(Luận văn) nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan đuôi chồn bằng phương pháp nuôi cấy mô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - VÕ HÀ GIANG lu an va n NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ p ie gh tn to d oa nl w an lu ll u nf va LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2010 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - VÕ HÀ GIANG lu NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ an n va tn to p ie gh Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 d oa nl w ll u nf va an lu LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2010 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn lu an n va p ie gh tn to Võ Hà Giang d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun theo chương trình đào tạo Cao học khóa 15, từ năm 2007 - 2010 Trong trình học tập thực đề tài luận văn, tác giả nhận quan tâm, giúp đỡ tập thể cán Khoa Đào tạo sau đại học, thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Nông học trường Đại học Thái Nguyên, Trường Cao đẳng nghề Công nghệ Nông lâm Phú Thọ,… này, tác giả xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Trước hết, tác giả xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngơ Xn Bình người hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tác giả hoàn thành lu luận văn an n va Xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học tn to Nông Lâm Thái Nguyên,… tạo điều kiện giúp đỡ tác giả trình gh thu thập số liệu ngoại nghiệp phục vụ đề tài luận văn p ie Xin gửi lời cảm ơn tới Trường Cao đẳng nghề Công nghệ Nông lâm Phú w Thọ tạo điều kiện thời gian, công việc để tác giả theo học oa nl hoàn thành luận văn d Cuối cùng, tác giả xin chân thành cảm ơn quan tâm, động viên, giúp đỡ lu va an người thân gia đình bạn bè, đồng nghiệp suốt thời gian ll u nf học tập thực đề tài luận văn m oi Thái Nguyên, năm 2010 z at nh Tác giả z l gm @ m co Võ Hà Giang an Lu n va ac th si DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Bảng 2: Bảng 3: Bảng 4: Bảng 5: lu Bảng 6: an n va Bảng 7: to ie gh tn Bảng 8: p Bảng 9: 42 43 45 46 48 51 53 54 56 57 d oa nl Bảng 10: w Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan chồn Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô 59 61 ll u nf va an Bảng 12: lu Bảng 11: oi z at nh Bảng 14: m Bảng 13: 64 66 z 69 m co l gm @ Bảng 15: an Lu n va ac th si DANH SÁCH BẢNG BIỂU lu an n va p ie gh tn to Bảng 1: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 2: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 3: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 4: Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Bảng 5: Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 6: Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 7: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 8: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 9: Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 10 Bảng 10: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 11 Bảng 11: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 12 Bảng 12: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 13 Bảng 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 14 Bảng 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 15 Bảng 15: Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Đồ thị 1: lu an n va 42 43 45 46 48 51 53 54 p ie gh tn to Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Đồ thị 2: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Đồ thị 3: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Đồ thị 4: Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 5: Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 6: Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 7: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 8: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 9: Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Đồ thị 10: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Đồ thị 11: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Đồ thị 12: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Đồ thị 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Đồ thị 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Đồ thị 15a: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm Đồ thị 15b: Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiều cao số vườn ươm 56 d oa nl w 57 61 ll u nf va an lu 59 oi m 64 z at nh 66 z m co l gm @ 69 69 an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KỸ HIỆU lu an n va : 6- Benzyl amino purin CNSH : Công nghệ sinh học CT : Công thức CR : Cà rốt Đ/c : Đối chứng MS : Murashige & Skoog MT : Môi trường NAA : Naphtyl axetic axit ND : Nước dừa IAA : Indol axetic axit tn to BAP : Khoai tây : Kích thích sinh trưởng : Tỷ lệ w TL p ie gh KT KTST : Than hoạt tính VW : Vacin&Went ∑ : Tổng d oa nl THT ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si Chương I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần với sách mở rộng đầu tư mặt Nhà nước, đời sống vật chất tinh thần người dân ngày cải thiện nâng cao Song song với nhu cầu vật chất nhu cầu tinh thần đặc biệt thiếu Từ lâu người thích trồng hoa, cảnh vừa để trang trí cho đẹp, vừa để giải trí tinh thần Mỗi người có sở thích chơi hoa khác việc lựa chọn loài hoa thường tùy thuộc vào điều kiện khí hậu vùng, vẻ đẹp hoa, lu Hoa Phong lan loài hoa nhiều người ưa thích hoa lan có cấu an n va trúc kiêu kỳ phức tạp, có màu sắc quyến rũ đa dạng như: đỏ, cam, vàng, to tím, Hoa Phong lan chơi chậu, cắm thành lãng, đặt phòng làm gh tn việc, phịng khách, p ie Tuy nhiên diện tích trồng hoa Phong lan nước thấp, chất w lượng hoa chưa cao, chủ yếu trồng số địa phương có điều kiện như: oa nl Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phịng, Thành Phố Hồ Chí Minh Hiện nay, số nơi d sản xuất nhân số giống lan phương pháp nuôi cấy mô lu an giá thành cao, chí phí vận chuyển lớn Mà hoa Phong lan rừng hoa u nf va năm lần chủ yếu vào mùa hè, chóng tàn, khó điều khiển hoa nở ll theo ý muốn Nguyên nhân việc hạn chế : Do giống chất m oi lượng, chưa tạo giống có khả điều khiển hoa theo ý muốn, z at nh giá thành giống cao, kỹ thuật trồng chăm sóc cịn hạn chế, đầu tư cho trồng trọt cịn thấp Trong ngun nhân giống yếu tố hạn chế lớn z gm @ phát triển sản xuất hoa Phong lan l Hoa phong lan có giá trị thương mại lớn, chủ yếu giống Đai m co Châu, Đuôi chồn lan hài, giá dao động, nguồn lan khai thác ngày cạn kiệt nên giá ln có chiều hướng tăng cao 1kg lan Đai Châu an Lu Đuôi chồn lên tới 100.000 đến 150.000 VNĐ/kg 10.000 đến n va 20.000 VNĐ cho Với loại lan quý lên tới 200.000 ac th si đến 300.000 VNĐ cho Những năm trước lan rừng buôn bán nhiều với giá rẻ với thu nhập trung bình người lao động mua trồng lan rừng làm cảnh Hiện mức độ khai thác cạn kiệt gây ảnh hưởng tới nguồn gen làm tăng giá Lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) loài lan rừng người chơi lan ưa chuộng hoa đẹp hương thơm Hiện khu rừng Việt Nam, loài lan rừng bị khai thác mức, có nguy cạn kiệt, hai lồi lan rừng Đuôi Chồn Đai Châu khai thác nhiều cho mục đích thương mại có nguy dần tự nhiên Việc nghiên cứu phát triển loài lan nêu trên, vừa bảo tồn có khả nhân lu giống cho mục tiêu thương mại cần thiết Trong hai loài lan nêu trên, loài an n va lan Đai Châu nghiên cứu nhiều có số kết nhân to giống invitro Lồi lan Đi Chồn chưa nghiên cứu nhiều, gh tn nghiên cứu nhân giống Từ thực tế trên, việc nghiên cứu nhân giống lan Đuôi p ie Chồn cần thiết, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu kỹ w thuật nhân giống lan đuôi chồn phương pháp nuôi cấy mô” Kết oa nl nghiên cứu tạo tiền đề cho triển khai sản xuất giống hoa Lan Đuôi Chồn nuôi d cấy mô tỉnh Thái Nguyên lu u nf va * Mục đích: an 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài ll Nhân giống lan rừng đuôi chồn chất lượng cao (cây giống khoẻ, sinh m oi trưởng phát triển tốt, bệnh), giá thành hạ, phục vụ cho sản xuất hoa Phong nhập cho người dân địa bàn tỉnh z at nh Lan khu vực Thái nguyên tỉnh lân cận Tạo điều kiện cho việc tăng thu z gm @ *Yêu cầu đề tài: l - Nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng tới hiệu khử trùng mẫu m co cấy ( hạt hoa phong lan Đuôi chồn) - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt an Lu lan Đuôi chồn n va ac th si Kết thu bảng 12 đồ thị 12 cho thấy: Trong tất cơng thức thí nghiệm rễ đạt tỷ lệ 100% Chứng tỏ rằng: chồi hoa lan Đuôi chồn rễ mơi trường Mặc dù tỷ lệ rễ khơng có khác biệt cơng thức có khơng bổ sung NAA số rễ/cây, số rễ hữu hiệu/cây chiều dài rễ/cây lại có khác biệt Số rễ/cây dao động từ 6,35 rễ đến 18,2 rễ xếp theo thứ tự giảm dần so sánh duncan a, b, c, d, e Theo so sánh duncan: công thức có số lượng rễ/cây đạt cao 18,2 rễ mức “a”; cơng thức có số lượng rễ/cây 10,2 rễ mức “d”; công thức cơng thức có số rễ/cây cao công thức xếp mức “b” “c”; cơng thức (khơng bổ sung NAA) có số lu rễ/cây thấp 6,35 rễ xếp mức “e” an n va Chiều dài rễ/cây dao động từ 0,82 cm đến 5,08 cm xếp theo thứ tự to giảm dần vào nhóm phân mức so sánh duncan a, b, c, d, e Trong gh tn đó, cơng thức có số chiều dài rễ/cây đạt cao 5,08 cm, công thức p ie (khơng bổ sung NAA) có chiều dài rễ/cây 1,5 rễ mức “d”, công thức có w chiều dài rễ/cây 3,88 cm mức “b”, cơng thức có chiều dài rễ/cây 3,12 d “c” oa nl cm thấp công thức cao công thức (không bổ sung NAA) mức lu an Số rễ hữu hiệu/cây dao động từ 3,0 rễ đến 17,4 rễ xếp theo thứ tự u nf va giảm dần so sánh duncan a, b, c, d, e Theo so sánh duncan: cơng ll thức có số lượng rễ hữu hiệu/cây đạt cao 17,4 rễ mức “a”; cơng m oi thức có số rễ hữu hiệu/cây thấp công thức đạt 13,5 rễ mức “b”, z at nh công thức công thức thấp công thức xếp theo thứ tự mức “c” “d” Công thức (khơng bổ sung NAA) có số rễ hữu hiệu/cây z gm @ thấp đạt 3,0 rễ mức ‘e” l Với tiêu cảm quan màu sắc rễ cơng thức cơng thức m co có rễ màu xanh, thích hợp cho sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm Công công thức 2, cho rễ màu vàng, khơng thích hợp cho an Lu sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm n va ac th 69 si Từ kết ta thấy: chồi hoa lan Đi chồn sinh trưởng mơi trường có khả tự phát sinh rễ Tuy nhiên chất lượng rễ lại chịu chi phối nồng độ NAA Nếu nồng độ NAA thích hợp có giúp chồi phát sinh rễ tốt (số lượng, chiều dài màu sắc rễ phù hợp), nhiên nồng độ cao ức chế sinh trưởng rễ thể số rễ giảm chiều dài rễ giảm, rễ có tượng nâu hóa Như vậy: cơng thức số có bổ sung 0,5 mg NAA/l vào mơi trường (MS + 30 gram saccarose/lít + 6.5 gram agar/lít, pH = 5.8) thích hợp để tạo hồn chỉnh cho chồi hoa lan Đi chồn Thí nghiệm 13: Ảnh hưởng IAA đến khả rễ lan Đuôi lu chồn an n va Kết thu bảng 13 đồ thị 13 cho thấy: Trong tất to công thức thí nghiệm rễ đạt tỷ lệ 100% Chứng tỏ rằng: chồi hoa gh tn lan Đi chồn rễ môi trường Mặc dù tỷ lệ rễ p ie khơng có khác biệt cơng thức có khơng bổ sung IAA w số rễ/cây, số rễ hữu hiệu/cây chiều dài rễ/cây lại có khác biệt Cụ thể oa nl là: d Bảng 13: Ảnh hưởng IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Tỷ lệ Số rễ Số rễ hữu Chiều dài TB/cây hiệu rễ (cm) 8,32e 1,95e 1,37d Vàng Màu sắc rễ rễ (%) 0,0 100 0,5 100 15,65b 12,55b 3,88b Xanh đậm 1,0 100 18,1a 16,85a 5,19a Xanh đậm 2,0 100 13,2c 9,95c 3,11c Vàng xanh 2,5 100 11,1d 6,65d 0,65e Vàng 2,3 2,5 3,6 oi m z at nh z @ m co l CV% ll IAA (mg/l) gm u nf va Nồng độ an lu CT (sau tháng nuôi cấy) an Lu (a, b, c, d, e – mức phân nhóm so sánh Duncan) n va ac th 70 si 20 18 Số rễ TB/cây(rễ) 14 12 10 lu Chiều dài rễ(cm) 16 an n va tn to Cơng thức thí nghiệm p ie gh Chiều dài rễ (cm) oa nl w Số rễ TB/cây d Đồ thị 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến số lượng rễ TB/cây chiều dài an lu rễ lan Đuôi chồn (sau tháng nuôi cấy) u nf va Số rễ/cây dao động từ 8,32 rễ đến 18,1 rễ xếp theo thứ tự giảm ll dần so sánh duncan a, b, c, d, e Theo so sánh duncan: cơng thức có số oi m lượng rễ/cây đạt cao 18,1 rễ mức “a”; công thức công thức z at nh (không bổ sung IAA) có số lượng rễ/cây 11,1 rễ 8,32 rễ mức “d” “e”; công thức cơng thức có số rễ/cây cao cơng thức công thức z gm @ xếp mức “b” “c” có số rễ/cây 15,65 rễ 13,2 rễ Số rễ hữu hiệu/cây dao động từ 1,95 rễ đến 16,85 rễ xếp theo thứ l m co tự giảm dần so sánh Duncan a, b, c, d, e Theo so sánh Duncan: cơng thức có số lượng rễ hữu hiệu/cây đạt cao 16,85 rễ mức “a”; công thức an Lu công thức (khơng bổ sung IAA) có số rễ hữu hiệu/cây 6,65 rễ 1,95 n va rễ mức “d” “e”; cơng thức cơng thức có số rễ hữu hiệu/cây cao ac th 71 si công thức công thức 5, tthấp công thức xếp mức “b” “c” có số rễ hữu hiệu/cây 12,55 rễ 9,95 rễ Như chênh lệch công thức lớn Chiều dài rễ/cây dao động từ 0,65cm đến 5,19 cm xếp theo thứ tự giảm dần vào nhóm phân mức so sánh duncan a, b, c, d, e, f, g Trong đó, cơng thức có số chiều dài rễ/cây đạt cao 5,19 cm mức “a”, công thức (không bổ sung IAA) có chiều dài rễ/cây 1,37cm mức “d”, cơng thức có chiều dài rễ/cây 3,88 cm mức “b”, cơng thức có chiều dài rễ/cây ngắn công thức lớn công thức có chiều dài 3,11cm mức “c” Với tiêu cảm quan màu sắc rễ cơng thức 2, 3, có rễ màu lu xanh thích hợp cho sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm Công an n va thức cơng thức cho rễ màu vàng, khơng thích hợp cho sinh trưởng, Từ kết ta thấy: chồi hoa lan Đuôi chồn sinh trưởng môi trường gh tn to phát triển giai đoạn vườn ươm p ie có khả tự phát sinh rễ Tuy nhiên chất lượng rễ lại chịu chi phối w nồng độ IAA Nếu nồng độ IAA thích hợp có giúp chồi phát sinh rễ tốt oa nl (số lượng, chiều dài màu sắc rễ phù hợp), nhiên không bổ sung bổ d sung với nồng độ IAA cao ức chế sinh trưởng rễ thể số rễ giảm lu an chiều dài rễ giảm, rễ có tượng nâu hóa u nf va Như vậy: cơng thức số có bổ sung mg/l IAA vào môi trường (MS + ll 30 gram saccarose/lít + 6.5 gram agar/lít, pH = 5.8) thích hợp để tạo m oi hồn chỉnh cho chồi hoa lan Đi chồn z at nh Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi Chồn z gm @ Bảng 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả NAA (ml/l) (ml/l) 0,3 0,3 Số cây/bình rễ/cây 5.45 Số rễ hữu Chiều hiệu 3.20 dài rễ Chất lượng rễ (cm) (Màu sắc) 0.72 Xanh đậm n va IAA Số an Lu Nồng độ m co CT Nồng độ l rễ lan Đuôi Chồn (sau tháng nuôi cấy) ac th 72 si Nồng độ Nồng độ IAA NAA (ml/l) (ml/l) 0,3 0,5 9.95 9.40 4.24 Xanh đậm 0,3 1,0 5.15 3.40 2.54 Vàng nhạt 0,5 0,3 4.35 2.85 2.54 Xanh 0,5 0,5 3.53 2.25 1.72 Xanh vàng 0,5 1,0 3.60 2.15 0.76 Vàng 1,0 0,3 5.40 3.35 2.52 Xanh vàng 1,0 0,5 9.35 8.55 4.18 Vàng 1,0 1,0 5.95 3.90 2.72 Vàng đậm CT Số Số cây/bình rễ/cây lu an 5,5 Chiều hữu dài rễ hiệu (cm) 7,5 Chất lượng rễ (Màu sắc) 7,4 n va CV% Số rễ 4.5 gh ie 10 nl w 2.5 oa d lu 1.5 va an Số rễ TB/cây p 3.5 u nf 0.5 ll m oi z at nh Chiều dài rễ (cm) tn to 12 Cơng thức thí nghiệm Chiều dài rễ (cm) z Số rễ TB/cây gm @ Đồ thị 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả l m co rễ lan Đuôi Chồn (sau tháng nuôi cấy) Qua kết thu bảng 14 đồ thị 14 ta thấy: Sau tháng nuôi cấy an Lu lan Đi chồn có phối hợp nồng độ NAA IAA khả rễ n va cơng thức có khác ac th 73 si Công thức công thức cho số rễ/cây chiều dài rễ cao CT2: 9,95 rễ/cây chiều dài TB rễ 4,24cm CT2: 9,35 rễ/cây chiều dài TB rễ 4,18cm Công thức cơng thức có số rễ/cây chiều dài rễ thấp Tương ứng CT5: 3,53 rễ/cây, rễ dài 1,72cm, CT6: 3,6 rễ/cây chiều dài rễ đạt 0,76cm Các cơng thức cịn lại có số rễ dao động từ 4,35 đến 5,95 rễ/cây chiều dài rễ từ 0,76 đến 2,54 cm Cơng thức có số rễ/cây tương đối cao chất lượng rễ tốt chiều dài rễ ngắn so với công thức khác Đặc biệt số rễ/cây chiều dài rễ công thức tương đương chất lượng rễ CT2 tốt công thức Điều chứng tỏ nồng độ Cytokinin ảnh hưởng đến chất lượng rễ Khi nồng độ cao chất lượng rễ giảm Vì lu việc lựa chọn nồng độ Cytokinin nhân giống lan Đuôi Chồn an n va quan trọng Xác định nồng độ cho hiệu cao chất lượng tốt, tiết Như vậy: cơng thức số có bổ sung phối hợp 0,3 mg/l IAA 0,5 mg/l NAA gh tn to kiệm hóa chất p ie vào mơi trường (MS + 30 gram saccarose/lít + 6.5 gram agar/lít, pH = 5.8) d oa nl w thích hợp để tạo hoàn chỉnh cho chồi hoa lan Đuôi chồn ll u nf va an lu oi m z at nh z gm @ nhau, sau tháng ni cấy m co l Hình ảnh 4: Cây rễ mơi trường MS có bổ sung NAA nồng độ khác 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng an Lu sau nuôi cấy mô n va ac th 74 si Thí nghiệm 15: Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô Đưa giá thể giai đoạn cuối trình nhân giống Trong giai đoạn đưa từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên việc lựa chọn giá thể thích hợp cho sinh trưởng phát triển quan trọng Mỗi giá thể có đặc tính khác Mỗi lồi trồng khác giai đoạn vườn ươm phụ có yêu cầu khác điều kiện ngoại cảnh Nhìn chung, giá thể tốt giá thể có khả giữ ẩm tốt, nước tốt có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn đầu tiếp cận với môi trường sống tự nhiên Lan Đi Chồn sau ni cấy mơ có u cầu chặt điều kiện môi lu trường, độ ẩm phải lớn không bị úng, nhiệt độ môi trường không cao, an n va giá thể có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn to vườn ươm Để xác định giá thể phù hợp, tiến hành thử nghiệm loại giá Bảng 15: Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng p ie gh tn thể kết thu bảng sau: Số lá/cây (lá) 80,00b 1,33b 1,20b 93,33a 3,27a 1,73a 66,67c 1,19c 1,00c 53,33d 1,12c 0,70d 40,00e 0,19e 0,27f 26,67f 0,83d 0,40e lu Chiều cao (cm) oi d z at nh Xơ dừa Than củi + Xơ dừa (1:1) ll Dớn + Xơ dừa (1:1) Than củi u nf va an Dớn + Than củi (1:1) Dớn Sau 60 ngày Tỷ lệ sống (%) m Giá thể oa CT nl w sau nuôi cấy mô z CV(%) 9,2 m co l gm @ 13,9 4,0 (a,b,c,d,e,f – mức phân nhóm so sánh Duncan) an Lu n va ac th 75 si 100 90 80 70 60 Tỷ lệ (%) 50 40 30 20 10 Tỷ lệ sống (%) lu an n va tn to p ie gh Giá thể 1.8 d 1.2 u nf ll 1.5 1.4 va an 0.8 0.4 0.2 z 0.6 z at nh 0.5 oi m Biến động chiều cao lu 2.5 1.6 Biến động số oa 3.5 nl w Đồ thị 15a: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm Giá thể m co l gm @ Chiều cao (cm) Số lá/cây (lá) an Lu Đồ thị 15b: Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiểu cao số n va vườn ươm ac th 76 si Theo bảng 15 đồ thị 15a, 15b cho thấy: Các giá thể khác cho thấy khả sống sinh trưởng khác nhau: Giá thể xơ dừa: Xơ dừa ngấm nước nhanh giữ độ ẩm lâu xơ dừa chứa nhiều muối nên trước trồng cần phải ngâm nước vài ngày sau xả trồng Qua kết công thức cho thấy: ngày phát triển tương đối tốt xơ dừa có khả nước tốt song giữ nước dễ bị nhiễm nấm bệnh, ốc sên … làm hại rễ dẫn đến không hấp thụ dinh dưỡng nên khơng thích hợp với hoa lan Đi Chồn nên chết nhiều sau 60 ngày, đồng thời mảnh lu yếu Tỷ lệ sống đạt 40,00% (ở mức “e” so sánh duncan), biến động an chiều cao số thấp tương ứng 0,19 cm 0,27 cm va n Giá thể than củi + xơ dừa (cơng thức 6) có khả nhanh, rễ nhanh khô to gh tn chứa muối than nên ảnh hưởng nhiều tới rễ ảnh hưởng đến ie phát triển chiều cao khả Tỷ lệ sống đạt 26,67% p thấp nhất, chiều cao số biến động khơng đáng kể, chí cịn thấp, nl w mức “d”, “e” so sánh Duncan d oa Giá thể than củi (công thức 4) nước nhanh nên hệ rễ nhanh khơ, cần an lu phải tưới nước nhiều Tuy tỷ lệ sống cao công thức ( 53,33% mức u nf va “d” so sánh Duncan) biến động chiều cao số ít, mức “c” ( biến động chiều cao) mức “d” biến động số ll oi m Giá thể dớn + xơ dừa ( công thức 3) cho tỷ lệ sống đạt 66,67% xếp z at nh vào kênh “c” so sánh Duncan Cây 20 ngày đầu sinh trưởng yếu, sau có tượng sinh trưởng trở lại không mạnh nên biến động chiều cao z gm @ số không đáng kể Biến động chiều cao mức “c” với công thức 4, biến l động số đạt mức “c” so sánh Duncan m co Giá thể công thức ( dớn + than) cơng thức (Dớn) có tỷ lệ sống an Lu cao (công thức 93,33% - mức “a” so sánh Duncan) cao thứ (công thức 80,00% - mức “b” so sánh Duncan) Cây xuất nhiều n va tăng trưởng chiều cao tốt Trong giá thể tốt giá thể ac th 77 si công thức (Rong biển), cho tỷ lệ mẫu sống đạt 93,33% (ở kênh “a” so sánh duncan) Giá thể cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho con, có khả giữ nước tốt sau 60 ngày trồng giá thể cho phát triển khỏe mạnh, cứng cáp, màu xanh thẫm, xuật nhiều non Một điểm đáng lưu ý trồng giá thể phải thường xuyên ý độ ẩm, tránh tượng bị úng Như vậy, giá thể thích hợp cho lan Đuôi Chồn giai đoạn vườn ươm giá thể Dớn ( rong biển) Dớn có giá trị chúng có cấu trúc dạng sợi, dài, dù dạng khô hay tươi Các sợi rong biển dù khô hay tươi bền, chắc, khó bị phân hủy nên q trình trồng bị thay chất lu trồng khác nhờ vào cấu trúc phenolic bám thành tế bào Dớn có khả an n va giữ nước lớn gấp 20 lần trọng lượng khơ chúng Dớn có khả hấp to thu nước thải cation H+ giúp điều hịa acid mơi trường đồng thời gh tn tạo khả diệt khuẩn tự nhiên, tốt cho phát triển vùng rễ Dớn có khả p ie trao đổi caton lớn, chúng sử dụng nhân giống w trồng dạng sợi hay dạng vụn nên chúng có khả vận chuyển chất oa nl dinh dưỡng tốt Ngồi chúng cịn có số thành phần kháng khuẩn tự d nhiên giúp ức chế tăng trưởng số nấm bệnh [35] ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va Hình ảnh 5: Cây trồng giá thể rong biển ac th 78 si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: Sau tiến hành thí nghiệm đề tài xin đưa số kết luận sau nhân giống hoa lan Đuôi Chồn phương pháp nuôi cấy mô sau: Phương pháp khử trùng lan Đuôi Chồn để sử dụng hạt làm mẫu cấy nhân giống in vitro có hiệu tương đối tốt phương pháp: xử lý với Clorox nồng độ 7% 10 phút, khử trùng nước H2O2 nồng độ 10% 20 phút, khử trùng Ca(OCL2) nồng độ 10% 10 phút, khử trùng phương pháp nhúng cồn đốt nhanh cho hiệu cao Môi trường phù hợp giúp cho hạt nảy mầm mơi trường: ½ MS, MS lu Hyponex Bổ sung Kinetin (mg/l) 0,1 + BAP (mg/l) 0,3 vào môi trường MS + 30g an n va đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than to tn hoạt tính + 6g agar ( tính để pha cho lít mơi trường ni cấy), pH = 5,8 ie gh thích hợp cho q trình nảy mầm hạt lan Đi Chồn p Bổ sung Kinetin (mg/l) 0,5 + BAP (mg/l) 0,3 vào môi trường MS + 30g nl w đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than d oa hoạt tính + 6g agar ( tính để pha cho lít mơi trường ni cấy), pH = 5,8 an lu thích hợp cho q trình nảy mầm hạt lan Đuôi Chồn u nf va Bổ sung NAA (mg/l) 0,5 vào môi trường MS + 30 g saccarose/lít + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 2g than hoạt tính + 6g agar, pH = 5,8 mang lại ll oi m hiệu rễ tốt giai đoạn tạo hoàn chỉnh từ lan Đuôi Chồn z at nh Giá thể hoa lan Đuôi Chồn nuôi mô tốt đồi với giai đoạn vườn ươm giá thể rong biển z 5.2 Đề nghị @ gm Đưa giống hoa lan Đuôi Chồn nuôi cấy mơ ngồi sản xuất đồng ruộng m co l để khảo sát sinh trưởng, phát triển suất, chất lượng hoa Khảo sát quy trình số giống hoa lan khác sản xuất như: an Lu Vanda, Đai Châu,… n va ac th 79 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Nguyễn Công Nghiệp (1998), Trồng hoa lan, NXB trẻ TP Hồ Chí Minh Đặng Thị Thanh Hương, 2002 Nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền phương pháp nuôi cấy in vitro, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường đại hoc Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa kỹ thuật trồng hoa, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Văn Bảo (1999), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, Nxb Trẻ lu an Hội lan Hà Nội ( 2005) Sổ tay người trồng lan, NXB NN Hà Nội n va Đỗ Năng Vịnh, 2005 Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng NXB Nông tn to Nghiệp ie gh Đỗ Năng Vịnh, 2002 CNSH trồng NXB Nông Nghiệp p Vũ Văn Vụ- Nguyễn Mộng Hùng- Lê Hồng Điệp, 2006- Công nghệ sinh nl w học NXB Giáo dục R.L.M Pierik (1978) In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff u nf va Publishers an lu d oa Tài liệu nước ll 10 Arditti (1982), Orchild Biology Reviews and perspective II Cornell Univ Press, Ithaca: 1-310 11 Flamee (1978) Am Orchid Soc.Bull.47: 419-423 oi m z at nh 12 Ha Tieu De, Trieu Thong Nhat, Lo Kim Vu, 2000, gerbera flower NXB z KHKT Giang To, Trung Quoc @ gm 13 Sungkumlong and chitta Ranjan Deb (2007) Effects of different factors l on immature embryo culture, PLBs diffrentiation and rapid mass an Lu Experimental Biology, Vol.46,pp.243-248 m co miltiplication of Coelogyne suaveolens (Lindl) Hook Indian Journal of n va ac th 80 si 14 Street (1973), Plant tissue and cell culture, Bor Monogrvol, II Black Well Scient, Publ, London lu an n va tn to 15 Saima Anjum, Muhammad Zia and M.Fayyaz Chaudhary (2005) Investigations of different strateges for high frequency regeneration of Dendrobium malones Victory African Journal of Biotechnology Vol.5(19),pp 1738 – 1743 16 K Kalimuthu, R Senthilkumar and S Vijayakumar (2006) In vitro micropropagation of orchid, oncidium sp.(Dancing Dolls), African Journal of biotechnology Vol.6 (10),pp.1171-1174 17 Knudson (1992) Use of seed for orchid propagation in vitro Bot Gaz.73: 1-25 18 Ting-yu Chen, Jen-Tsung Chen & Wei-Chin Chang (2002) Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids Plant Cell,Tissue and Organ Culture 76: 11-15 19 T Dennis Thomas and Alwin Michael (2007) High- frequency plantlet regeneration and multiple shoot induction from cultured immature seeds of Rhynchostylis retuna Blume Plant Biotechnol Rep, 1:243-249 20 Bermard (1909).Bud diffrentiation of wild orchid Ann Sci Bot.9:1-196 p ie gh 21 Li-ru Chen, Jen-Tsung Chen and Wei-Chin Chang (2002) Efficient production of protocorm-like bodies and pland regeneration from flower stalk explants of the soympodial orchid epidendrum radicans In vitro Cell.Dev.Biol-Plant 38:441-445 22 Zhi-Ying Li and Li Xu (2009) In vitro propagation of white-flower mutant of Rhynchostylis gigantea (Lindl.) Ridl through immature seedderived protocorm-like bodies, Journal of Horticulture and Forestry Vol 1(6) pp 093-097 23 Niknejad Azadeh, M.A Kadir, S.B Kadzimin, N.A Abdullah (2009) In vitro plant regeneration from protocorms-like bodies (PLBs) and callus of Phalaenopsis gigantea (Epidendroideae: Orchidaceae), The 6th National Biotechnology Congress of Iran, Milad Tower Conference Hall, Tehran-Iran 24 S P Viji, Anil sood, and K K Plaha (1984) propagation of Rhynchostylis retuna BL (orchidaceae) by direct organogenesis from segment culture, Bot Gaz 145 (2):210-214 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 81 si MỤC LỤC lu an n va p ie gh tn to CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài: 10 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………… 11 2.1 Nguồn gốc, phân loại hoa Phong lan 11 2.2 Đặc điểm sinh vật học hoa phong lan 13 2.3 Yêu cầu sinh thái hoa phong lan 14 2.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa phong lan Thế giới 15 2.5 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa phong lan Việt Nam 16 2.6 Một số kết nghiên cứu nhân giống hoa phong lan 17 2.7 Một số kết nghiên cứu trồng chăm sóc hoa phong lan 20 2.8 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 2.8.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 2.8.2 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 2.8.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 23 2.8.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 26 2.8.5 Các công đoạn nuôi cấy mô tế bào 33 2.8.6 Nhân giống vơ tính in vitro – ưu nhược điểm phương pháp 34 2.9 Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa 36 CHƯƠNG III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1 Vật liệu nghiên cứu 38 3.2 Nội dung nghiên cứu 38 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.4 Xử lý số liệu: 47 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng tới tỷ lệ sống mẫu cấy (hạt lan Đuôi chồn) 48 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) 54 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ số Cytokynin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn 57 4.4 Kết qủa nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi lan Đuôi Chồn 62 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 67 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô 74 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 5.1 Kết luận: 79 5.2 Đề nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 82 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 83 si