Bg kiem nghiem phan 2 5088

Bài XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC VÀ TRONG DƯỢC LIỆU MỤC TIÊU Trình bày phương pháp xác định: khối lượng riêng, tỷ trọng, sớ khúc xạ, góc quay cực và góc quay cực riêng, nhiệt độ nóng chảy Biết cách thử độ rã và độ hòa tan viên nén, viên nang NỘI DUNG THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC 1.1 Thử giới hạn Amoni Dùng phương pháp A, trừ có dẫn khác chuyên luận 1.1.1 Phương pháp A Mẫu thử: Hòa tan lượng chế phẩm thử dẫn chuyên luận với 14 ml nước ớng nghiệm kiềm hóa nếu cần dung dịch natri hydroxyd 2M (TT), thêm nước vừa đủ 15 ml Thêm 0.3 ml thuốc thử Nessler (TT), lắc để yên phút Mẫu chuẩn: Lấy xác 10 ml dung dịch ion amoni mẫu phần triệu NH4 cho vào ống nghiệm, pha lỗng với nước thành 15 ml Thêm 0,3 ml th́c thử Nessler (TT), lắc để yên phút So sánh màu tạo thành ống thử với mẫu chuẩn chuẩn bị đồng thời Khi so màu, quan sát theo dọc trục ống nghiệm ánh sáng khuếch tán trắng Màu ống thử không đậm màu ống mẫu 1.1.2 Phương pháp B Cho lượng theo dẫn chế phẩm thử nghiền mịn vào bình 25 ml có nút đậy polyethylen và hòa tan hoặc phân tán ml nước Thêm 0,3 g magnesi oxyd nặng (TT) Đậy bình sau đặt x́ng nắp polyethlen mẩu giấy tẩm mangan bạc (TT) rộng mm làm ẩm vài giọt nước Lắc xoay trịn bình, tránh chất lỏng bắn lên và để n ở 400C 30 phút 72 Màu xám nếu xuất mẫu giấy mangan bạc ở bình thử khơng đậm ở bình mẫu tiến hành đồng thời điều kiện với lượng dung dịch amoni mẫu dẫn chuyên luận, ml nước và 0,3 magnesi oxyd nặng (TT) 1.2 Thử giới hạn Arsen Dùng phương pháp A, trừ có dẫn khác chuyên luận Chỉ giới thiệu phương pháp A 1.2.1 Phương pháp A Dụng cụ: Bộ dụng cụ thử arsen gồm bình nón nút mài cỡ 100 ml đậy nút thủy tinh mài, xuyên qua nút có ớng thủy tinh dài khoảng 200 mm, đường kính là mm Phần ớng thủy tinh kéo nhỏ lại để có đường kính 1mm Cách đầu ớng 15 mm có lỗ thành ớng với đường kính – 3mm Khi gắn ớng thủy tinh vào nút lỗ này phải ở cách mặt nút nhất là 3mm Đầu ớng thủy tinh có đĩa trịn phẳng, mặt phẳng đĩa vng góc với trục ống Một ống thủy tinh thứ hai dài 30 mm, có đường kính và có đĩa trịn phẳng tương tự ống thứ nhất, đặt tiếp xúc mặt đĩa trịn với ớng thứ nhất và giữ chặt với ớng thứ nhất hai dây lị xo Tiến hành: Cho vào ống thủy tinh dài khoảng 50 – 60mg bơng tẩm chì acetat (TT) Đặt miếng giấy tẩm thủy ngân (II), bromid (TT), hình trịn hay hình vng, có kích thước đủ để phủ kín lỗ trịn hai ống thủy tinh, giữ chặt ống thủy tinh dây lị xo Cho vào bình nón lượng chế phẩm thử theo dẫn chuyên ḷn Hịa tan hoặc pha lỗng với nước thành 25 ml Thêm 15 ml acid hydrocloric (TT), 0,1 ml SnCl2(TT) và ml dung dịch kali iodid 20% (TT) Để yên 15 phút thêm g kẽm hạt arsen (TT) Đậy bình nón nút lắp sẵn giấy thử ở Ngâm bình nước ở nhiệt độ cho khí giải phóng đặn 73 Song song tiến hành mẫu so sánh điều kiện, dùng 1ml dung dịch arsen mẫu phần triệu As hịa lỗng với nước thành 25ml thay thế cho chế phẩm thử Sau nhất lấy các miếng giấy tẩm thủy ngân (II) bromid so sánh các vết màu Vết màu nếu có miếng giấy bình thử phải khơng đậm vết màu miếng giấy bình mẫu 1.3 Thử giới hạn Calci: Thêm ml dung dịch amoni oxalat 4% (TT) vào 0,2 dung dịch calci mẫu 100 phần triệu Ca ethanol 96% Sau phút, thêm hỗn hợp gồm ml dung dịch acid axetic 2M (TT) và 15 ml dung dịch chế phẩm thử dẫn chuyên luận và lắc Sau 15 phút, so sánh độ đục tạo thành ống thử với độ đục mẫu chuẩn chuẩn bị đồng thời điều kiện thay dung dịch chế phẩm thử hỗn hợp gồm 10 ml dung dịch calci mẫu 10 phần triệu Ca và 5ml nước - Yêu cầu: Độ đục ống thử phải không đậm độ đục chuẩn 1.4 Thử giới hạn Clorid: Mẫu thử: Chuẩn bị dung dịch thử dẫn chuyên luận, cho vào ớng nghiệm, pha lỗng với nước đến 15 ml Thêm ml dung dịch acid nitric 2M (TT) và 1ml dung dịch bạc nitrat 2% (TT) Để yên phút, tránh ánh sáng So sánh độ đục tạo thành ống thử với độ đục chuẩn chuẩn bị đồng thời, quan sát dọc theo trục ống nghiệm ánh sáng khuếch tán đen Độ đục ống thử không lớn độ đục chuẩn Mẫu chuẩn: Chuẩn bị điều kiện với ống thử, thay dung dịch thử hỗn hợp gồm 10 ml dung dịch clorid mẫu phần triệu Cl và ml nước 1.5 Kim loại nặng: gồm phương pháp Có thể dùng các phương pháp tùy theo dẫn chuyên luận riêng Giới thiệu phương pháp 1.5.1 Phương pháp Lấy 12 ml dung dịch chế phẩm thử pha chế dẫn chuyên luận, cho vào ống nghiệm, thêm ml dung dịch đệm acetat pH 3,5 Lắc Thêm 1,2 ml dung dịch thioacetamid (TT), lắc để yên phút 74 Chuẩn bị đồng thời ống chuẩn dùng hỗn hợp 10 ml dung dịch ion chì mẫu phần triệu Pb hoặc dung dịch chì mẫu phần triệu Pb tùy theo dẫn chuyên luận, và 2ml dung dịch chế phẩm thử So sánh màu tạo thành ống thử và ống chuẩn Màu nâu ống thử không đậm màu ớng mẫu Ớng mẫu ch̉n có màu nâu nhạt so sánh với ống trắng chuẩn bị đồng thời điều kiện, dùng 10 ml nước và ml dung dịch chế phẩm thử 1.6 Thử giới hạn sắt: Hòa tan lượng chế phẩm thử quy định nước pha loãng với nước tới 10 ml hoặc lấy 10 ml dung dịch chế phẩm thử dẫn chuyên luận cho vào ống Nessler Thêm 2ml dung dịch acid citric 20% (TT) và 0,1 ml acid mercaptoacetic (TT) Lắc đều, kiềm hóa dung dịch amoniac 10M (TT) và pha với nước tới 20 ml Chuẩn bị dung dịch màu chuẩn điều kiện, dùng 10ml dung dịch sắt mẫu phần triệu Fe thay cho dung dịch chế phẩm thử Sau phút, màu hồng tạo thành dung dịch thử không đậm màu chuẩn XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LẪN TRONG DƯỢC LIỆU Tạp chất lẫn dược liệu bao gồm tất cả các chất ngoài quy định dược liệu như: Đất, đá, rơm rạ, cỏ khác, các phận khác không quy định làm dược liệu, xác côn trùng 2.1.Cách xác định Cân lượng mẫu vừa đủ dẫn chuyên luận, dàn mỏng tờ giấy, quan sát mắt thường hoặc kính lúp, cần có thể dùng rây để phân tách tạp chất và dược liệu Cân phần tạp chất và tính phần trăm sau: x%  a  100 p a: Khới lượng tạp chất tính gam p: Khới lượng mẫu thử tính gam 75 2.2 Ghi Trong số trường hợp nếu tạp chất rất giớng với th́c có thể phải làm các phản ứng định tính hoá học, phương pháp vật lý hoặc dùng kính hiển vi để phát tạp chất Tỷ lệ tạp chất tính bao gồm cả tạp chất phát phương pháp này Lượng mẫu lấy thử nếu chun ḷn riêng khơng quy định lấy sau: Hạt và quả rất nhỏ (như hạt Mã đề): 10 g Hạt và quả nhỏ: 20 g Dược liệu thái thành lát: 50 g XÁC ĐỊNH TỶ LỆ VỤN NÁT CỦA DƯỢC LIỆU Cân lượng dược liệu nhất định (p gam) loại tạp chất Rây qua rây có sớ quy định theo chun ḷn riêng Cân toàn phần lọt qua rây (a gam) Tính tỷ lệ vụn nát (X%) (từ kết quả trung bình ba lần thực hiện) theo cơng thức: X%  a  100 p Ghi chú: Lượng dược liệu lấy để thử (tuỳ theo bản chất dược liệu) từ 100 đến 200 g Đối với dược liệu mỏng manh lắc nhẹ, tránh làm vụn nát thêm Phần bụi và bột vụn không phân biệt mắt thường tính vào mục tạp chất XÁC ĐỊNH TRO SULFAT Áp dụng các phương pháp sau nếu chun ḷn riêng khơng có hướng dẫn khác giới thiệu phương + Phương pháp Nung chén sứ hoặc chén platin tới đỏ 10 phút, để nguội bình hút ẩm cân 76 Nếu khơng có dẫn đặc biệt chuyên luận riêng cho g mẫu thử vào chén nung, làm ẩm với acid sulfuric (TT), đốt cẩn thận lại làm ẩm với acid sulfuric (TT) và nung ở khoảng 800 0C Làm nguội cân Nung lại 15 phút, làm nguội cân nhắc lại Lặp lại quá trình này cho đến đến khới lượng không đổi Nếu cắn tro sulfate kiểm tiêu kim loại nặng nung mẩu ở nhiệt độ 500 - 6000 C 77 Bài KIỂM NGHIỆM THUỐC BỘT VÀ THUỐC CỐM MỤC TIÊU Trình bày các yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử để đánh giá chất lượng th́c bột, th́c cớm Giải thích và đánh giá kết quả kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm thành phẩm cụ thể các dạng bào chế Trình bày ví dụ kiểm nghiệm các dạng bào chế thuốc bột NỘI DUNG KIỂM NGHIỆM THUỐC BỘT 1.1 ĐỊNH NGHĨA Thuốc bột là dạng thuốc rắn, gồm các hạt nhỏ, khô tơi, có độ mịn xác định, có chứa hay nhiều loại dược chất Ngoài dược chất, th́c bột có thể thêm các tá dược tá dược độn, tá dược hút, tá dược màu, tá dược điều hương, vị Th́c bột có thể dùng để ́ng, để pha tiêm hay để dùng ngoài 1.2 CÁC YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG CHUNG 1.2.1 Tính chất Cách thử: trải lượng bột vừa đủ, phân tán tờ giấy trắng mịn.Quan sát màu sắc mắt thường, ánh sáng tự nhiên Yêu cầu: Bột phải khô tơi, khơng bị ẩm, vón, màu sắc đồng nhất 1.2.2 Độ ẩm - Xác định độ ẩm thuốc bột theo phương pháp xác định mất khối lượng làm khô (Phụ lục 9.6 – DĐVN IV ) sấy tủ sấy ở áp suất thường, áp suất giảm, làm khô bình hút ẩm( có chất hút ẩm phosphor pentoxyd, silicagel v.v … ) 78 + Dụng cụ để chứa mẫu sấy thường là chén sấy có nút mài dành riêng cho kiểm nghiệm thuốc - Hoặc Phương pháp định lượng nước thuốc thử Karl fisher (Phụ lục 10.3 – DĐVN IV ), tuỳ theo dẫn chuyên luận riêng mà tiến hành thực + Dụng cụ xác định hàm lượng nước phương pháp Karl fisher dùng máy Karl fisher để phân tích Lưu ý : Thuốc bột hàm lượng nước không quá 9,0%, trừ các dẫn khác 1.2.3 Độ mịn: Nếu dẫn khác, độ mịn th́c bột xác định qua phép thử cỡ bột rây (phụ lục 3.5) + Cách tiến hành: chọn cỡ rây theo dẫn chuyên luận riêng (nếu chuyên luận riêng không quy định , cân lượng mẫu thử theo cỡ bột quy định sẳn Cho vào rây thích hợp, lắc rây theo chiều ngang quay trịn nhất 20 phút (ít nhất 30 phút) tùy thuộc cỡ bột và rây tới xong Khi rây, tránh kéo dài thời gian làm tăng độ mịn bột Cân sớ lượng cịn lại ở rây và số thu hộp hứng - Các cỡ bột quy định dựa vào các số rây - Trừ có dẫn khác, quy định dùng rây để xác định cỡ bột khơng có 97% khới lượng th́c bột qua cỡ rây - Khi quy định dùng hai rây để xác định cỡ bột để rây lên rây và tiến hành rây; khơng có 95% khới lượng th́c bột qua rây có sớ rây cao và không quá 40% khối lượng thuốc bột qua rây có sớ rây thấp Người ta dùng ký hiệu sau để quy định cỡ bột: + Đối với bột thô (1400/ 355) là bột mà khơng 95% phần tử qua rây số 1400 và không quá 40% qua rây số 355 + Đối với bột nửa thô (710/ 250) là bột mà khơng 95% phần tử qua rây số 710 và không quá 40% qua rây số 250 + Đối với bột nửa mịn (355/ 180) là bột mà khơng 95% phần tử qua rây số 355 và không quá 40% qua rây số 180 79 + Đối với bột mịn (180/ 125) là bột mà khơng 95% phần tử qua rây số 180 và không quá 40% qua rây số 125 + Đối với bột rất mịn (125/ 90) là bột mà khơng 95% phần tử qua rây số 125 và không quá 40% qua rây số 90 Bảng quy định cỡ rây để xác định độ mịn thuốc bột Cỡ bột Dùng rây Dùng rây + Đối với bột thô 1400 1400/ 355 + Đối với bột nửa thô 710 710/ 250 + Đối với bột nửa mịn 355 355/ 180 + Đối với bột mịn 180 180/ 125 + Đối với bột rất mịn 125 125/ 90 Quy định lượng mẫu thử dựa vào cỡ bột: - Đới với bột thơ hoặc nửa thơ lấy 25 g tới 100 g bột để thử Cho vào rây thích hợp, lắc rây theo chiều ngang quay trịn nhất 20 phút và rây tới xong Cân sớ lượng cịn lại ở rây và sớ thu hộp hứng - Đối với bột nửa mịn, mịn hay rất mịn tiến hành bột thơ, mẫu bột lấy để thử không quá 25 g và lắc rây nhất 30 phút rây tới xong Trường hợp phải rây chất có dầu hay bột khác có xu hướng bít mắt rây quá trình rây thỉnh thoảng chải cẩn thận mắt rây, tách rời đống tụ lại rây Bảng 3.5 Cỡ rây (kim loại) Số rây* Cỡ mắt rây Đường kính sợi dây (mm) (mm) 2000 2,000 0,900 1400 1,400 0,710 710 0,710 0,450 500 0,500 0,315 80 355 0,355 0,224 250 0,250 0,160 180 0,180 0,125 150 0,150 0,100 125 0,125 0,090 90 0,090 0,063 75 0,075 0,050 45 0,045 0,032 * Sớ rây biểu thị kích thước đo m mắt rây Những quy định mắt rây sợi kim loại chủ yếu lựa chọn từ tiêu chuẩn ISO 565 - 1975 Ghi chú: Đới với dược liệu có cần dùng các cỡ rây to so với bảng cỡ rây trên, trường hợp này cần nêu rõ kích thước cỡ mắt rây - Thuốc bột phải đạt độ mịn quy định chuyên luận Ví dụ: Kiểm tra độ mịn thuốc bột uống Acetylcysteine 200mg Dùng rây 1400/355 Tiến hành thử: Đặt rây số 1400 lên rây số 355 Cân lượng 30.576 gam bột thuốc Acetylcysteine 200mg dàn lên rây số 1400, tiến hành rây, rây nhất 20 phút, cân lượng bột cịn lại rây 1400 là 0,117 gam bột th́c, lượng bột qua rây (dưới rây) 355 6.477 gam - Vậy lượng bột thuốc qua rây 1400 : (30,576 -0,117)/30,576 = 99,62 (%) > 95,0(%) - Vậy lượng bột thuốc qua rây 355 là : 6.477/30,576 = 21.16 (%)≤ 40(%) Vậy bột thuốc Acetylcysteine 200mg đạt tiêu độ mịn 1.2.4 Độ đồng hàm lượng (phụ lục 11.2) - Trừ có dẫn khác, phép thử này áp dụng cho thuốc bột để uống, để tiêm trình bày các đơn vị đóng gói liều, có các dược chất có 81 Phải ghi tên vi sinh vật, ngày tháng thử nghiệm lên tất cả các hộp Petri, ống nghiệm môi trường nuôi cấy Tất cả các chất thải rắn môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần hấp khử trùng trước thải Dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch chất tiệt khuẩn (nước Javel) trước rửa và tái sử dụng 1.2 Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ thủy tinh: ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình cầu đáy và trịn, bình tam giác, các loại ống đong, ống hút Que cấy: que cấy vịng, que cấy móc Màng lọc vơ trùng: kích thước lỗ lọc 0,2µm nhỏ đường kính vi kh̉n Thiết bị: nhiệt kế, máy đo pH, tủ sấy, tủ ấm, máy lắc, bể điều nhiệt, tủ lạnh, đèn tử ngoại (UV), nồi hấp, kính hiển vi, bình ủ kị khí, Tủ cấy vơ trùng: khơng khí tủ cấy vô trùng cung cấp qua hệ thống lọc khơng khí Đèn tử ngoại có tác dụng khử trùng bề mặt bàn thao tác tủ cấy và bề mặt các dụng cụ thiết bị khác Trước sử dụng tủ cấy vô trùng cần bật đèn tử ngoại trước 30 phút Khi bắt đầu thao tác, tắt đèn tử ngoại và bật hệ thớng lọc khơng khí 1.3 Kỹ thuật phân tích kiểm nghiệm vi sinh vật 1.3.1 Phương pháp pha chế môi trường Môi trường ni cấy vi sinh vật thơng thường có chứa đầy đủ các thành phần nguồn carbon, đạm, chất khoáng, các ́u tớ sinh trưởng ngoài cịn chứa lượng nước cần thiết (khoảng 70-85%) có pH xác định thích hợp cho sự phát triển vi sinh vật Trong sớ trường hợp có thể thêm các chất kháng sinh, các chất ức chế sinh trưởng số vi sinh vật theo yêu cầu mục tiêu thử nghiệm, 129 Môi trường nuôi cấy thường phân loại dựa vào tính chất vật lý mơi trường và chia thành dạng: lỏng (liquid media), rắn (solid media), và bán rắn (semisolid media) Hiện nay, nhiều hãng sản xuất môi trường chuyên nghiệp sản xuất các dạng môi trường đông khô Các môi trường điều chế từ các hóa chất tổng hợp tinh khiết với hàm lượng xác định Trong thử nghiệm vi sinh, chất lượng mơi trường đóng vai trị quan trọng, vậy việc pha chế mơi trường cần thực xác, cẩn thận Cách pha chế sau: + Để chuẩn bị môi trường cần phải cân đong xác cân phân tích các thành vi lượng + Với môi trường lỏng: cân các thành phần, hịa tan vào nước + Với mơi trường rắn: bổ sung thêm chất làm rắn thạch, đồng thời phải gia nhiệt để làm tan môi trường + Yêu cầu môi trường phải để dễ quan sát, trường hợp cần thiết phải lọc qua giấy lọc, gạc hoặc than hoạt Tùy theo đối tượng yêu cầu thử nghiệm, môi trường điều chỉnh đến pH quy định HCl 1N hoặc NaOH 1N Môi trường khử trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp phụ thuộc vào thành phần môi trường Với các môi trường bình thường, thường khử trùng ở 1210C 15-20 phút Môi trường đông khô: pha chế đơn giản cách phối hợp lượng cần thiết môi trường khô vào nước, điều chỉnh pH, đóng ớng và khử trùng Trong nhiều trường hợp không cần điều chỉnh pH Các ống nghiệm đựng môi trường phải sạch và bụi Trường hợp đặc biệt phải rửa ống nghiệm bên nước ấm và xà phịng có thể sử dụng chổi cọ ống nghiệm Xả lại lần nước, lần đầu nước máy, lần sau nước cất để loại trừ xà phịng cịn sót lại Úp ngược ống nghiệm giá để tự khô, ý không lau khăn Khi phân môi trường dụng cụ chứa cần ý dùng phần dụng cụ chứa Thơng thường với các bình chứa bình cầu, bình tam giác đổ 1/3 130 đến ½ dung tích, đóng 5ml mơi trường lỏng vào ớng nghiệm, – 7ml đối với ống thạch nghiêng 1.3.2 Các kỹ thuật khử trùng dụng cụ mơi trường Có nhiều phương pháp khử trùng vi sinh vật: tác nhân lý hóa nhiệt độ, bức xạ, lọc, tác nhân khử trùng chọn tùy mục đích và vật liệu khử trùng a) Tiệt trùng nhiệt Nhiệt độ cao có thể diệt vi sinh vật tác dụng làm enzym vi sinh vật bị biến tính, làm mất nước và oxy hóa tế bào Tiệt trùng nhiệt khô Tiệt trùng nhiệt khô thực tủ sấy có gắn thiết bị đới lưu khơng khí để đảm bảo sự phân phới nhiệt đồng toàn khoang tiệt trùng Điều kiện chuẩn phương pháp tiệt trùng nhiệt khô là sấy ở nhiệt độ tới thiểu 160 oC nhất Trong quá trình tiệt trùng phải tiến hành theo dõi nhiệt độ bên tủ sấy Nhiệt độ thường đo các đầu dò nhiệt đặt ở phần nguội nhất tủ sấy Phải ghi chép và lưu trữ thông số nhiệt độ chu trình tiệt trùng Dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường khử trùng phương pháp sấy 1800C trong tủ sấy Dụng cụ thủy tinh cần gói kín giấy hoặc giấy nhơm Tiệt trùng nhiệt ẩm Phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm tiến hành thiết bị chuyên dùng gọi là nồi hấp, tác nhân tiệt trùng là nước bão hòa áp suất cao Đây là phương pháp ưu tiên chọn lựa, có thể, nhất là đới với các dung dịch nước Điều kiện chuẩn phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm là đun nóng ở 121 C nhất 15 phút để diệt tế bào sinh dưỡng hoặc hấp nước ở 1atm, o 121 0C 15 – 30 phút để tiệt trùng hoàn toàn Trong quá trình tiệt trùng, phải theo dõi và ghi chép lại nhiệt độ và áp suất bên nồi hấp Nhiệt độ thường theo dõi các đầu dò nhiệt đặt ở phần nguội nhất nồi hấp Thông số vận hành chu trình tiệt trùng ghi lại dạng biểu đồ nhiệt độ - thời gian, hay cách thích hợp khác b) Tiệt trùng phương pháp lọc 131 Phương pháp lọc thường dùng để tiệt trùng các dung dịch bền nhiệt, không thể tiệt trùng bao bì ći Ngun tắc phương pháp là dẫn dung dịch cần tiệt trùng qua vật liệu lọc có khả giữ vi khuẩn Vật liệu lọc thường dùng là các màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm hay nhỏ hơn, có khả giữ lại 100% vi kh̉n Pseudomonas diminuta Cần có biện pháp thích hợp để tránh sự hấp thu hoạt chất màng lọc, để tránh sự tạp chất từ màng lọc vào dịch lọc Trước lọc phải kiểm tra để đảm bảo màng lọc không bị rách quá trình lắp ráp và tiệt trùng hệ thớng lọc, sau lọc xong phải kiểm tra tính toàn vẹn màng lọc phương pháp thích hợp c) Tiệt trùng bức xạ Phương pháp này tiến hành cách cho sản phẩm bao bì ći tiếp xúc với bức xạ ion hóa Hai nguồn bức xạ ion hóa thường dùng là : tia  phát từ nguồn phóng xạ thích hợp (ví dụ đồng vị phóng xạ Cobalt 60), và chùm electron lượng cao gia tốc bởi máy gia tốc electron Ngoài cịn có tia tử ngoại dùng để khử trùng các buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật; trường hợp này ý đèn tử ngoại phải trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm, cơng śt và sớ lượng đèn phù hợp với diện tích buồng cấy đèn tử ngoại có tác dụng với nấm, ḿn khử trùng buồng pha chế cần phới hợp thêm hóa chất để diệt nấm d) Tiệt trùng hóa chất Nhiều hóa chất có thể kiểm soát sự tăng trưởng vi sinh vật Ethylen oxyd, triethylen glycol,… sử dụng để khử trùng, ức chế sự phát triển vi sinh vật Sử dụng dung dịch Cloramin B, Cloramin T 2% hoặc dung dịch phenol 0,5% để xử lý buồng vơ kh̉n Tiệt kh̉n khơng khí dung dịch formaldehyd (500ml cho lít nước) 1.3.3 Các kỹ thuật thao tác vô trùng Trong kiểm nghiệm vi sinh vật, các chủng vi sinh vật cần cấy vào nhiều môi trường khác để tăng sinh, khảo sát đặc tính sinh trưởng vi sinh vật, các thử nghiệm sinh hóa,… Việc cấy chủng cần ý thực để không đưa các vi sinh vật khác vào hay vi sinh vật nhiễm vào môi trường, vậy các thao tác cần hết sức cẩn thận để loại trừ các vi sinh vật gây nhiễm Để đảm bảo trạng thái 132 vô trùng trước sử dụng, môi trường và các dụng cụ cần khử trùng thích hợp Các thao tác vơ trùng thực không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn, hoặc tủ cấy vô trùng Ngoài người tiến hành thử nghiệm cần mang găng tay hoặc sát trùng tay với cồn 700 hoặc dung dịch tuyệt khuẩn, đồng thời sát trùng mặt bàn thao tác Sau thực xong công việc cấy chủng lại tiến hành sát trùng tay, mặt bàn tương tự Khử trùng que cấy: đớt nóng đỏ đầu que cấy ngọn lửa và đốt nhẹ phần cán Cầm thẳng đứng que cấy lên cho nóng đều, mở nút và đưa que cấy khử trùng vào dụng cụ chứa giống áp đầu que cấy vào đầu ớng nghiệm, bình chứa hoặc đặt nhẹ lên phần môi trường không chứa vi sinh vật để làm nguội que cấy trước cấy vi sinh vật Chuẩn bị ớng thạch nghiêng và đổ đĩa: + Ớng thạch nghiêng: Ngay sau khử trùng, đặt đầu các ống nghiệm đựng môi trường rắn cao để tạo độ nghiêng cho chiều dài môi trường ống không quá 2/3 chiều cao ống, thạch không chạm vào nút Để nguội + Đổ đĩa: Đổ ở nhiệt độ 45 – 550C, vừa hạn chế sự ngưng tụ nước nắp đĩa petri, vừa tạo bề mặt môi trường phẳng đổ đĩa tủ cấy vô trùng, bề dày môi trường đĩa là – mm THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mớc có khả sớng lại và phát các vi khuẩn điểm y tế có th́c Thí nghiệm tiến hành điều kiện vơ kh̉n Trong làm thí nghiệm, ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử Thử nghiệm áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm các thuốc không tiệt kh̉n quá trình sản x́t 2.1 Mục đích 133 Thử độ nhiễm khuẩn nhằm mụch đích xác định giới hạn tới đa sớ vi kh̉n hiếu khí, vi nấm, mớc có 1g hoặc 1ml chế phẩm Đồng thời phát các vi khuẩn điểm vệ sinh quy định khơng có th́c là Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridia 2.2 Nguyên tắc Đếm sớ vi kh̉n hiếu khí, nấm mớc, nấm men có dược phẩm thể các khuẩn lạc đặc trưng đĩa thạch dinh dưỡng thích hợp Căn cứ vào các đặc tính hình thái sinh lý, sinh hóa loại vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh Trên sở kết quả thí nghiệm đánh giá chất lượng thuốc theo tiêu chuẩn DĐVN hoặc tiêu chuẩn sở 2.3 Phương pháp thử xách định giới hạn tối đa vi sinh vật 2.3.1 Chuẩn bị mơi trường Mơi trường ni cấy có thể pha theo cách hoặc có thể dùng mơi trường khô các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp Các môi trường tự pha chế phải hấp tiệt khuẩn nồi hấp ở nhiệt độ 115oC 30 phút trừ có dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt Thạch dùng cho pha chế mơi trường có độ ẩm 15% Nước và các chất dùng các công thức phải tinh khiết a) Môi trường xác định giới hạn vi khuẩn Môi trường thạch casein đậu tương Pepton casein 15,0 g Natri clorid 5,0 g Thạch 15,0 g Pepton đậu tương 5,0 g Nước 1000 ml pH sau tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2 Môi trường thạch thường 134 Thạch 18,0 g Pepton 10,0 g Cao thịt 5,0 g Natri clorid 5,0 g Nước 1000 ml Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng phút để tan hoàn toàn, pH sau tiệt khuẩn : 7,4 + 0,2 b) Môi trường xác định giới hạn vi nấm Môi trường thạch Sabouraud Glucose 20,0 g Pepton 10,0 g Thạch 20,0 g Nước 1000 ml Hoà tan, đun sôi cho tan hoàn toàn pH sau tiệt khuẩn : 5,6 + 0,2 Thêm 50mg cloramphenicol lít mơi trường trước tiệt trùng hoặc dùng benzyl penicillin, hoặc tetracyclin cho vào môi trường sau tiệt trùng 2.3.2 Chuẩn bị mẫu thử Mẫu thử theo qui định chung lấy 10g hoặc 10ml để thí nghiệm 2.3.3 Đếm số lượng vi sinh vật Hịa lỗng chế phẩm cho cấy ml dịch chế phẩm vào môi trường hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 kh̉n lạc Lấy dung dịch có độ pha lỗng ći cho vào hộp Petri, hộp 1ml Thêm vào hộp 15 - 20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đun 135 chảy và để nguội đến 45oC Đậy hộp, trộn cách xoay qua, xoay lại Sau để n cho thạch đơng cứng ở nhiệt độ phịng Lật ngược hộp, mang ủ ở 35 oC từ 24 - 48 h Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc Lấy giá trị đĩa có sớ lượng kh̉n lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc đĩa không lớn 300 và tính sớ lượng kh̉n lạc 1g hoặc 1ml chế phẩm Nếu thấy khơng có kh̉n lạc mọc ở đĩa có độ pha lỗng 1/10 kết ḷn chế phẩm có 10 kh̉n lạc g hoặc ml 2.4 Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn Nếu khơng có dẫn chun ḷn riêng giới hạn nhiễm kh̉n cho các loại th́c có quá trình sản x́t khơng tiệt kh̉n sau: Bảng Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn Mức Loại chế phẩm Yêu cầu Các chế phẩm dùng cho bỏng và các vết loét sâu Các chế phẩm dùng tại chỗ chữa xưng tấy, tổn thương, và các màng nhầy (mũi, họng, tai, âm đạo ) Khơng có các vi kh̉n có thể sớng lại 1g (ml) mẫu thử Các chế phẩm dùng tại chỗ cho da kem bôi, nước thơm, dầu, dung dịch, bột Tổng sớ vi kh̉n hiếu khí sớng lại khơng 500 g (ml) Mẫu thử phải Enterobacteria, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm và mớc g (ml) Các chế phẩm dùng Tổng số vi kh̉n hiếu khí sớng lại khơng ́ng; qua trực tràng; 104 g (ml) thấm qua da Tống số Enterobacteria không 500 g (ml) Nấm và mốc không quá 100 trong1 g (ml) Tổng sớ vi kh̉n hiếu khí sớng lại đuợc không 100 1g (ml) Mẫu thử phải Enterobacteria, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm và mớc g (ml) 136 Khơng có Salmonella 10 g(ml) Mẫu khơng có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 1g(ml) Các chế phẩm có chứa các nguyên liệu có nguồn gớc thực vật, động vật khơng thể xử lí theo qui trình làm giảm lượng vi kh̉n Tổng sớ vi kh̉n hiếu khí sớng lại 5.104 g (ml) Nấm và mốc không quá 500 g (ml) Tống số Enterobacteria không 500 trong1 g (ml) Khơng có Salmonella 10 g(ml) Mẫu khơng có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 1g(ml) THỬ VƠ KHUẨN 3.1 Mục đích Kỹ tḥt này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát sự có mặt vi kh̉n, nấm mớc và nấm men các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô khuẩn 3.2 Nguyên tắc Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men cấy vào mơi trường có chất dinh dưỡng và nước, giữ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp chúng phát triển Sự có mặt vi sinh vật làm cho môi trường biến đổi trạng thái từ sang đục, hoặc có cặn lắng ở đáy mơi trường, hoặc thay đổi màu sắc môi trường 3.3 Môi trường Trong nhiều dược điển, để phát vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí thường dùng mơi trường thioglycolat lỏng và để phát vi khuẩn vi nấm dùng môi trường casein đậu tương lỏng Môi trường thioglycolat: Dùng cho thử nghiệm chế phẩm lỏng và 137 Agar 0,75 g Natri clorid 2,50 g Glucose 5,50 g L-Cystine 0,75 g Cao men bia (có khả tan nước) 5,00 g Casein pancreatic 15,00 g Natri thioglycolat (hoặc acid thioglycolic 0,3 g ) 0,50 g Resazurin (dung dịch 0,1% pha) 1,0 ml Nước cất 1000 ml pH sau tiệt khuẩn: 7,1  0,2 Hấp vô khuẩn ở 1210C 18 - 20 phút Lấy làm nguội nhanh tới 250C Môi trường canh thang casein đậu tương lỏng Pepton casein 17,0 g Pepton đậu tương 3,0 g Natri clorid 5,0 g Dikalihydrophosphat (K2HPO4) 2,5 g Glucose 2,5 g Nước cất 1000 ml pH sau tiệt khuẩn: 7,1 – 7,3 Hoà tan tất cả các chất rắn nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn Để nguội ở nhiệt độ phòng Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh (nếu cần) cho pH sau tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5 Lọc (nếu cần) để cho môi trường Phân chia vào dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 1210C khoảng 20 phút 3.4 Phương pháp thử 3.4.1 Lượng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm Tuỳ theo loại mẫu thử, lấy lượng chế phẩm thích hợp theo qui định ở bảng Bảng STT Loại mẫu thử Lượng tới thiểu Thể chế phẩm cần lấy tích tối thiểu môi 138 Ghi trường cần lấy Mẫu thử là chất lỏng chứa Nếu mẫu thử là dầu đơn vị đóng gói hay dung dịch dầu loại: phải thêm vào môi Dưới ml Toàn đơn vị đóng gói 15 ml trường Từ ml đến ml 1/2 đơn vị đóng gói 15 ml polyethoxy- Từ ml đến 20 ml ml 20 ml ethanol Từ 20 ml đến 50 ml ml 40 ml polysorbat để nhũ 10 ml 80 ml hoá Từ 50 ml đến 100 ml 1% hoặc 1% Mẫu thử là chất rắn, thuốc Nếu mẫu thử là mỡ hay kem, chứa th́c mỡ hay kem đơn vị đóng gói loại: cần hoà lỗng Dưới 50 mg Toàn đơn vị đóng gói 40 ml với dung môi B Từ 50 mg đến 200 mg 1/2 khối lượng 80 ml theo tỷ lệ 1/10 đơn vị đóng gói 80 ml (kt/tt) trước cấy Lớn 200 mg 100 mg vào môi trường 3.4.2 Kỹ thuật thử Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trường theo số liệu ở bảng Nếu mẫu thử là chất rắn cấy trực tiếp vào môi trường và ý lắc để mẫu thử phân tán môi trường Nếu dẫn ở chun ḷn riêng ủ mơi trường phát vi khuẩn ở 300C - 350C ; ủ môi trường phát nấm mốc ở 200C - 250C, thời gian nhất 14 ngày; thường xuyên theo dõi các môi trường cấy Nếu chế phẩm làm đục mơi trường, để có thể dễ dàng quan sát sự mọc vi khuẩn, sau ủ môi trường - ngày nên chuyển phần nhỏ môi trường này sang loạt môi trường loại Tiếp tục ủ các ống môi trường cấy lại nhất ngày Trường hợp mẫu thử là băng, gạc, khâu phẫu tḥt: Nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn mẫu thử vào 100 ml môi trường tương ứng Khi mẫu thử là dụng cụ (dây truyền, ớng lọc máu, ) dùng dung môi A hoặc B (mục chuẩn bị môi trường và dung mơi) cho chảy qua để thu nhất 15 ml dịch rửa, 139 cấy vào nhất 100 ml loại môi trường nuôi cấy Ủ và đọc kết quả ghi ở 3.4.3 Nhận định kết Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi trường cấy màng lọc hoặc mẫu thử Nếu khơng thấy có vi kh̉n, nấm mốc mọc suốt thời gian qui định, mẫu thử coi là đạt tiêu ch̉n vơ kh̉n Nếu có từ trở lên số các môi trường nuôi cấy, có vi kh̉n hoặc nấm mớc mọc, cần phải: - Rà soát lại qui trình thử - Thử lại các mẫu thử nghi ngờ - Giữ lại các môi trường có vi kh̉n, nấm mớc mọc - Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm môi trường, cấy lại với vi khuẩn hoặc nấm mọc ở môi trường cũ + Nếu tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làm lần đầu, mẫu thử coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn + Nếu tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí nghiệm đầu tiên, cần thực phép thử lặp lại với số lượng mẫu gấp đôi Nếu không phát thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Nếu thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lần lặp lại này, mẫu thử coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn PHEP THỬ CHẤT GÂY SỐT Trong kiểm nghiệm thuốc tiêm hoặc dung dịch tiêm truyền phải đánh giá tiêu này Hiện có phương pháp thử - Phương pháp in vitro: sử dụng LAL (Limulus Amebocyte Lysat), thuốc thử này gặp chất gây sốt tạo tủa gel có thể phát mắt thường - Phương pháp sinh học: Dùng để đánh giá chất lượng mẫu thử dựa sự tăng thân nhiệt thỏ sau tiêm vào tĩnh mạch thỏ dung dịch mẫu thử Đây là phương pháp thử chất gây sốt dược quy định Dược điển Việt Nam 4.1 Động vật thí nghiệm 4.1.1 Lựa chọn động vật thí nghiệm 140 Dùng thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, cả giống, cân nặng không 1,5kg, nuôi dưỡng thức ăn khơng có chứa kháng sinh và thỏ khơng có dấu hiệu giảm cân quá trình thử nghiệm Không dùng để thử nghiệm nếu: (a) Thỏ dùng thử chất gây sớt có kết quả âm tính vịng ngày trước đó, hoặc (b) Thỏ dùng thử chất gây sớt có kết quả dương tính vịng t̀n 4.1.2 Khu vực lưu giữ động vật Thỏ nuôi giữ riêng khu vực yên tĩnh, có nhiệt độ ổn định Cho thỏ nhịn ăn từ đêm trước thử, khơng cho ́ng nước quá trình thử Tiến hành phép thử phịng n tĩnh, khơng có tiềng ồn, nhiệt độ phịng chênh lệch khơng quá 3oC so với khu vực nuôi giữ, hoặc thỏ phải lưu giữ ở điều kiện phịng thí nghiệm khoảng nhất 18 trước thử nghiệm 4.2 Thiết bị dụng cụ 4.2.1 Dụng cụ, bơm kim tiêm: Tất cả các dụng cụ, bơm và kim tiêm phải rửa sạch và tráng nước cất, sấy ở nhiệt độ 250oC 30 phút hoặc 200oC 4.2.2 Hộp/ giá giữ thỏ: Các hộp/ giá giữ thỏ cho trường hợp đo nhiệt độ thiết bị điện thiết kế để giữ ở cổ vật không chật quá, phần thể lại thoải mái để thỏ có thể ngồi ở tư thế bình thường Khơng giữ thỏ các loại kẹp hoặc giá có thể gây đau hoặc khó chịu cho vật Thỏ phải cho vào hộp hoặc giá nhất trước thử và giữ ở śt quá trình thử nghiệm 4.2.3 Nhiệt kế: Nhiệt kế hoặc thiết bị điện dùng để ghi nhiệt độ có độ xác 0,1oC đưa vào trực tràng thỏ với độ sâu 5cm Độ sâu nhiệt kế trực tràng phải giống các thỏ Nếu dùng thiết bị điện, đầu đo nhiệt độ phải đặt trực tràng śt quá trình thử 4.3 Tiến hành 4.3.1 Thử nghiệm sơ 141 Chỉ nên tiến hành thử sơ với thỏ lần đầu tiên dùng thử chất gây sớt Trong vịng đến ngày trước kiểm tra mẫu thử, tiêm tĩnh mạch tai 10ml/ kg thỏ dung dịch natri clorid 0,9% khơng có chất gây sớt, làm ấm đến khoảng 38o5 trước tiêm Ghi nhiệt độ thỏ, bắt đầu nhất 90 phút trước tiêm và tiếp tục sau tiêm Không dùng thỏ có nhiệt độ thay đổi quá 0,6oC vào thử nghiệm thức 4.3.2 Thử nghiệm thức Mỗi mẫu thử nhóm thỏ Chuẩn bị tiêm mẫu thử: Mẫu thử có thể hịa tan dung mơi khơng có chất gây sớt, dung dịch natri clorid 0,9% hoặc chất lỏng qui định chuyên luận riêng Làm ấm dung dịch thử lên khoảng 38o5 trước tiêm Tiêm chậm dung dịch thử vào tĩnh mạch tai thỏ khoảng thời gian khơng quá phút, trừ có dẫn khác chuyên luận riêng Lượng mẫu thử tiêm thay đổi tùy theo chế phẩm cần kiểm tra và qui định chuyên luận riêng Thể tích tiêm khoảng 0,5 – 10ml/ kg thể trọng thỏ Theo dõi nhiệt độ xác định đáp ứng Ghi nhiệt độ thỏ 30 phút lần, nhất 90 phút trước tiêm và tiếp tục sau tiêm Theo dõi nhiệt độ trước tiêm, không dùng vào thử nghiệm nếu: - Thỏ có chênh lệch nhiệt độ ≥ 0,2oC lần ghi liên tiếp, hoặc - Thỏ có nhiệt độ ban đầu cao 39o8 hoặc thấp 38oC, hoặc - Nhiệt độ thỏ nhóm khác quá 1oC “Nhiệt độ ban đầu” thỏ là trung bình giá trị nhiệt độ ghi cách 30 phút, xác định khoảng 40 phút trước tiêm dung dịch thử “Nhiệt độ tối đa” thỏ là nhiệt độ cao nhất ghi cho thỏ vịng sau tiêm Chênh lệch “nhiệt độ ban đầu” và “nhiệt độ cao nhất” gọi là đáp ứng Khi chênh lệch là âm, kết quả coi là đáp ứng Đánh giá kết quả: 142 Đầu tiên thử nhóm thỏ, tùy thuộc vào kết quả thu được, thử thêm lần lượt nhóm thỏ khác cho đến tổng cộng nhóm, nếu cần Nếu tổng đáp ứng nhóm đầu tiên khơng vượt quá sớ ghi cột bảng đây, mẫu thử đạt yêu cầu Nếu tổng đáp ứng vượt quá số ghi cột không vượt quá số ghi cột lặp lại phép thử nhóm khác nêu ở Nếu tổng các đáp ứng lớn sớ ghi cột mẫu thử không đạt yêu cầu Mẫu thử đạt nếu tổng đáp Mẫu thử không đạt nếu ứng không vượt quá tổng đáp ứng vượt quá 1,15 2,65 2,80 4,30 4,45 5,95 12 6,60 6,60 Số thỏ Những thỏ có nhiệt độ tăng cao quá 1,2oC loại và không dùng lại cho phép thử chất gây sốt 143