Bài tập 12

Bài tập 12.1: Xây dựng quy trình xác định hoạt độ enzym nattokinase chế phẩm viên uống chứa nattokinase (nhóm tự chọn chế phẩm) Sản phẩm lựa chọn: NattoEnzym Chọn đơn vị tính Hộp Vỉ Viên Danh mục Thần kinh não Dạng bào chế Viên nang Quy cách Hộp Vỉ x 10 Viên Xuất xứ thương hiệu Việt Nam Nhà sản xuất DƯỢC HẬU GIANG Thành phần Nattokinase, Microcrystalline cellulose, Magnesi stearat Mô tả ngắn NattoEnzym hỗ trợ hoạt huyết, tăng tuần hồn máu, giảm nguy hình thành cục máu đông, giảm nguy xây xẩm mặt mày lưu thông máu Hỗ trợ giảm nguy tắc mạch, đột quỵ huyết khối Phương pháp chiết tách, tinh kết tinh enzym nattokinase từ NattoEnzym 3.1.Chiết tách enzym nattokinase Loại bỏ nang mềm, thu lấy phần dịch lỏng Chiết xuất phân đoạn ethanol kết tủa nattokinase: Thêm hai lần thể tích ethanol 50% vào dịch lỏng, lắc 200 vòng/phút 37 oC Sau ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút, phần phía thu thập ethanol thêm vào phần phía để đạt nồng độ cuối 75% để kết tủa nattokinase 3.2 Kết tinh enzym nattokinase Tiến hành kết tinh enzym nattokinase dung dịch (NH 4)2SO4 Quá trình kết tinh tiến hành từ từ kéo dài vài ngày chí hàng tuấn muốn nhận tinh thể tinh khiết Thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch enzym nattokinase đậm đặc làm đục nhẹ dung dịch Sau đặt dung dịch vào nơi, đồng thời tăng từ từ nồng độ muối dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc vào dung dịch enzym nattokinase theo giọt, thêm muối qua màng bán thấm cho bay chậm chạp dung dịch enzym nattokinase.Trong trình kết tinh thay đổi số pH nhiệt độ [1] Xác định hoạt độ enzym Phương pháp: Quang phổ hấp thụ phân tử 4.1 Nguyên tắc phương pháp Dưới tác dụng thrombin, fibrinogen dạng hịa tan chuyển thành fibrin khơng hịa tan, Nattokinase thúc đẩy q trình giáng hóa fibrin tạo sản phẩm giáng hóa fibrin (FDP) Phân tích gián đoạn: cho Nattokinase tác dụng với chất sau khoảng thời gian xác định làm ngừng phản ứng enzyme acid tricloacetic 0,2M sau đo lượng chất lại phương pháp đo độ hấp thụ dd bước sóng 275nm [7] 4.2 Cách tiến hành Nattokinase hịa tan pha lỗng với dung dịch pha loãng (2mM Calci sulfat dihydrate (CaSO 4.2H2O) + 10mM NaCl 0,005%Triton X-100) Với mẫu trắng mẫu thử, ủ 1,4mL đệm Natri borat 50mM với 0,4mL dung dịch fibrinogen 0,72% phút Sau đó, thêm 0,1mL thrombin 20U/mL vào hai ống trộn Sau 10 phút, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu thử ủ với thời gian 60 phút nhiệt độ 40°C Thêm 2,0mL acid tricloacetic 0,2M để dừng phản ứng, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu trắng ủ thêm 20 phút Các mẫu li tâm với tốc độ 6000rpm phút độ hấp thụ dịch bề mặt đo bước sóng 275nm so với nước cất Hoạt tính tiêu sợi huyết nattokinase tính theo cơng thức sau: Trong đó: AT : độ hấp thụ dung dịch mẫu AB : độ hấp thụ dung dịch trắng T : thời gian phản ứng (phút) V : thể tích dịch chiết nattokinase (mL) m : khối lượng mẫu thử (g) D : hệ số pha loãng Một đơn vị (1FU) hoạt độ nattokinase định nghĩa lượng enzym làm tăng độ hấp thụ dịch lọc bước sóng 275nm thêm 0,01 phút điều kiện quy định [6] Đo lượng hoạt động thực ba lần lặp lại Hoạt độ đo lường so sánh với hoạt độ gắn nhãn để ước lượng chất lượng sản phẩm