với dung môi pha động) Khi tốc độ dòng khí quá thấp thì quá trình sương mù hóa không đạt hiệu suất cao, có hiện tượng ngưng tụ hơi nước và hơi dung môi trong buồng ion hóa, làm cho số lượng ion m/z tạo thành giảm đi rõ rệt, nên số lượng ion đi vào detector ít đi và cũng không ổn định
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi xác định khi điện thế của nguồn phun ion hóa (spray voltage) là 4000 V; nhiệt độ nguồn phun là 40 0 C; áp suất khí mang (sheath gas pressure), khí bổ trợ (auxilary gas pressure) tương ứng là
30 psi và 5 psi; nhiệt độ mao quản (capillary temperature) là 360 0 C thì lượng ion mẹ có m/z = 415 Da đi vào detector khối phổ là lớn nhất và ổn định.
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện của nguồn ion hóa, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ ion (tube lens offset) để lượng ion được tạo thành ở nguồn ion hóa đi vào detector khối phổ với lượng tối ưu Kết quả xây dựng giản đồ điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ cho thấy, khi điện thế là 108 V thì lượng ion có m/z = 415 Da đi vào detector khối phổ ở mức tốt nhất (cường độ tín hiệu detector đo được là lớn nhất) – hình 3.3
Hình 3.3 Giản đồ điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ Để giảm độ nhiễu của nền mẫu, tăng độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích, chúng tôi lựa chọn kiểu khối phổ 2 lần (MS/MS), sử dụng năng lượng phân mảnh ion mẹ (m/z = 415 Da) tạo ra các ion con đặc hiệu Kết quả thực nghiệm cho thấy, trong số các ion con được tạo thành khi phân mảnh ion mẹ, ion có m/z = 178 Da cho tín hiệu lớn và ổn định nhất (hình 3.4) Năng lượng tối ưu để để phân mảnh ion mẹ tạo ra ion con có m/z 178 Da là 22 V (hình 3.5) Cơ chế phân mảnh ion được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.5 : Tối ưu hóa năng lượng phân mảnh ion mẹ (m/z = 415) tạo ion con (m/z = 178)
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi xác định các thông số của detector khối phổ với nguồn ion hóa ESI dùng để định tính, định lượng DTZ như sau:
- Điện thế của nguồn phun (spray voltage): 4000 V
- Nhiệt độ nguồn phun (spray temperature): 40 0 C
- Áp suất khí mang (sheath gas pressure): 30 psi
- Áp suất khí bổ trợ (auxilary gas pressure): 5 psi
- Áp suất khí quét buồng ion hóa (ion sweep gas pressure): 1 psi
- Nhiệt độ mao quản (capillary temperature): 360 0 C
- Điện thế thấu kính hội tụ ion (tube lens offset): 108 V
- Ion ban đầu – ion mẹ (parent ion): m/z = 415 Da
- Năng lượng phân mảnh ion (collision energy): 22 V
- Ion tạo thành (product ion): m/z = 178 Da
Các thông số của thiết bị khối phổ sau khi tối ưu hóa được ghi vào thành 1 file tune (dùng để cài đặt các thông số của thiết bị trong quá trình phân tích DTZ).
3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội
Dựa trên tính chất hóa lý của DTZ và tham khảo tài liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn nội chuẩn cho phương pháp phân tích từ các chất felodipine
(FELO), trimetazidine (TMZ) và lidocain (LID) tương tự như mục 3.1.1.1. Bơm trực tiếp lần lượt cỏc dung dịch FELO, TMZ và LID cú nồng độ 1 àg/ml vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5àl/phỳt với chế độ phun điện tử ion dương (+ESI) Phổ khối của TMZ, LID và FELO được ghi lại ở hình 3.6, 3.7 và 3.8.
Hình 3.6 Phổ khối [TMZ-H] + m/z = 267 (a) và phân mảnh m/z 267 181 (b)
Hình 3.7 Phổ khối [LID-H] + m/z#5 (a) và phân mảnh m/z 235 86 (b)
Hình 3.8 Phổ khối [FELO-H] + m/z84 (a) và phân mảnh m/z 384 338 (b)
Kết quả khảo sát lựa chọn nội chuẩn cho thấy:
- Khi sử dụng các mức năng lượng khác nhau để phân mảnh ion mẹ trong kỹ thuật khối phổ 2 lần (MS/MS) cả TMZ, LID và FELO đều tạo ra các mảnh phổ con bền vững, ổn định và có số khối tương ứng là 181 Da (TMZ:
267 181), 86 Da (LID: 235 86) và 338 Da (FELO: 384 338).
- Ở cựng nồng độ 1 àg/ml, lượng mảnh phổ m/z = 338 tạo thành của FELO là khoảng 10 7 gấp khoảng 10 lần lượng mảnh phổ m/z = 181 tạo thành của TMZ và gấp khoảng 10 4 lần lượng mảnh phổ m/z = 86 tạo thành từ LID
- Các điều kiện để tạo mảnh phổ m/z = 338 của FELO tương tự điều kiện tạo mảnh phổ của chuẩn DTZ (điện thế nguồn phun ion, áp suất khí mang, khí bổ trợ, …) nên có thể sử dụng chung điều kiện khối phổ trong phân tích. Trong khi đó điều kiện tạo mảnh phổ m/z 235 86 của LID và m/z 267
KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Để đảm bảo phương pháp đã khảo sát ở trên là thích hợp cho định lượng DTZ trong huyết tương NTN, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích sinh học của FDA và các qui định trong dược điển Mỹ.
3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần vào hệ thống LC-MS/MS mẫu huyết tương tự tạo đã được xử lý (chứa chuẩn DTZ và FELO với nồng độ tương ứng là 100 ng/mL và
250 ng/mL) Từ các sắc đồ thu được xác định thời gian lưu và diện tích pic của DTZ và FELO Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống (SST) được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS.
Stt DTZ FELO t R (phút) Diện tích t R (phút) Diện tích
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy thời gian lưu của DTZ không thay đổi và của FELO thay đổi không đáng kể (0,4 %), với thông số diện tích pic, giá trị CV
% của DTZ và của FELO tương ứng là 4,2% và 3,3 % đều nhỏ hơn 5% Như vậy hệ thống LC – MS với các điều kiện đã chọn ở trên hoạt động ổn định, có độ tái lặp tốt.
3.2.2 Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp
Tiến hành phân tích các mẫu huyết tương theo phương pháp đã xây dựng ở phần 3.1, bao gồm: a 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau; b 06 mẫu LLOQ (mẫu huyết tương trắng có chứa chuẩn DTZ ở nồng độ 5 ng/mL và nội chuẩn FELO).
Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa DTZ và FELO được trình bày ở các hình 3.14 và 3.15 Đáp ứng píc của mẫu trắng so với pic DTZ và FELO được trình bày ở bảng 3.5.
Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa chuẩn DTZ (5 ng/ml) và FELO
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
+ Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (hình 3.14) tại thời điểm 1,7 – 1,8 phút (trùng với thời gian lưu của DTZ và FELO trong mẫu chuẩn – hình 3.15) không xuất hiện các pic có các mảnh phổ khối m/z = 414,5 → 177,8 (đặc trưng cho DTZ) và mảnh phổ khối m/z = 383,4 → 338,1 (đặc trưng cho FELO).
+ Diện tích píc của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của DTZ và FELO đều là 0% (bảng 3.5) Các pic DTZ và FELO ở các mẫu LLOQ đều có tỷ lệ S/N (signal/noise) > 500 (hình 3.15).
Do vậy, phương pháp phân tích DTZ mà chúng tôi xây dựng đáp ứng được
3.2.3 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Phân tích các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương có nồng độ 5; 10; 25; 50; 100; 200; 400 và 500 ng/ml được chuẩn bị như mục 2.3.2.2 , theo qui trình đã xây dựng Xác định sự tương quan giữa nồng độ TMZ trong huyết tương và tỷ lệ diện tích pic DTZ/FELO đo được bằng phương pháp hồi quy tuyến tính với hệ số tỷ trọng 1/nồng độ 2 Kết quả xác định mối tương quan tuyến tính và độ đúng của các mẫu chuẩn (tỷ lệ nồng độ DTZ xác định từ đường chuẩn so với nồng độ DTZ lý thuyết có trong mẫu chuẩn khi pha) được trình bày ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3 Độ tuyến tính của phương pháp thu được sau khi phân tích hồi quy
STT Hệ số a Hệ số b r
Bảng 3.4: Độ đúng, chính xác của các mẫu chuẩn.
Nồng độ lý thuyết (ng/ml) Nồng độ xác định từ đường chuẩn
(ng/ml; Trung bình ± S.D; n=5) Độ đúng
Kết quả thực nghiệm trình bày ở bảng 3.3 và 3.4 cho thấy trong khoảng nồng nồng độ DTZ và tỷ lệ diện tích pic DTZ/FELO với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 Nồng độ DTZ xác định được từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết đều đạt xấp xỉ 100 % (từ 97,8% đến 106,7%); độ chính xác với giá trị CV% từ 1,6% đến 7,5% và đều nằm trong giới hạn cho phép: từ 80 đến 120 % đối với nồng độ thấp nhất và từ 85 đến 115 % cho các nồng độ còn lại Đường chuẩn và khoảng tuyến tính đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu về phân tích thuốc trong dịch sinh học của FDA – Mỹ 2001.
3.2.4 Xác định giới hạn định lượng dưới
Tiến hành phân tích 6 mẫu chuẩn DTZ pha trong huyết tương ở nồng độ thấp nhất của khoảng tuyến tính (nồng độ 5 ng/mL) Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
Mẫu trắng Mẫu chuẩn (5,1 ng/mL)
Nồng độ (a) (ng/mL) Độ đúng (b) (%)
(a) tính từ phương trình hồi qui (b) % so với nồng độ thực
Kết quả ở bảng 3.5 và các sắc ký đồ 3.13, 3.14 cho thấy: tại vị trí có thời gian lưu khoảng 1,7 phút, đáp ứng của mẫu chuẩn có nồng độ 5 ng/mL lớn hơn 5 lần đáp ứng của mẫu trắng Độ chính xác sau 6 lần phân tích với giá trị CV