nghiên cứu chế tạo kit phát hiện nhanh aflatoxin b1 trong thức ăn chăn nuôi

Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp sản sinh bởi nấm mốc, chủ yếu là cácchủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus 57, đƣợc tìm thấy trong mộtloạt các nông sản nhƣ hạt ngô, lạc, gạo, ngũ cốc40, 64. Đây là nhóm độc tố nấmmốc nguy hiểm nhất gây độc cho ngƣời và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổnthƣơng gan, viêm gan, phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thƣ biểu mô mãn tính(ung thƣ gan, phổi, thận và ức chế miễn dịch), thậm chí với liều lƣợng cao có thểdẫn tới tử vong

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN THÚ Y BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài:NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH AFLATOXIN B1 TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ AFLATOXIN M1 TRONG SỮA TƢƠI Cơ quan chủ quản: Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn Cơ quan chủ trì: Viện Thú y Chủ nhiệm đề tài: Phạm Thị Ngọc Thời gian thực hiện: 36 tháng HÀ NỘI – 2020 DANH SÁCH NHỮNG NGƢỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI TT Họ tên Cơ quan/tổ chức TS Phạm Thị Ngọc Viện Thú y Ths Trƣơng Thị Quý Dƣơng Viện Thú y TS Nguyễn Thị Bích Thủy Viện Thú y TS Nguyễn Thị Lan Anh Viện Thú y TS Nguyễn Thị Thu Hằng Viện Thú y BSTY Trần Thị Nhật Viện Thú y PGS.TS Trƣơng Quốc Phong ĐHBK HN PGS.TS Khuất Hữu Thanh ĐHBK HN TS Nguyễn Tiến Thành ĐHBK HN 10 ThS Đỗ Thị Thu Hà ĐHBK HN 11 KTV Nguyễn Hồng Minh 12 ThS Trần Thị Thu Hằng Viện Thú y Viện Thú y Chữ ký Tóm tắt kết thực đề tài Nƣớc ta nƣớc nhiệt đới với khí hậu nóng ẩm nên điều kiện thuận lợi cho loài nấm mốc phát triển, có lồi Aspergillus flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin cao Do nguy nhiễm độc tố chuỗi sản phẩm nông sản, thức ăn chăn nuôi, sữa sản phẩm từ vật nuôi cao Vì Aflatoxin độc tố nguy hiểm nên việc kiểm tra có mặt độc tố sản phẩm nêu cần thiết KIT thử nhanh dạng que thử số công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng để phát Aflatoxin Phƣơng pháp có nhiều tính ƣu việt nhƣ nhanh, đơn giản, sử dụng trƣờng, giá thành thấp phƣơng pháp khác Tuy nhiên, hoàn toàn phải nhập ngoại loại sinh phẩm Nghiên cứu tạo que thử nhanh có khả phát Aflatoxin thức ăn chăn nuôi sữa tƣơi hƣớng nghiên cứu Việt Nam bƣớc đột phá ứng dụng công nghệ nano kết hợp với hóa sinh miễn dịch để tạo que thử nhanh Trong nghiên cứu này, xây dựng quy trình tự sản xuất kháng nguyên, kháng thể đạt yêu cầu để tạo que thử Từ đó, chế tạo đƣợc que thử phát đƣợc 5ppb Aflatoxin B1 thức ăn chăn nuôi 5ppb Aflatoxin M1 sữa tƣơi với độ nhạy đô đặc hiệu cao Việc tự sản xuất đƣợc thành phần quan trọng que thử giúp chủ động đƣợc nguồn nguyên vật liệu, kiểm sốt chất lƣợng đầu vào, giảm chi phí sản xuất dẫn tới giảm giá thành đƣợc sản phẩm MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU ĐỀ TÀI CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.1 Lịch sử phát Aflatoxin 1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin 1.3 Đặc điểm Aflatoxin 1.3.1 Cấu trúc hóa học phân loại 1.3.2 Tính chất hóa học tính chất vật lý 1.3.3 Sự chuyển hóa tiết Aflatoxin 10 1.3.4 Độc tính Aflatoxin 13 1.4 Tình hình nhiễm độc Aflatoxin giới Việt Nam 15 1.4.1 Trên giới 15 1.4.2 Tại Việt Nam 16 1.5 Quy định hành Aflatoxin 19 1.6 Các phƣơng pháp loại bỏ kiểm soát Aflatoxin 19 1.7 Các dung môi tách chiết Aflatoxin 21 1.8 Các phƣơng pháp phát Aflatoxin 21 1.8.1 Phƣơng pháp sắc kí .21 1.8.2 Phƣơng pháp quang phổ 24 1.8.3 Phƣơng pháp miễn dịch 25 1.8.4 Phƣơng pháp que thử sắc kýmiễn dịch 28 1.9 Tình hình nghiên cứu nƣớc que thử 30 1.9.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc .30 1.9.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 32 Đặc tính que thử .33 1.10 1.10.1 Hạt nano vàng (GNPs) 33 1.10.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 33 1.10.3 Sắc ký miễn dịch cạnh tranh .34 1.10.4 Miếng thấm mẫu 35 1.10.5 Miếng cộng hợp 36 1.10.6 Màng 36 1.10.7 Miếng thấm hút .36 Que thử phát Aflatoxin 37 1.11 1.11.1 Cộng hợp Aflatoxin với chất mang 37 1.11.2 Aflatoxin B1 38 1.11.3 CMO 39 1.11.4 Chất mang 39 1.11.5 Các phƣơng pháp tạo cộng hợp hapten AFB1 BSA 42 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị .47 2.1.1 Vật liệu 47 2.1.2 Hóa chất .47 2.1.3 Các kháng thể sử dụng 48 * Kháng thể cho tạo que thử 48 * Kháng thể cho ELISA Dot-blot 48 2.1.4 2.2 Thiết bị 48 Phƣơng pháp nghiên cứu 49 2.2.1 Phƣơng pháp gắn AF-CMO 49 2.2.2 Phƣơng pháp loại CMO dƣ 50 2.2.3 Phƣơng pháp sắc kí mong TLC .50 2.2.4 Phƣơng pháp quang phổ hồng ngoại FT-IR 51 2.2.5 Phƣơng pháp gắn AFB1-CMO với BSA/KLH AFM1-CMO với BSA/KLH 52 2.2.6 Phƣơng pháp dot-blot 53 2.2.7 Phƣơng pháp sản xuất kháng thể 55 2.2.8 Phƣơng pháp tinh kháng thể kháng AFbằng sắc ký lựcProtein A 55 2.2.9 Phƣơng pháp điện di SDS – PAGE 56 2.2.10 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp .57 2.2.11 hợp Phƣơng pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng cố định miếng cộng 57 2.2.12 Phƣơng pháp cố định protein kháng thể lên màng .58 2.2.13 Phƣơng pháp phân tích mẫu que thử .59 2.2.14 Phƣơng pháp chiết mẫu 59 2.3 Địa điểm nghiên cứu .60 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Nghiên cứu tạo phức cộng hợp Aflatoxin với protein chất mang 61 2.3.1 Nghiên cứu điều kiện gắn AFB1-CMO 62 3.1.2 Nghiên cứu điều kiện gắn AFB1-CMO với BSA 70 3.1.3 Kết gắn AFB1-KLH, AFM1-BSA AFM1-KLH 76 3.2 Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu Aflatoxin B1 M1 77 3.2.1 Nghiên cứu gây đáp ứng miễn dịch tạo thu nhận kháng huyết kháng AFB1 AFM1 77 3.2.2 Tinh kháng thể kháng AFB1 AFM1 80 3.2.3 Đánh giá đặc tính kháng thể tinh .85 3.3 Nghiên cứu chế tạo thành phần KIT thử .89 3.3.1 Nghiên cứu chế tạo dung dịch kéo vàng 89 3.3.2 Nghiên cứu điều kiện chế tạo que thử phát Aflatoxin B1 90 3.3.3 Nghiên cứu điều kiện chế tạo que thử phát Aflatoxin M1 110 3.3.4 Tăng cƣờng độ tín hiệu vạch giảm thời gian đọc kết 126 3.4 Nghiên cứu chế tạo xác định thông số KIT 130 3.4.1 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm KIT 130 3.4.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình sử dụng KIT 131 3.4.3 Đánh giá số thông số KIT 139 3.5 Nghiên cứu thử nghiệm KIT 155 3.5.1 Nghiên cứu thử nghiệm phịng thí nghiệm 155 3.5.2 Kiểm nghiệm que thử 156 CHƢƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 161 TÀI LIỆU THAM KHẢO 162 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AF : Aflatoxin AFB1 : Aflatoxin B1 AFB2 : Aflatoxin B2 AFG1 : Aflatoxin G1 AFG2 : Aflatoxin G2 AFM1 : Aflatoxin M1 AFM2 : Aflatoxin M2 BICP : –Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt BSA : Bovine Serum Albumine CMC : 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) CMO : O–(Carboxymethyl) hydroxylamine hemihydrochloride DCC : dicyclohexylmethanediimine EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide : hydrochloride ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FCA : Freund’s Complete Adjuvant FIA : Freund’s Incomplete Adjuvant FPLC : Fast protein liquid chromatography GNP : Gold Nanoparticles (hạt nano vàng) HPLC : High – performance liquid chromatography Ig : Immunoglobulin KLH : Keyhole Limpet Hemocyanin LFA : Lateral Flow Immunoassay NHS : N-hydroxysulfosuccinimide PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS : Phosphate Buffered Saline PrA : Protein A TLC : Thin Layer Chromatography WHO : World Healthy Organization Kết thử que cho thấy thời gian kiểm tra que bảo quản năm, vạch tín hiệu đảm bảo kết tƣơng ứng với que âm que dƣơng Đồng thời vạch tín hiệu cho màu đỏ tía 3.5 Nghiên cứu thử nghiệm KIT 3.5.1 Nghiên cứu thử nghiệm phịng thí nghiệm 3.5.1.1 Nghiên cứu tạo mẫu thức ăn chăn nuôi nhiễm Aspergillus flavus sinh không sinh độc tố B1 Trên mẫu G221 không nhiễm độc tố Aflatoxin B1 tiến hành gây nhiễm Aspergillus falvus G1 (Cung cấp Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia) vàAspergillus Oryzae Haimẫu sau thời gian nuôi đƣợc tiến hành thử nghiệm phƣơng pháp HPLC Vinacert đạt 44,4 µg/kg Aflatoxin B1 KPH (LOD = 1µg/kg Aflatoxin B1) Hình 3.94: Thức ăn chăn ni G221 (a) trước,(b) sau nhiễm nấm A flavus (c) A oryzae 155 3.5.1.2 Nghiên cứu thử nghiệm que thử AFB1 với mẫu thức ăn chăn ni phịng thí nghiệm Tiến hành thử mẫu thức ăn chăn nuôi nhiễm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 mẫu thức ăn chăn nuôi nhiễm Aspergillus oryzaekhông sinh độc tố, theo quy trình xác định 5ppb ‘ Hình 3.95.Thử que Aflatoxin với mẫu nhiễm nấm (a) sinh độc tố (b) không sinh độc tố Aflatoxin B1 3.5.2 Kiểm nghiệm que thử Que đƣợc kiểm nghiệm Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Chuẩn Aflatoxin M1 đƣợc cung cấp từ hãng Biopure (Mỹ), code: 002030, lot: L19082M, hạn sử dụng: 19.08.2020 Chuẩn Aflatoxin B1 đƣợc cung cấp từ hãng Biopure (Mỹ), code: L19302B, lot: 1162-65-8, hạn sử dụng: 20.01.2021 Tìm mẫu trắng thức ăn chăn nuôi (TACN) mẫu sữa tƣơi (ST), phân tích 10 lần theo quy trình thao tác chuẩn đƣợc Vilas Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia máy sắc ký lỏng khối phỏ hai lần (LC-MS/MS, 5500 ABSciex), kết sắc ký đồ khơng có tín hiệu chất phân tích Aflatoxin B1 Aflatoxin M1 - Mẫu thức ăn chăn nuôi (Hàm lƣợng Aflatoxin B1: KPH, LOD: 0,1 µg/kg) - Mẫu sữa tƣơi (Hàm lƣợng Aflatoxin M1: KPH, LOD: 0,1 µg/kg) 156 3.5.2.1 Độ đặc hiệu Tiến hành phân tích mẫu trắng mẫu thêm chuẩn 10 µg/kg theo quy trình Viện Thú y Một phần dịch chiết đem đo thiết bị LC-MS/MSso sánh đối chiếu Các mẫu phân tích đƣợc ký hiệu từ TACN-1 đến TACN-10, từ ST-1 đến ST-10 Kết phân tích đƣợc trình bày 3.16 3.17 ảng 3.14.Kết độ đặc hiệu kít Aflatoxin B1 STT Kit thử Aflatoxin B1 LC-MS/MS Mẫu âm Mẫu dƣơng Mẫu âm tính Mẫu dƣơng TACN-1 tính (–) tính (+) KPH 6,2 TACN-2 (–) (+) KPH 5,7 TACN-3 (–) (+) KPH 6,3 TACN-4 (–) (+) KPH 6,5 TACN-5 (–) (+) KPH 5,1 TACN-6 (–) (+) KPH 5,8 TACN-7 (–) (+) KPH TACN-8 (–) (+) KPH 4,8 TACN-9 (+) (+) KPH 5,9 TACN-10 (–) (+) KPH 6,5 tính Chú thích: (–): Âm tính (+): Dương tính Kết luận: Kết thử nghiệm 10 que thử cho mẫu âm tính phát 01 que thử bị dƣơng tính giả, tỷ lệ mẫu dƣơng tính giả 10% Độ đặc hiệu kít đạt 157 90% Các mẫu thử âm tính đo thiết bị LC-MS/MS cho kết âm tính Các mẫu thêm chuẩn đo thiết bị LC-MS/MS cho kết khoảng 4,8 – 6,5 µg/kg với độ lệch chuẩn tƣơng đối 9,6% ảng 3.15 kết độ đặc hiệu kít Aflatoxin M1 Kit thử Aflatoxin M1 STT Mẫu âm tính Mẫu dƣơng tính LC-MS/MS (µg/kg) Mẫu âm tính Mẫu dƣơng tính ST-1 (–) (+) KPH 7,4 ST-2 (–) (+) KPH 6,9 ST-3 (–) (+) KPH 5,4 ST-4 (–) (+) KPH 7,4 ST-5 (–) (+) KPH 7,8 ST-6 (–) (+) KPH 6,8 ST-7 (–) (+) KPH 6,4 ST-8 (–) (+) KPH 5,6 ST-9 (–) (+) KPH 7,4 ST-10 (–) (+) KPH 7,2 Chú thích: (–): Âm tính (+): Dương tính Kết luận: Tất kít thử nghiệm đạt yêu cầu với tỷ lệ mẫu dƣơng tính giả 0%, độ đặc hiệu kít đạt 100% Các mẫu thử âm tính đo thiết bị LCMS/MS cho kết âm tính Các mẫu thêm chuẩn đo thiết bị LC-MS/MS cho kết khoảng 5,4 – 7,8 µg/kg với độ lệch chuẩn tƣơng đối 11,7% 158 3.5.2.2 Giới hạn phát kit Giới hạn phát kít nồng độ xác định chắn có mặt (100%) chất phân tích Giới hạn phát phƣơng pháp dựa vào việc phân tích mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ công bố kít thử Nồng độ thêm chuẩn mẫu thử µg/kg cho kít thử Aflatoxin B1 Aflatoxin M1 Kết đƣợc trình bày ảng 3.16 đánh giá giới hạn phát kít STT Mẫu TACN thêm chuẩn Aflatoxin B1 µg/kg Kit thử LC-MS/MS Aflatoxin B1 Mẫu sữa tƣơi thêm chuẩn Aflatoxin M1 µg/kg Kit thử LC-MS/MS Aflatoxin M1 M1 (+) 3,1 (+) 2,7 M2 (+) 3,2 (+) 2,6 M3 (+) 3,0 (+) 2,6 M4 (+) 3,3 (+) 2,6 M5 (+) 3,2 (+) 2,7 M6 (+) 3,1 (+) 2,8 M7 (+) 3,7 (+) 2,6 M8 (+) 3,2 (+) 2,7 M9 (+) 3,1 (+) 2,8 M10 (+) 4,1 (+) 2,6 159 Kết luận: Hai kít Aflatoxin B1 Aflatoxin M1 đạt giới hạn phát 5µg/kg cho thức ăn chăn ni sữa tƣơi, tƣơng ứng Độ nhạy kit đạt 100% 3.5.2.3 Kết luận Bộ KIT thử nhanh Aflatoxin B1, Aflatoxin M1 đạt độ nhạy 100%; độ đặc hiệu lần lƣợt 90% 100% Giới hạn phát Aflatoxin B1 thức ăn chăn ni 5µg/kg (5 ppb), giới hạn phát Aflatoxin M1 sữa tƣơi 5µg/kg (5 ppb) 160 CHƢƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết thu đƣợc, đƣa số kết luận kiến nghị nhƣ sau: KẾT LUẬN - Đã xác định đƣợc điều kiện thích hợp để gắn cộng hợp Aflatoxin (Aflatoxin B1 M1) với protein chất mang BSA KLH để tạo thành phức AFB1-BSA, AFB1-KLH, AFM1-BSA AFM1-KLH - Gây đáp ứng miễn dịch thành công thỏ để sản xuất kháng huyết kháng AFB1 AFM1 Tinh đƣợc kháng thể kháng AFB1 AFM1 phƣơng pháp sắc ký lực đáp ứng yêu cầu để chế tạo que thử - Xác định đƣợc điều kiện thích hợp để chế tạo thành phần que thử chế tạo thành công đƣợc que thử nhanh phát nhanh afltoxin B1 thức ăn chăn nuôi M1 sữa Que thử có độ nhạy đạt 96,7% độ đặc hiệu đạt 90%; thời gian thử < phút; ngƣỡng pháp đạt ppb KIẾN NGHỊ Đề tài đạt đƣợc kết tốt chế tạo đƣợc que thử đạt tiêu chuẩn tƣơng đƣơng với sản phẩm thƣơng mại Tuy nhiên, để tiến tới sản xuất đồng loạt, chúng tơi có số kiến nghị nhƣ sau: - Sản phẩm kit thử đề tài cần đƣợc thử nghiệm, hoàn thiện nhiều mẫu khác - Tiếp tục thực dự án để hồn thiện sản xuất sản phẩm quy mô lớn đƣa vào phục vụ sống 161 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003), Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, trang 53 – 198 Lê Thị Mai Hƣơng, Trần Văn Hùng (2015), ―Ngành chăn nuôi trƣớc thách thức Việt Nam gia nhập Cộng đồng Kinh tế ASEAN (AEC)‖, Phát triển Hội nhập, số 23(33), trang 13-18 Lê Văn Giang, Phan Thị Kim (2011), ―Đánh giá ô nhiễm Aflatoxin lạc, ngô thử nghiệm áp dụng biện pháp phòng trừ cho sản phẩm chế biến xã huyện Tân Kỳ tỉnh Nghệ An‖, Y học thực hành 2011, số 6, tr 79-81.) Nguyễn Thùy Châu, Đào Thị Hƣơng, Vũ Thị Hƣơng (2011), ―Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin B1 số nông sản giai đoạn bảo quản Việt Nam‖, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, số 21, tr 13 - 21 Tiếng Anh Agriopoulou S et al (2016) Kinetic study of aflatoxins degradation in the presence of ozone Food Control Alexander E Urusov, Anatoly V Zherdev, Boris B Dzantiev (2014) Use of gold nanoparticle-labeled secondary antibodies to improve the sensitivity of an immunochromatographic assay for aflatoxin B1 ORIGINAL PAPER, Microchim Acta Allcroft R., Lewis G (1963), ―Groundnut toxicity in catlle‖, Vet Rec, 75, pp 487-493 Amaike.S, Keller N.P (2011), ―Aspergillus flavus‖, Annu Rev Phytopathol, 49, pp 107-33 Asao T., Büchi G., Abdel-Kader M M., Chang S B., Wick E L., Wo-gan G N., (1965), ―The structure of aflatoxin B1 and G1‖, Chem Soc, 87:882 162 10 Asao T., Büchi G., Abdel-Kader M.M., Chang S.B., Wick E.L., Wo-gan G.N., (1963), ―Aflatoxin B and G‖, Chem Soc, 85:1706 11 Atehnkeng J, Ojiambo PS, Ikotun T, Sikora RA, Cotty PJ, Bandyopadhyay R (2008) Evaluation of atoxigenic isolates of Aspergillus flavus as potential biocontrol agents for aflatoxin in maize Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 25(10):1264-71 12 Ayub M., Sachan D (1997), ―Dietary factors affecting aflatoxin bi carcinogenicity,‖ Malaysian Journal of Nutrition, (3), pp 161–197 13 Azziz-Baumgartner E., Lindblade K., Gieseker K., Rogers H.S., Kieszak S., Njapau H (2005), ―Aflatoxin Investigative Group Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004‖ Environ Health Perspect, 113(12), pp 1779–83 14 Babu D (2010), Rapid and Sensitive Detection of Aflatoxin in Animal Feeds and Food Grains Using Immunomagnetic Bead Based Recovery and Real-Time Immuno Quantitative PCR (RT-iqPCR) Assay, Oklahoma State University 15 Bbosa G.S., Kitya D., Odda J., and Ogwal-Okeng J (2013), ―Aflatoxins metabolism, effects on epigenetic mechanisms and their role in carcinogenesis‖, Health, 5(10), pp 14–34 16 Bhat R.V., Krishnamachari K.A (1977), Follow-up study of aflatoxic hepatitis in parts of western India Indian J Med Res 66(1) pp 55–8 17 Boutrif E (1995), ―FAO programmes for prevention, regulation, and control of mycotoxins in food‖, Nat Toxins, 3, pp 322–326 18 Boyer R.F (1993), Modern Experimental Biochemistry, Benjamin/Cummings Publishing Company 19 Braăse S (2013), The Chemistry of Mycotoxins, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products‖, Springer-Verlag Wien, 97(2), pp 3-21 20 Braithwaite A., Smith F.J., and Stock R (1985), Chromatographic Method, Chapman and Hall 163 21 Breidbach, A (2017) A Greener, Quick and Comprehensive Extraction Approach for LC-MS of Multiple Mycotoxins Toxins, 9(3), 91 22 Chen Y.X, T G (2011) "Bioorthogonal chemistry for site specific labeling and surface immobilization of protein Acc Chem Res, 44(9):762-73) 23 Chu, F S and I Ueno (1977) "Production of antibody against aflatoxin B1‖Appl Environ Microbiol, 33(5): 1125–1128 24 Codner R.C., Sargeant K., Yeo R (1963), ―Production of aflatoxin by the culture of strains of Aspergillus flavus-oryzae on sterilized peanuts‖, Biotech Bioeng, 5, pp 185-192 25 Cullen J.M., Newberne P.M., Eaton D., and Groopman J (1993), ―Acute hepatotoxicity of aflatoxins‖, in The Toxicology of Aflatoxins: Human Health, Veterinary and Agricultural Significance, pp 3–26 26 Iongh H., Vles R., and De Vogel P (1964), ―The occurrence and detection of aflatoxin in food‖, in Proceedings of the Symposium on Mycotoxins in Foodstuffs, G H Wogan, Ed., p 235, MIT Press, Cambridge, Mass, USA 27 Delmulle B.S., De Saeger S.M.D.G., Sibanda L., Barna-Vetro I., and van Peteghem C.H (2005), ―Development of an immunoassay-based lateral flow dipstick for the rapid detection of aflatoxin B1 in pig feed‖, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(9), pp 3364–3368 28 Dors G.C.; Bierhals V.S., Badiale-Furlong E (2011) ―Parboiled rice: chemical composition and the occurrence of mycotoxins‖ Ciência e Tecnologia de Alimentos, 31(1), pp 172-177 29 Ehrlich K C., Cotty P J (2004) An isolate of Aspergillus flavus used to reduce aflatoxin contamination in cottonseed has a defective polyketide synthase gene Applied microbiology and biotechnology, 65(4):473-8 30 GA (1997), Agency (ATSDR) Toxicological for Toxic Profile Substances for Hexane and Disease Draft for Registry Public Comment Public Health Service, U.S Department of Health and Human Services, Atlanta 164 31 Gallagher E.P., Kunze K.L., Stapleton P.L., and Eaton D.L (1996), ―The kinetics of aflatoxin B1 oxidation by human cDNA-expressed and human liver microsomal cytochromes P450 1A2 and 3A4‖, Toxicology and Applied Pharmacology, 141(2), pp 595–606 32 Gournama H., Bullerman L.B (1995), ―Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus: aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds: a review‖, J Food Protect, 58, pp 1395–1404 33 Giray B., Girgin G., Engin A.B., Aydın S., Sahin G (2007) ―Aflatoxin levels in wheat samples consumed in some regions of Turkey‖, Food Control,18, pp 23–29 34 Guan S, Ji C, Zhou T, Li J, Ma Q, Niu T (2008) ―Aflatoxin B(1) degradation by Stenotrophomonas maltophilia and other microbes selected using coumarin medium International journal of molecular sciences‖, 9(8):1489-503 35 Hoare DG, Koshland DE Jr, (1967), ―A method for the quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins‖, 242(10):2447-53 36 Hussain I., Anwar J (2008), ―A study on contamination of aflatoxin M1 in raw milk in the Punjab province of Pakistan‖, Food Control, 19, pp 393–395 37 Hussein H.S., Brasel J.M (2011), ―Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals‖, Toxicology, 167(2), pp 101–134 38 Huybrechts B (2011), Evaluation of Immunoassay Kits for Aflatoxin Determination in Corn & Rice, CODA-CERVA, National Reference Laboratory on Mycotoxins 39 IARC (1993), Some naturally occurring substances - food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum Lyon, France: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, pp 245–391 165 40 Jelinek C.F., Pohland A.E., WoodG.E.(1989), ―Worldwide occurrence of mycotoxins in foods and feeds - an update‖, Assoc Off Anal Chem, 72(2), pp 223-30 41 Jin X., Liu X., Chen L., Jiang J., Shen G., and Yu R., ―Biocatalyzed deposition amplification for detection of aflatoxin B1 based on quartz crystal microbalance‖, Analytica Chimica Acta, 645(1-2), pp 92–97 42 Johnson W.W., Yamazaki H., Shimada T., Ueng Y.F., Guengerich F.P (1997), ―Aflatoxin B1 8,9-epoxide hydrolysis in the presence of rat and human epoxide hydrolase‖, Chemical Research in Toxicology, 10(6), pp 672–676 43 K Spinella, L Mosiello, G Palleschi, and F Vitali, ―Development of a qcm (quartz crystal microbalance) biosensor to the detection of aflatoxin b1,‖ Open Journal of Applied Biosensor, vol 2, no 4, pp 112–119 44 Kaori Fujita, Junichi Sugiyama, Mizuki Tsuta, Mario Shibata (2013) Detection of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in Nutmeg Extract Using Fluorescence Food Sci Technol Res, 19 (4), 539 – 545 45 Kensler T.W., Roebuck B.D., Wogan G.N., Groopman J.D (2011), ―Aflatoxin: a 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology‖, Toxicol Sci, 120 (1), pp 28-48 46 Krishnamachari K.A., Bhat R.V., Nagarajan V., Tilak T.B (1975), ―Hepatitis due to aflatoxicosis An outbreak in Western India‖, Lancet, 1(7915), pp 10613 47 Langone J.J and van Vunakis H (1976), ―Aflatoxin B1: specific antibodies and their use in radioimmunoassay‖, Journal of the National Cancer Institute, 56(3), pp 591–595 48 Lequin R.M (2005), ―Enzyme immunoassay (eia)/enzyme-linked immunosorbent assay (elisa)‖, Clinical Chemistry, 51, pp 2415–2418 49 Lewis L., Onsongo M., Njapau H., Schurz-Rogers H., Luber G., Kieszak S (2005), ―Kenya Aflatoxicosis Investigation Group Aflatoxin contamination of 166 commercial maize products during an outbreak of acute aflatoxicosis in eastern and central Kenya‖, Environ Health Perspect, 113(12), pp 1763–7 50 Li P., Zhang Q., Zhang D (2011), ―Aflatoxin measurement and analysis,‖ in Aflatoxins—Detection, Measurement and Control, I Torres-Pacheco, Ed., pp 183–208, Intech, Shanghai, China 51 Luciana de CASTRO, Eugenia Azevedo VARGAS (2001) DETERMINING AFLATOXINS B1, B2, G1 AND G2 IN MAIZE USING FLORISIL CLEAN UP WITH THIN LAYER CHROMATOGRAPHY AND VISUAL AND DENSITOMETRIC QUANTIFICATION Ciênc Tecnol Aliment, 21 no.1 52 McLean M., Dutton M.F (1995), ―Cellular interactions and metabolism of aflatoxin: an update‖, Pharmacol Ther, 65, pp 163–192 53 Newberne P.M., Butler W.H (1969), ―Acute and chronic effects of aflatoxin on the liver of domestic and laboratory animals: A review‖, Cancer Res, 29, pp 236-250 54 Newberne P.M., Harrington D.H., Wogan G N (1966), ―Effects of cirrhosis and other liver insults on induction of liver by aflatoxin in rat‖ Lab Invest, 13: pp 1962-1969 55 Ngindu A., Johnson B.K., Kenya P.R., Ngira J.A., Ocheng D.M., Nandwa H (1982), ―Outbreak of acute hepatitis caused by aflatoxin poisoning in Kenya‖, Lancet, 1(8285), pp 1346–8 56 Park D L (2002) Effect of processing on aflatoxin Advances in experimental medicine and biology, 504:173-9 57 Payne G.A., Brown M.P (1998), ―Genetics and physiology of aflatoxin biosynthesis‖, Annu Rev Phytopathol, 36, pp 329-62 58 Pearson T., Wicklow D., Maghirang E., Xie F., and Dowell F (2001), ―Detecting aflatoxin in single corn kernels by transmittance and reflectance spectroscopy‖, Transactions of the American Society of Agricultural Engineers, 44(5), pp 1247–1254 167 59 Petterson H and Langseth W (2002), ―Intercomparison of trichothecenes analysis and feasibility to produce certified calibrants‖, EU Reports EUR 20285, European Commission BCR Information Project 60 Ramesh J., Sarathchandra G., and Sureshkumar V (2013), ―Analysis of feed samples for aflatoxin b1 contamination by hptlc-a validated method‖, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2, pp 373–377 61 Ramón Asis , Romina D Di Paola & Mario A J Aldao (2002) Determination of Aflatoxin B in Highly Contaminated Peanut Samples Using HPLC and ELISA Food and Agricultural Immunology, 14:3, 201-208 62 Rauch P., Fukal L., Prošek J., Březina P., and Káš J (1987), ―Radioimmunoassay of aflatoxin M1‖, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 117(3), pp 163–169 63 Romani L (2004), ―Immunity to fungal infections‖, Nat Rev Immunol, 4(1), pp 1-23 64 Severns D.E., Clements M.J., Lambert R.J., White D.G.J (2003), ―Comparison of Aspergillus ear rot and aflatoxin contamination in grain of high-oil and normal-oil corn hybrids‖, Food Prot, 66(4), pp 637-43 65 Shannon (1983) Extraction and Thin Layer Chromatography of Aflatoxin B1 in Mixed Feeds J Asoc Off Anal Chem, 66 66 Stroka J., Anklam E (2002), ―New strategies for the screening and determination of aflatoxins and the detection of aflatoxin-producing moulds in food and feed‖, TrAC—Trends in Analytical Chemistry, 21(2), pp 90–95 67 Teniola OD, Addo PA, Brost IM, Färber P, Jany KD, Alberts JF, van Zyl WH, Steyn PS, Holzapfel WH (2005) Degradation of aflatoxin B(1) by cell-free extracts of Rhodococcus erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp nov DSM44556(T) International journal of food microbiology, 105(2):1117 168 68 Usha P Sarma, Preetida J Bhetaria, Prameela Devi and Anupam Varma (2017) Aflatoxins: Implications on Health 32(2): 124–133 69 Vondracek M., Xi Z., Larsson P (2001), ―Cytochrome P450 expression and related metabolism in human buccal mucosa‖, Carcinogenesis, 22(3), pp 481– 488 70 Wild C P and Turner P C (2002), ―The toxicology of aflatoxins as a basis for public health decisions,‖ Mutagenesis, 17(6), pp 471–481 71 Williams J.H., Phillips T.D., Jolly P.E., Stiles J.K., Jolly C.M (2004), ―Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions‖, Am J Clin Nutr, 80, pp 1106–1122 72 Wu Q, Jezkova A, Yuan Z, Pavlikova L, Dohnal V, Kuca K (2009) Biological degradation of aflatoxins Drug metabolism reviews, 41(1):1-7 Trang Web 73 http://www.fao.org/3/x5036e/x5036E0J.HTM 74 http://www.fao.org/3/y5499e/y5499e07.htm#TopOfPage 75 http://fungi.myspecies.info/all-fungi/aspergillus-flavus 76 https://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_parasiticus 169