Tổng quan về cảm biến sinh học biosensor

Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh khái niệm điện cực sinh học (Biosensor) có cơng bố điện cực Oxy Dựa kinh nghiệm tâm huyết mình, ơng phát triển lĩnh vực phân tích giúp đo lường thể Năm 1962, Hội nghị Khoa học Viện hàn lâm New York, ông có diễn thuyết: “Làm để điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn” Trong đó, ơng trình bày cách làm điện cực điện hóa thơng minh cách thêm enzym vào máy chuyển đổi bánh sandwich bao bọc lớp màng Năm 1975, ý tưởng Clark trở thành thực với công bố công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) máy phân tích glucose dựa việc đo dòng điện hydro peroxide Đây lần phịng thí nghiệm giới phân tích dựa Biosensor Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm bước Divis đề xuất vi khuẩn dùng yếu tố sinh học điện cực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser – LA640) sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan để chuyển electron từ lactatdehydrogenase tới điện cực Mặc dù không thành công thương trường bước đột phá quan trọng cho hệ Biosensor ứng dụng thể thao chẩn đoán lâm sàng Năm 1987, điện cực enzym screen-printed công bố Medisense (Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước bút cho phép giám sát lượng glucose máu nhà Điện cực thiết kế lại làm cho thông dụng số lượng bán Medisense đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 họ Abbort mua lại Hiện Hãng Boehringer, Manheim Bayer cạnh tranh gay gắt Biosensor lượng bán ba công ty chiếm ưu thị trường Biosensor giới tới 85% 1.2 KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR Biosensor thực chất thiết bị phân tích chuyển tín hiệu sinh học thành tín hiệu điện Đầu tiên, Biosensor nhận dạng tượng biên dịch thành đặc tính định lượng được, sau đặc tính định lượng chuyển đổi thành tín hiệu điện biến Trong Biosensor, tượng nhận dạng http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor hệ thống sinh học gọi quan thụ cảm sinh học (bioreceptor) Hệ thống tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây phản ứng tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt chất phân tích Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo biosensor Chú thích: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển chất (S) thành sản phẩm (P) Bộ biến (b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện biến Bộ vi xử lý tín hiệu (d) Màn hình hiển thị (e) 1.3 ĐẶC ĐIỂM – YÊU CẦU CỦA BIOSENSOR Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả lặp lại, khả tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính thời gian đáp ứng tín hiệu tốt Các phép đo có độ lặp lại tốt hai loạt kết thu tương tự thực người phân tích, sử dụng biosensor mẫu phân tích Phương pháp đo có khả tái sử dụng cao kết trước đạt tiến hành phân tích lặp lại lần hai Tính chọn lọc biosensor thể khả nhận hợp chất đơn hỗn hợp cấu tử mẫu, khả phụ thuộc vào quan thụ cảm sinh học biến Một biosensor có tính chọn lọc cao thành phần tạp chất mẫu thấp Tính nhạy cảm biosensor thể thay đổi lượng gây thay đổi tín hiệu trả lời: Da = s Dm http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Trong Da : Độ dao động biên độ dòng Dm : Độ dao động biên độ dòng vào s : Độ nhạy cảm biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp biosensor ứng dụng cụ thể Đối với Biosensor đo điện biên độ tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite nồng độ chất phân tích Theo định luật Nernst: Da = s D(logc) Vùng tín hiệu tuyến tính thu đường cong hiệu chỉnh tín hiệu trả lời với nồng độ khác chất phân tích Đường cong thật có ý nghĩa tiến hành hiệu chỉnh hai loạt nồng độ tăng giảm Đường cong hiệu chỉnh gọi tốt tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian Thời gian đáp ứng dài chất đường cong hiệu chỉnh, cho biết phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm thay đổi nồng độ 1.4 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR Các chất cần phân tích mẫu phân tích vào điện cực Màng (external membrane) biosensor cho chất cần phân tích thấm qua Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, quan) phản ứng với chất cần phân tích tạo đáp ứng mà biến (transducer) phát Các thành phần sinh học thực hoạt động sau: Biến đổi chất cần phân tích thành chất hóa học khác thơng qua phản ứng sinh hóa (biểu diễn vịng trịn rỗng sơ đồ) Giải phóng sản phẩm hóa học từ tạo tác nhân kích thích Thay đổi đặc tính quang học, điện học, học Tạo số đáp ứng khác với lượng đo Cịn có số màng khác gần phận transducer, màng có đặc tính thấm khác so với màng bên ngồi Tín hiệu điện cực thường phụ thuộc vào loại biến mà sử dụng http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Hình 1.2: Nguyên lý hoạt động chung Biosensor: - Chất cần phân tích - Tác nhân kích thích (chất tạo tín hiệu) Bảng 1.1: Một số điện cực enzym thường sử dụng Điện cực để xác định Enzym Sản phẩm Glucose Glucooxydase catalase H2O2, O2 Saccarose Lactose Rượu Ure Pennicillin Invertase, glucooxydase b-galactosidase, glucooxydase Alcoloxydase Urease Pennicillinase H2O2 H2O2 H2O2 NH4+, CO2 H+ CHƯƠNG PHÂN LOẠI BIOSENSOR 1.1 ĐIỆN CỰC ĐIỆN HÓA (Electrochemical biosensor) 2.1.1 Điện cực đo điện (potentiometric biosensor) Điện cực đo điện hoạt động dựa nguyên tắc xác định khác điện điện cực đo (probe electrode) điện cực so sánh (reference electrode) (là điện cực có điện không đổi) Sự khác điện hai điện cực hàm hoạt http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor độ ion dung dịch điện phân nơ đặt điện cực (điều kiện hoạt động điện cực đo điện khơng có dịng điện mạch đo, người ta gọi điện cực có dịng điện không) Điện xác định theo phương trình Nerst: E = E0 + Trong đó: α RT × ln nF α2 Eo: Điện oxy hóa-khử tiêu chuẩn; R: Hằng số khí; T: Nhiệt độ tuyệt đối; F: số Faraday; N: số điện tử trao đổi chất; a1, a2: Hoạt độ dung dịch lớp màng điện cực Điện cực đo (probe electrode): Điện cực đo điện cực có tham gia phản ứng điện hóa với cấu tử cân điện Điện cực đo phải điện cực thiết lập đủ nhanh có độ xác cao Trong điện cực điện hóa, điện cực đo thường dùng điện cực màng điện cực khí Điện cực khí: Điện cực cấu tạo kim loại trơ Pt, Au…tiếp xúc đồng thời với khí dung dịch chứa ion tương ứng với khí Trên thị trường có điện cực khí hydro, điện cực Oxy, điện cực khí clo sử dụng rộng rãi Điện cực màng chọn lọc ion: Điện cực màng chọn lọc thông thường bán pin có lớp màng phân cách dung dịch cần phân tích với dung dịch chuẩn bên Nguyên tắc hoạt động điện cực màng dựa vào xuất đại lượng điện bề mặt màng phân cách phản ứng điện hóa kèm theo vận chuyển ion Màng có tác dụng thuận nghịch với ion hay nhóm ion dung dịch cách chọn lọc Điện cực thủy tinh điện cực điển hình loại điện cực màng Tất loại điện cực màng phải đáp ứng yêu cầu bắt buộc sau đây: Màng phải không tan dung dịch cần phân tích Để đáp ứng điều này, màng phải cấu tạo từ chất có phân tử lượng lớn thủy tinh silicate nhựa polymer http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Màng chọn lọc phải có độ dẫn điện Độ dẫn điện thường tạo nhờ vào dịch chuyển ion hóa trị bên màng Màng vài phần tử chứa khung màng phải có khả tác dụng chọn lọc với ion cần khảo sát theo nguyên tắc: trao đổi ion, kết tinh hay tạo phức Hai nguyên tắc đầu phổ biến nguyên tắc thứ ba Điện cực màng thủy tinh: Đây loại điện cực màng thông dụng Điện cực gồm ống thủy tinh, đầu ống bầu tròn cấu tạo thủy tinh mỏng (0.06-0.10mm) Đây lớp màng thủy tinh có thành phần xác định có khả trao đổi chọn lọc với proton cation khác Điện cực màng thủy tinh đo pH: Phổ biến thủy tinh chứa 22%Na2O, 6%CaO 72%SiO2 có khả trao đổi chọn lọc ion H+ đến pH xấp xỉ Ở pH cao hơn, lớp màng thủy tinh trở nên chọn lọc với H+ trao đổi với Na+ cation hóa trị I khác Ngày người ta sử dụng loại thủy tinh đo Na+ Ca2+ thay Li+ Ba2+ có khả xác định chọn lọc H+ pH cao Phần cuối điện cực bầu thủy tinh có thành mỏng có thành phần đặc biệt Bên bầu thủy tinh chứa dung dịch H+ có nồng độ xác định Nhúng vào dung dịch H+ dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl Toàn bộ phận đặt ống bảo vệ Khi nhúng điện cực thủy tinh vào dung dịch chứa ion H+, hai bề mặt màng thủy tinh tiếp xúc với H+ có phản ứng trao đổi: H+tt H+dd + Na+dd + Na+dd nghĩa hai mặt lớp thủy tinh tạo hai lớp “gel” H2SiO3 (dày 10-4-10-5 mm) điện H+ thủy tinh Vì có tượng trao đổi ion xảy hai mặt màng thủy tinh nên lớp gel xuất điện có giá trị phụ thuộc vào hoạt độ H+ dung dịch hoạt độ H+ lớp gel Hay nói cách khác, hiệu màng E qua lớp thủy tinh phụ thuộc vào hoạt độ H+ bên bầu, H + bầu hoạt độ H+ hai lớp gel Với giả sử tượng trao đổi ion xảy hai mặt thủy tinh gần giống cố định hoạt độ H + bầu thủy tinh nên hiệu màng E phụ thuộc vào hoạt độ H+ dung dịch cần khảo sát Bằng việc thay thành phần thủy tinh cho điện màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al2O3 B2O3 ta tạo điện cực màng thủy tinh dùng xác định cation hóa trị I Na+, K+, NH4+… Đầu dị khí: http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Đầu dị khí thiết bị đo có tính chọn lọc độ nhạy cao dùng để xác định khí hịa tan ion chuyển thành khí hịa tan điều chỉnh pH mơi trường Bộ phận đầu dị khí lớp màng xốp mỏng lắp vào phần cuối đầu dị thay cách dễ dàng Tấm màng gọi màng thấm khí, chế tạo từ polymer chịu nước polytetrafluoroethylene polypropylene với độ xốp khoảng 70% (kích thước lỗ xốp nhỏ 1mm) Lớp màng phân tách dung dịch cần phân tích với dung dịch NaHCO3 NaCl (nếu thiết bị dùng để đo CO2 hòa tan) Điện cực chuẩn: Trong hầu hết ứng dụng điện hóa, ngồi điện cực đo ta phải sử dụng thêm điện cực có điện xác định khơng đổi Điện cực gọi điện cực chuẩn hay điện cực so sánh Điện cực chuẩn phải không tham gia phản ứng với thành phần dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch tn theo phương trình Nerst, phải có điện khơng đổi theo thời gian lấy lại giá trị ban đầu sau có dịng điện nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường điện cực kim loại loại hai (kim loại M phủ lớp hợp chất tan MA kim loại nhúng vào dung dịch muối có chứa anion A- có nồng độ xác định) Điện cực calomel: Điện cực calomel tạo thành kim loại Hg tiếp xúc với dung dịch chứa muối Hg2Cl2 bão hòa KCl có nồng độ xác định (bão hịa hay 1M) Điện cực Ag/AgCl: Ngày điện cực Ag/AgCl sử dụng rộng rãi để làm điện cực chuẩn thay cho điện cực calomel Nồng độ dung dịch KCl sử dụng bão hịa hay 3.5M Các điện cực chuẩn thường có lỗ nhỏ gần đầu phía Lỗ thường có nút đậy kín khơng sử dụng để chống lại bay dung dịch phía http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Hình 2.1: Cấu tạo biosensor đo điện đơn giản e) Điện điện cực đo điện cực so sánh Chú thích: a) Màng bán thấm g) Dung dịch HCl b) Thành phần sinh học f) Điện cực đo Ag/AgCl c) Màng thủy tinh h) Điện cực so sánh d) Điện cực thủy tinh đo pH Ứng dụng: Điện cực đo điện dùng để xác định glucose với cố định enzym glucooxydase lên điện cực: D-glucose Glucooxydase D-gluconat + H+ Đo lượng H+ tạo thành (đo pH sau giải phóng H+) xác định hàm lượng D -glucose Xác định Ure với có mặt enzym Urease: NH2CONH2 + H2 O NH2CONH2 + H2 O http://www.ebook.edu.vn pH=9 2NH3 + 2H+ urease + HCO3- + H+ 2NH4+ + CO2 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Chú thích: c – Cáp bảo vệ e – Dung dịch điện phân k ướ Hình 2.2: Cấu tạo điện cực pCO2 Xác định lysin: lysindecarbocylase lysin cadalverin + CO2 2.1.2 Điện cực đo dòng điện (Amperometric biosensor) Điện cực đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo đặt hiệu điện hai điện cực (điện cực đo điện cực so sánh) Mật độ hạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy hai điện cực Cường độ dòng điện chạy hai điện cực hàm mật độ hạt tích điện dung dịch điện đặt hai điện cực Trong đa số trường hợp, người ta thường tiến hành oxy hóa khử loại hạt tích điện cực đo Nếu đặt vào điện cực đo điện E biến thiên so với điện cực so sánh vẽ đường cong I = f(E), chiều cao I bậc giới hạn khuếch tán tỷ lệ với nồng độ hạt bị oxy hóa bị khử điện cực đo Hình 2.3: Đồ thị I = f(E) Chú thích: 1- E q nhỏ để oxy hóa xảy http://www.ebook.edu.vn Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor 2- vận tốc oxy hóa điện hóa cường độ dòng điện tăng cường với tăng hiệu điện 3- cường độ không phụ thuộc vào hiệu điện I = K.Cred Hiện điện cực đo dòng điện sử dụng rộng rãi điện cực oxy điện cực hydroperoxyde Oxy hydroperoxyde (H2O2) chất sinh số phản ứng có enzym xúc tác, phản ứng có chất trung gian oxy hóa-khử nhân tạo: ferrocyanua, ion N-metyl-phenazini (NMP) benzoqiunon chúng xác định nhờ đo dịng điện Các điện cực đo dòng điện thường sử dụng enzym oxydoreductase để gắn vào màng Oxy, NAD+, NADP+ dùng chất nhận điện tử để phục hồi enzym sau tham gia phản ứng xúc tác chất Các enzym sử dụng Oxy oxydase enzym sử dụng NAD+, NADP+ gọi dehydrogenase hay reductase Trong hai nhóm enzym oxydase dùng nhiều Các điện cực đo dòng điện sử dụng để xác định chất enzym glucose, monosacharide, hypoxanthyl, lactate, acid amin, sulfite, salicylate, oxalate pyruvate Điện cực enzym để đo nồng độ glucose có cấu tạo gồm: anod Pt catod Ag phủ AgCl tiếp xúc với màng cố định glucoseoxydase (GOD) Cả hai đặt dung dịch điện phân KCL Điện áp phân cực 0.68 Volt đặt vào hai điện cực Dưới tác động điện áp phân cực H2O2 giải phóng bị oxy hóa mặt phân cách anod màng theo phản ứng: GOD Glucose + O2 H2O2 O2 Acid gluconic + H 2O2 + 2H+ + 2e- Dòng điện đo tỷ lệ với lượng H2O2 bị oxy hóa tỷ lệ với lượng glucose mơi trường cần đo Hình 2.4: Sơ đồ nguyên tắc điện cực đo dòng điện http://www.ebook.edu.vn 10 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Lysin Phenyl alanin Methionin Histidin Aspartam Amygladin Penicillin Adenosin Lysine decarboxylase Phenylalanin ammonia lyase Methionin lyase Histidin ammonia lyase Carboxypeptidase A, L-aspartase b - glucosidase Penicillinase Adenosine deaminase Acetylcholin Nicotine Neostigmin Physotigmin Fluoride Ag+ Hg2+ Thuốc trừ sâu (TTS) H 2O Arginase Acetylcholin esterase Urease Acetylcholin esterase Urease E + BSA + GA pCO2 – phút 10-4–3.10-3 E / vi lỗ pNH3 12 phút 10-4–6.10-4 E + BSA + GA pNH3 phút 10-5 – 10-2 E + BSA + GA pNH3 – phút 10-5 – 10-2 E + BSA + GA pNH3 – phút 4,25.10-4– 8,1.10-3 E + polyacrylamide E + polyacrylamide E + BSA/màng thẩm thấu E + BSA + GA/collagen E + GA E + polyacrylamide E + BSA + GA E + BSA + GA E + BSA + GA E + BSA + GA pCN pH pNH3 pNH3 pH pH pH pH pH pCO2 10 – 30 phút – phút - 12 phút – 14 phút phút – phút – phút – phút – phút – phút 4.10-5–10-3 4.10-5–10-3 7.10-7-10-2 3,5.10-5 – 1,6.10-2 10-4 – 3.10-3 2.10-5 – 10-3 10-3 – 10-1 5.10-7 – 5.10-5 3.10-8 – 3.10-6 3.10-4 – 10-2 E + BSA + GA pH – phút 10-4 – 2.10-2 E + BSA + GA E + GA pCO2 pCO2 – phút – phút 10-8 – 3.10-7 2.10-8 – 2.10-6 Cholinesterase E + BSA + GA pH – phút 10-8 – 10-5 (tùy loại TTS) Peroxidase urease E + BSA + GA/collagen E + polyacrylamide pF pNH4 < 10 phút 8.10-5 – 10-2 1.6 – 16 UI Bảng 4.2: Một số điện cực enzym đo dòng điện: http://www.ebook.edu.vn 52 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Chất phân tích Enzym (E) Glucose oxidase Glucose Glucose dehydrogenase Alcohol dehydrogenase Kỹ thuật cố định Tinh bột http://www.ebook.edu.vn Thời gian đáp ứng 30 giây – phút – phút 26 – 38 giây – phút – phút phút – phút 10 giây 10 phút Vùng tuyến tính (M) – 0.5 g/l – 2.10-2 – 20mg/dl – 200 mg/l – g/l –1.5.10-2 10-7 – 2.10-3 10-7 – 2.10-3 10-4 – 10-2 Pt 0.5 - phút 10-6 – 3.10-3 Pt – phút – g/l E + polyacrylamide E + BSA + GA E/nylon E + polyacrylamide/milipore E + gelatin + GA E + polyacrylamide E/collagen E + BSA + GA E + silan + GA E + p-benzoqiunon + BSA/cellulose E + silan + GA/silicon E + acrylamide/màng thẩm thấu/ màng silicon E + BSA + GA E /màng bán thấm E/cellophan E + ferrocene graphite E + NMP+ TCNQ- Pt – 10 phút – 2,5.10-2 Pt Pt Pt Graphite Pt – phút phút – phút – 1.5 phút - – 2.7.10-2 10-5 – 7.10-3 5.10-4 – 6.10-3 10-2 – 3.10-2 – 2.6.10-3 E + BSA + GA pO2 – 15 phút 8.10-4 – 10-3 E/màng thẩm thấu Pt – 10 phút - E /collagen Pt 30 phút - E + GA pO2 1-2 phút – 25 mg/l E + BSA + GA Pt – phút - ethanol Alcohol oxidase catalase a-amylase glucose oxidase Bộ biến pO2 pO2 pO2 pO2 pO2 Pt Pt Pt SnO2 53 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Cholin Cholin oxidase http://www.ebook.edu.vn E/nylon 54 pO2 - phút 2.10-5–2.10-4 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor CHƯƠNG ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR 5.1 ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM: Trong ngành thực phẩm, việc kiểm tra chất lượng thực phẩm dựa phương pháp truyền thống thường nhiều thời gian từ vài đến vài ngày Nhưng với kỹ thuật dùng biosensor mang lại cho ngành công nghiệp thực phẩm thiết bị theo dõi đo lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi so với phương pháp truyền thống Bảng 5.1: Một số ứng dụng biosensor công nghiệp thực phẩm: Hợp chất cần đo Các acid amin Các hợp chất amin, amid, dị vòng Hydratcarbon Acid hữu Các rượu phenol Các hợp chất khác Ưng dụng phát (định tính định lượng) Alanin, arginin, asparagin, acid aspartic, cystein, glutamin, acid glutamic, glutathiol, histidin, leucin, lysin, methionin, N-acetyl methionin, phenylalanin, sarcosin, serin, tyrosin, tryptophan, valin Aminopyrin, anilin, amin thơm, acetyl cholin, cholin, phosphatidylcholin, creatin, guanidin, guanosin, penicilline, spermin, creatin, acid uric, ure, xanthyl, hypoxanthin Amygdalin, galactose, glucose, glucose-6-phosphat, lactose, maltose, sacharose, tinh bột Acid acetic, acid formic, acid gluconic, acid isocitric, acid ascorbic, acid lactic, acid malic, acid oxalic, acid pyruvic, acid succinic, acid nitrylacetic Acetaldehyde, bilirubin, catechol, cholesterol, cholesterol ester, ethanol, glycerol, glycerol ester, methanol, phenol Chất kháng sinh, độ tươi cá thịt, vitamin a) Đo nồng độ glutamin nồng độ glutamat Glutamat thực phẩm không ảnh hưởng đến mùi vị thực phẩm mà liên quan đến khía cạnh an tồn vệ sinh thực phẩm Các loại đồ hộp thịt cá , đồ hộp nước xúp, dầu giấm, nước sốt bổ sung lượng mono natri glutamat có tác dụng tăng mùi vị, lượng lớn glutamat gây dấu hiệu bệnh lý nghiêm trọng ảnh hưởng sức khỏe người như: tim đập nhanh, đau dày http://www.ebook.edu.vn 55 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Để định lượng glutamat, sử dụng điện cực đo dịng điện có gắn màng enzym cố định glutamat oxydase Glutamat oxydase đồng cố định với glutaminase để đo nồng độ glutamin dựa phản ứng: glutaminase glutamin glutamat glutamat oxydase glutamat + NH3 α - ketoglutarat + NH3 + H2O2 Việc đo nồng độ glutamin có ý nghĩa quan trọng tiêu đánh giá nguồn nitơ môi trường nuôi cấy vi sinh vật công nghiệp Glutamat oxydase có hoạt tính tối ưu pH = 7.8, glutaminase từ E.coli lại hoạt động vùng acid Nếu thay glutaminase trung tính từ Bacillus hai enzym có hoạt tính tối ưu pH = có tính chịu nhiệt tốt Màng enzym tạo thành ổn định có hoạt tính tốt sử dụng thương mại Màng enzym cho kết đo đạt tuyến tính đến 8mM glutamin, không đáp ứng với chất khác (trừ glutamat), giữ trạng thái khơ thời gian tháng 4oC, thời gian đáp ứng 30 giây nhanh nhiều so phương pháp sắc lý lỏng cao áp HPLC b) Đo nồng độ cholin: Trong thể, cholin thành phần phospholipid cấu tạo nên màng tế bào màng nhiều bào quan tế bào, mặt khác cholin tiền chất để tổng hợp nên acetylcholin (chất có vai trị chuyển kích thích thần kinh), đồng thời nguồn nhóm methyl thể Cholin thường bổ sung vào thức ăn cho trẻ em sản phẩm dinh dưỡng cho người lớn Việc xác định nồng độ cholin thực phương pháp theo dõi phát triển vi sinh vật môi trường chất, phương pháp quang phổ hay sắc ký Tuy nhiên, phương pháp thường xác, thời gian dài giá thành cao Với sử dụng điện cực enzym có gắn cholin oxydase chế tạo dựa sở phản ứng oxy hóa cho thời gian nhanh, xác nhiều Phản ứng oxy hóa xảy điện cực: cholin oxydase H2O2 + cholin + O2 betain aldehyde + O2 http://www.ebook.edu.vn H2O2 56 betain aldehyde + betain Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Giá trị phép đo đạt tuyến tính khoảng từ 5mg/l đến 160 mg/l sử dụng dung dịch cholin hydroxyde nồng 111mg/l làm chuẩn Thời gian thu kết sau 30 giây giá rẻ c) Đo hàm lượng cồn: Hàm lượng cồn xác định cách sử dụng alcohol oxydase: rượu + O2 alcohol oxydase H2O2 + aldehyde Tuy nhiên hạn chế điện cực tính khơng bền alcohol oxydase dạng khơ, cần có biện pháp bảo quản thích hợp để ổn định hoạt tính enzym d) Phát có mặt vi khuẩn có mặt thực phẩm: Dùng điện cực sinh học phát quang để phát có mặt vi khuẩn thực phẩm vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP D-luciferin để giải phóng ánh sáng phát quang nhờ tác dụng xúc tác enzym luciferase: ATP + D-luciferin luciferase oxy luciferin + AMP + CO2 + λ (562nm) ánh sáng vàng e) Điện cực miễn dịch đo hàm lượng albumin, insulin: Điện cực miễn dịch kết hợp với điện cực đo dòng điện để xác định insulin, albumin: Cho kháng thể kháng insulin biết (lấy từ lợn) lên lớp màng gắn điện cực Oxy để kháng thể bám lớp màng đó, sau cho insulin cần kiểm tra lên màng cho tiếp kháng nguyên (insulin) gắn catalase bổ sung chất H2O2, phản ứng sau: H O2 catalase - insulin H2 O + 1/2 O2 Hàm lượng O2 tạo thành định lượng nhờ điện cực O2 từ xác định hàm lượng insulin Điện cực miễn dịch kết hợp với điện cực đo quang: http://www.ebook.edu.vn 57 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Hình 7.1 mơ tả điện cực miễn dịch sử dụng chuyển đổi quang học, biến đổi sinh học tạo đáp ứng quang thông qua màng điện cực (sensor chip) Khi mẫu chứa kháng nguyên qua phản ứng đặc hiệu với kháng thể bề mặt sensor chip làm thay đổi bước sóng góc phản xạ ánh sáng chiếu vào mặt bên sensor chip Đo thông số quang học cho ta nồng độ kháng nguyên có mẫu f) Kiểm tra hàm lượng cloramphenicol sản phẩm thủy sản: Dùng điện cực miễn dịch dựa nguyên tắc ELISA để kiểm tra hàm lượng cloramphenicol thủy sản Các giếng phủ lớp kháng thể kháng cloramphenicol (cloramphenicol chuẩn dung dịch chuẩn) Cloramphenicol gắn enzym kháng thể kháng cloramphenicol bổ sung vào giếng Cloramphenicol tự cloramphenicol gắn kết enzym cạnh tranh vị trí kết gắn kháng thể kháng cloramphenicol (phản ứng miễn dịch enzym cạnh tranh) Đồng thời kháng thể bổ sung vào cố định lại kháng thể thành giếng Cloramphenicol kết gắn enzym bị dư loại bỏ cách rửa Bổ sung vào giếng chất enzym (ure peroxyde) chất tạo màu (tetramethyl benzidin) ủ Enzym gắn kết chuyển hóa chất tạo sắc vốn khơng màu thành sản phẩm có màu xanh Khi bổ sung chất kết thúc phản ứng chuyển từ màu xanh sang màu vàng Đo cường độ màu máy đo màu quang điện bước sóng 450 nm, nhận thấy cường độ màu tỷ lệ nghịch với hàm lượng cloramphenicol có mẫu Giai đoạn ủ thực máy ủ ổn định nhiệt độ Kết phản ứng đọc máy đọc theo nguyên tắc so màu so sánh với đồ thị chuẩn để xác định nồng độ kháng sinh Phương pháp phát cloramphenicol nồng độ 0.05ppb Loại thiết bị sử dụng để kiểm tra số chất khác loại chất chuẩn khác (các kit chuẩn) với giới hạn phát thấp Bảng 5.2: Một số kit chuẩn sử dụng giới hạn phát hiện: Loại kit cloramphenicol - mẫu sữa - mẫu thịt, trứng - mẫu tôm clenbuterol - mẫu nước tiểu - mẫu thịt diethylstilbestrol Histamin http://www.ebook.edu.vn Giới hạn phát 0.15 ppb 0.10 ppb 0.05 ppb 0.10 ppb 0.04 ppb 0.02 ppb 58 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor - cá tuyết - bột cá 20 ppb 125 ppb g) Xác định hàm lượng mycotoxin ngũ cốc thực phẩm Mycoloxin độc tố sinh trình phát triển nấm mốc có mặt sản phẩm như: lạc, ngũ cốc, hoa quả.chúng xuất thức ăn gia súc Gia súc ăn thức ăn này, độc tố mycotoxin qua q trình trao đổi chất có mặt sản phẩm trứng, sữa, thịt Có nhiều phương pháp xác định mycotoxin phương pháp xác định điện cực miễn dịch sử dụng rộng rãi Phương pháp dựa nguyên tắc liên kết đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể Một nồng độ cố định kháng thể trộn với mẫu cần phân tích có chứa hàm lượng mycotoxin chưa biết, kháng thể mycotoxin tạo thành phức Điện cực xác định nồng độ kháng thể tự (không tạo phức với mycotoxin) Dựa vào đồ thị mycotoxin chuẩn định lượng mycotoxin có mẫu cần phân tích 5.2 ỨNG DỤNG TRONG MƠI TRƯỜNG Các điện cực enzym sử dụng phân tích mơi trường chia thành ba nhóm dựa vào đặc điểm phản ứng enzym: - Nhóm thứ : chất định lượng chất phản ứng enzym - Nhóm thứ hai: chất định lượng chất kìm hãm hoạt tính xúc tác enzym Ví dụ, hợp chất phospho cacbonat - Nhóm thứ ba: nồng độ ion kim loại dược phát nhờ vào việc chúng liên kết với phần “apoenzym” phục hồi hoạt tính enzym a) Định lượng ion kim loại nặng Các enzym thuộc nhóm metalloenzym cần có ion kim loại tham gia vào trung tâm hoạt động để trì hoạt tính xúc tác enzym, đ1o ion kim loại bị tách khỏi enzym ( ví dụ, tác dụng tác nhân tạo phức) làm hoạt tính xúc tác enzym.hoạt tính xúc tác enzymcó thể phục hồi cho enzym tiếp xúc với mơi trường chứa ion kim loại ion kim loại thu hút lại vào trung tâm hoạt động enzym Do định lượng nồng độ kim loại nặng mẫu thông qua việc xác định hoạt động xúc tác enzym tạo thành sau cho phần “apoenzym” cố định tiếp xúc vơi mẫu http://www.ebook.edu.vn 59 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Ưu điểm phương pháp phát kim loại nồng độ nhỏ ( m mol) ph1t kim loại có mặt nhóm metalloenzym Bảng 5.3: giới thiệu số điện cực xác định ion kim loại Kim loại Hg (II) Enzym Urease phosphatase kiềm apoenzym: phosphatase Apoenzym: galactooxydase Apoenzym: tyrosinase Zn (II) Cu (II) Cu (II) Điện cực Điện cực NH4+ PH – ISFET Điện cực nhiệt điện trở Nồng độ (mmol/l) – 150 nm/l 0.01 – (sai số 2.3%) 0.01 – Điện cực Pt/Ag/AgCl 0.1 – (sai số 7%) Điện cực O2 < 0.5 b) Định lượng phenol: Việc phân tích nồng độ hợp chất phenol dựa phản ứng: Phenol + O2 + 2H+ tyrosinase (polyphenol oxydase tyrosinase o - diphenol + O2 o - quinon Fe(CN)64- tyrosinase + o- diphenol o - quinon o- diphenol + Fe(CN)63- Bảng 5.4: Điện cực dùng tyrosinase: Điện cực Điện cực graphit với TCNQ Điện cực O2 (Clark) Điện cực O2 (Clark) Nồng độ phát 0.23 – 0.65 Sai số Thời gian 12 – 35 s – 46 (trong hexan) – 190 (trong dung dịch đệm) 0.1 – (trong dung dịch đệm cloroform 4.4% (trong hexan) 7.2% (trong dung dịch đệm) < phút phút c) Định lượng phosphat, nitrit, nitrat, sulfat Các hợp chất ngày có mặt nhiều môi trường, đặc biệt nước uống Sự gia tăng nguồn nitơ, phospho nước gây tượng phì dưỡng, gây cân sinh thái (theo tiêu chuẩn EC, nồng độ cho phép phospho là: 5mg/l P2 O5 ) Nồng độ phospho thông thường xác địnhbằng phương pháp đo màu http://www.ebook.edu.vn 60 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Tuy nhiên, nồng độ phospho nước định lượng điện cực enzym Theo Kubo(1991), nồng độ phosphat xác định cách sử dụng điện cực pyruvatoxydase từ pediococcus xúc tác với oxy hoá pyruvat điều kiện có mặt phosphat O2 để tạo thành acetylphosphat, hydro peroxyt CO2 Lượng O2 tiêu thụ dùng để dịnh lượng phosphat: CH3COCOOH + H3PO4 + CH3COP + H2O2 + CO2 1/2 O2 Các hợp chất chứa nitrat, nitrit định lượng theo phản ứng oxy hóa khử xúc tác nitratreductase nitritreductase: NO3- + 2H+ NO2- + H+ NO2- H2O + NH4+ + 2H2O OHNH3 Bảng 5.5: Định lượng nitrit, nitrat, sulfat Chất Enzym Điện cực thị Nitrit Nitrit reductase Nitrat reductase nitrit reductase Arylsulfatase Điện cực NH3 Nitrate Sufate Giới hạn phát (mmol/l) 50 50 Điện cực NH4+ Điện cực Pt 100 Bảng 5.6: Điện cực enzym định lượng phosphate: Enzym Nồng độ (mmol/l) Điện cực thị Sai số (%) Thời gian đáp ứng (phút) Tính ổn định > 100 thí nghiệm (TN)/ tháng > 70 TN/ tháng Phosphatase glucooxydase ≥ 0.01 5.9 H 2O – 10 Nucleosiphosphorilase xanthinoxydase Nucleosiphosphorilase xanthinoxydase Pyruvat oxydase 0.3 – mM 10 O2 10 – 250 5.9 H 2O 2 30 TN 12 – 80 5.9 O2 7 ngày (khả http://www.ebook.edu.vn 61 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Nucleosiphosphorilase xanthinoxydase 0.5 – 100 O2 đáp ứng giảm 50%) > ngày/ 300 ngày 1.5 d) Định lượng chất độc Các loại thuốc trừ sâu phospho có độc tính cao, ngồi tác dụng độc sơ cấp, chúng cịn làm biến đổi q trình trao đổi chất tế bào cách tác dụng lên enzym thiết yếu tế bào esterase, oxydase, phosphorylase, dehydrogenase Theo tiêu chuẩn EC, nồng độ tối đa cho phép dư lượng chất nước uống 0.1 mg/l loại riêng biệt 0.5 mg/l hỗn hợp Việc xác định chất độc thực sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sắc ký khối phổ (GC/MS) thiết bị đắt tiền, phương pháp phức tạp trình độ kỹ thuật cao Sử dụng điện cực có gắn enzym cholinesterase dựa vào đặc điểm chất độc kìm hãm enzym đem lại nhiều thuận lợi phân tích Q trình phản ứng thủy phân cholin nhờ cholinesterase sau: CH3COS(CH2)2N+(CH3)3 Acetyltiocholin Acetylcholinesterase CH3COO- + Acetate HS(CH2)2N+(CH3)3 Tiocholin S-(CH2)2N+(CH3)3 HS(CH2)2N+(CH3)3 + H+ Phản ứng oxy hóa tạo thành H+, sở dùng điện cực pH hay dùng phản ứng oxy hóa tiocholin điện cực Pt để xác định hoạt độ enzym e) Kỹ thuật ELISA xác định dư lượng thuốc trừ sâu Kỹ thuật ELISA để xác định dư lượng trừ sâu gồm hai phương pháp cd – ELISA (competitive direct ELISA – ELISA cạnh tranh trực tiếp) phương pháp ci – ELISA (competive indirect ELISA – ELISA cạnh tranh gián tiếp) Trong cd – ELISA, kháng thể cố định bề mặt giếng giá thể rắn, cho mẫu thuốc trừ sâu có hàm lượng định gắn enzym thuốc trừ sâu cần phân tích vào giếng này, chúng cạnh tranh để bám vào kháng thể Sau thời gian phản ứng chất cịn dư bị rửa trơi Cuối cùng, chất bị enzym xúc tác tạo sản phẩm có màu sắc Cường độ màu tỷ lệ nghịch với lượng thuốc trừ sâu cần xác định mẫu Nếu thuốc trừ sâu nhiều lượng cộng hợp enzym tính cạnh tranh bị giữ lại ít, màu yếu ngược lại http://www.ebook.edu.vn 62 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Trong kỹ thuật ci – ELISA, giếng phủ lớp thuốc trừ sâu liên kết với protein, thuốc trừ sâu cần xác định thêm vào với lượng kháng thể cố định Để thời gian, thuốc trừ sâu cần phân tích (kháng nguyên) thuốc trừ sâu liên kết cạnh tranh bám vào kháng thể, lượng thuốc trừ sâu nhiều lượng kháng thể ban đầu bị giữ lại cách cho chất vào, chuyển hóa tạo sản phẩm có màu Cường độ màu tỷ lệ nghịch với lượng chất cần xác định mẫu ban đầu Phương pháp có ưu điểm giá thành rẻ, dễ tự động hóa, nhược điểm thời gian phát loại thuốc trừ sâu f) Điện cực đếm vi sinh vật: Vi sinh vật đếm thí nghiệm vi sinh vật, thường tốn nhiều thời gian, đặc biệt xác định vi sinh vật gây bệnh Samonella Listeria sp Khi xác định Samonella, trước tiên cần 24 để làm môi trường, làm cho vi sinh vật cần xác định từ trạng thái tĩnh thực phẩm sang trạng thái hoạt động Sau canh trường ủ để Samonella phát triển Sau 24 phát triển, cấy mơi trường có chứa vi sinh vật sang đĩa thạch, hai ngày sau xác định lượng Samonella Kết tìm loại kháng thể somatic (O) hay flagella (H) Phương pháp xác thời gian lâu gần ngày, kết đưa mang tính định tính Các dụng cụ phân tích nhanh thuộc kỹ thuật ELISA sử dụng để xác định Samonella, Staphylococcus nội độc tố: mẫu thực phẩm xử lý enzym để đạt tới kích thước định, sau lọc màng lọc kẻ ô kỵ nước HGMF (hydrophobic grid membrane filter) để chuẩn bị cho bước xác định Hình 7.2: Biosensor phát E.coli 5.3 ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC: Điện cực enzym có nhiều ứng dụng việc phát chẩn đốn bệnh tật Ngày cịn cơng cụ hữu hiệu để chăm sóc sức khỏe nhà với nhiều tính tốt a) Đo nồng độ glucose: http://www.ebook.edu.vn 63 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor Glucose nguyên nhân gây bệnh tiểu đường Bệnh làm người bệnh khả kiểm soát nồng độ glucose máu dẫn đến tăng đường huyết, gây tử vong glucose đến não Việc điều trị bệnh tiểu đường đòi hỏi người bệnh phải theo dõi thường xuyên hàm lượng glucose máu, yêu cầu đặt phải phát triển thiết bị cho phép người bệnh tự theo dõi nhà Biosensor với khả xác, có khả tái sử dụng đáp ứng yêu cầu Biosensor đo nồng độ glucose có mặt thị trường hoạt động theo nguyên tắc điện cực đo dòng điện, điện cực đo quang dựa phản ứng xúc tác oxy hóa với có mặt GOD (glucooxydase) Trong đáng ý loại thiết bị cầm tay với loại chip chế tạo sở điện cực chọn lọc ion điện cực đo dịng điện, kích thước nhỏ, dễ mang theo, tiện sử dụng b) Đo nồng độ ure Việc kiểm tra nồng độ ure máu, đặc biệt người mắc bệnh thận có ý nghĩa quan trọng Thiết bị hoạt động nguyên tắc điện cực đo điện thế, ure bị thủy phân tác dụng xúc tác urease: (NH2)2CO + 3H2O GOD CO2 + 2OH- + 2NH4+ Nồng độ NH4+ tỷ lệ với nồng độ ure đo cách dùng lớp màng thấm chọn lọc ion NH4+ Hình 7.3 : Một số Biosensor thương mại http://www.ebook.edu.vn 64 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor KẾT LUẬN Biosensor phát triển vượt bậc nhanh chóng suốt nhiều năm qua Nhờ vào phương pháp kết hợp thụ cảm với nhiều biến Đặc điểm, tính chất biosensor cải thiện tính xác thực ngày cao tạo nhiều ứng dụng Ứng dụng Biosensor lĩnh vực y khoa (chăm sóc sức khỏe bệnh nhân) Biosensor đặc biệt thích hợp cho phân tích mẫu mơi trường sinh học phức tạp mà khơng cần tác nhân phản ứng hóa học Biosensor dùng in-vivo tạo tín hiệu liên tục, điều khiển nồng độ chất tạo thành trình trao đổi chất thời gian định nên ứng dụng quan trọng kiểm soát nồng độ đường máu người bệnh Các ứng dụng Biosensor công nghệ thực phẩm phát triển Đột phá quan trọng khả khử trùng q trình lên men Biosensor đóng vai trị quan trọng kiểm soát trực tiếp chất lượng thực phẩm Mơi trường cần có kiểm sốt chất lượng liên tục mà kỹ thuật hóa lý giới hạn đặc biệt kiểm tra độ độc hại môi trường Biosensor đời đáp ứng nhu cầu Nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện tính nhạy cảm tính chọn lọc biosensor Nhiều cơng ty Nhật Bản phát triển sản xuất nhiều loại biosensor Năm 2000, thị trường Biosensor thành lập tổ chức năm lần Tại tập trung nghiên cứu phát triển biosensor nhiều lĩnh vực khác chuyên gia đầu ngành có giải thưởng trao tặng Điều khẳng định phát triển nhanh chóng Biosensor Y X http://www.ebook.edu.vn 65 Đồ án: Tổng quan tài liệu Biosensor TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] TRAN MINH CANH, Biosensor, Chapman & Hall PGS.TS ĐẶNG THỊ THU, PGS LÊ NGỌC TÚ, TS TÔ KIM ANH, PGS.TS PHẠM THU THỦY, T.S NGUYỄN XUÂN NAM, Công nghệ Enzym, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội TRAN MINH CANH, BROUN G., Construction and study of electrodes using cross – linked enzymes UPDIKE S.J., HICKS G.P., The enzyme electrode, Nature YODAK., Methods in Enzymology, Vol 137 http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/biosensors.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/calorimetric.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/potentiometric.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/amperometric.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/optical.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/piezo.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/immuno.html http://www.biodot.com/products/products_biosensor.htm http://www.biosensors-congress.elsevier.com/ http://www.ebook.edu.vn 66