Đồ án tốt nghiệp GVHD CN Bùi Văn Thế Vinh Đồ án tốt nghiệp GVHD CN Bùi Văn Thế Vinh SVTH Trần Thị Thu Hiền 1 Chương 1 Mở đầu 1 1 Đặt vấn đề Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc[.]
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Hoa mười (Portulaca grandiflora) thân thảo thuộc họ rau sam, loài thân thảo phổ biến dễ trồng nhờ tính đa dạng màu sắc sặc sỡ mà loài giúp tôn lên vẻ đẹp khu vườn hay khuôn viên, đặc biệt lúc hoa nở rộ Nuôi cấy in vitro hoa mười để khảo sát điều kiện sinh sống hoa mười ống nghiệm khác so với điều kiện bên ngoài, bên ngồi mơi trường tự nhiên hoa mười dễ trồng thời gian phát triển nhanh tiến hành nuôi cấy in vitro nhiều thời gian mục đích khảo sát tập tính điều kiện sống hoa mười Đây lồi thân có nhiều lơng nhỏ gây khó khăn việc tạo nguồn mẫu vơ trùng Đó bước nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười hoa ống nghiệm loại hình nhiều người ưa thích nhìn đẹp, kinh doanh được, khơng phải chăm sóc hoa tự nhiên mà tươi tốt Hoa mười đồng hồ sinh học khoảng – 10 sáng hoa nở rộ, nghiên cứu để khảo sát vấn đề xem hoa mười lại có tập tính này, hoa quỳnh nở vào lúc 12 đêm, điều đặc biệt lồi nuôi cấy ống nghiệm với điều kiện khơng có oxy phát triển tốt để hoa nở ngày điều không dễ chút phá vỡ quy luật tự nhiên cây, – 10 cho hoa nở Đây vấn đề cần phải nghiên cứu lâu nhiều thời gian Là loài phổ biến dễ trồng nên có giá trị kinh tế khơng cao chưa tiến hành nuôi cấy in vitro Đây bước đầu khai thác giá trị kinh tế loài này, phổ biến loại thuốc nam công dụng với số thuốc khác họ lồi rau sam tốt cho sức khỏe SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu khả ni cấy mơ hoa mười nhằm tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực nghiên cứu hoa ống nghiệm 1.2.2 Yêu cầu Phải đưa mẫu vào để tạo mẫu vô trùng, khảo sát mẫu ban đầu môi trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Chương 2: Tổng quan 2.1 Khái quát kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô tế bào thực vật thuật ngữ mô tả phương pháp nuôi cấy quan thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp muối khống, vitamin, đường chất điều hịa sinh trưởng thực vật điều kiện vơ trùng (Dương Công Kiên, 2002) Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi quan từ mô lá, thân, hoa, rễ, củ đỉnh sinh trưởng Trước người ta dùng phương pháp để nghiên cứu đặc tính tế bào phân chia, đặc tính di truyền ảnh hưởng hóa chất tế bào mơ q trình nuôi cấy Những năm 70 kỷ XX thập niên bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt kỹ thuật nuôi cấy mơ tế bào thực vật Nó cơng cụ nghiên cứu nhiều nhà khoa học Điều quan trọng vi nhân giống việc nghiên cứu vai trò tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhằm kích thích hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ cho công tác nhân giống Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống làm cách mạng lớn nhân giống thực vật người ta hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật để sản xuất giống thương mại Vi nhân giống trở thành phương pháp nhân giống chuẩn phổ biến nhiều loại trồng như: công nghiệp, lâm nghiệp, cảnh, dược liệu, ăn trái rau xanh Phương pháp có ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Có khả tái sinh từ vùng mô quan khác (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà ngồi tự nhiên khơng thể thực Có thể sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn, diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại Cây tạo đồng mặt di truyền Tạo virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Sản xuất quanh năm chủ động kiểm soát yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… Bảo quản nguồn giống in vitro với số lượng lớn lại chiếm diện tích nhỏ Tạo có khả hoa, tạo sớm Tạo dịng tồn (cây chà là) toàn đực (cây măng tây) theo mong muốn Dễ dàng tạo giống trồng phương pháp chuyển gen Bên cạnh ưu điểm bật thuận lợi cho mục đích nhân giống đề cập phương pháp vi nhân giống có nhược điểm cần phải khắc phục: Giá thành sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống cịn cao Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan cần khoảng thời gian dài trước thích ứng trồng ngồi vườn ươm Sự đa dạng dịng sản phẩm nhân giống hạn chế, nghĩa tạo thường đồng mặt kiểu hình Có thể xảy đột biến tác dụng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống vào sản xuất thương mại giá thành sản phẩm tạo cao Theo Kozai cộng (1992), nguyên nhân vấn đề thất thoát nhiễm khuẩn nấm q trình ni cấy, tỷ lệ sống sót thấp SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh giai đoạn chuyển vườn ươm, giá nhân công lao động chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết q trình cấy chuyền mẫu cấy sang mơi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình ni cấy,…) ngun liệu (đường, agar,…) cao Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng phát triển thực vật, có cịn làm tăng tính bất thường di truyền tế bào Tuy nhiên, hạn chế nghiêm trọng kỹ thuật vi nhân giống tỷ lệ sống sót sau chuyển vườn ươm thường thấp khác biệt lớn điều kiện môi trường in vitro ex vitro 2.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh chồi bên Sau vô trùng, mẫu ni cấy mơi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khống vơ hữu mơi trường khống có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ đỉnh sinh trưởng, sau khoảng thời gian nuôi cấy định mẫu phát triển thành chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, rễ để trở thành hoàn chỉnh Cây chuyển đất thích nghi phát triển bình thường Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo khối tế bào phát triển vơ tổ chức, hình thành phản phân hóa tế bào phân hóa Mơ sẹo phát triển nhanh mơi trường có diện auxin Khối mơ sẹo có khả tái sinh thành hoàn chỉnh điều kiện mơi trường khơng có chất kích thích tạo mơ sẹo Nuôi cấy mô sẹo thực loại thực vật khơng có khả nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mơ sẹo có đặc tính giống mẹ Từ cụm tế bào mơ sẹo tái sinh lúc nhiều chồi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo nuôi cấy môi trường lỏng đặt máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp tách thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi tế bào đơn Tế bào đơn lọc nuôi cấy môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với chất thích hợp bổ sung vào mơi trường tế bào có khả sản xuất chất có hoạt tính sinh học Sau thời gian nuôi cấy kéo dài môi trường lỏng tế bào đơn tách trải môi trường thạch - Khi mơi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mơ sẹo - Khi mơi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả tái sinh thành hồn chỉnh Ni cấy protoplast – chuyển gen Protoplast (tế bào trần) tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, có sức sống trì đầy đủ chức sẵn có Trong điều kiện ni cấy thích hợp, protoplast có khả tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia tái sinh thành hồn chỉnh (tính tồn thực vật) Khi tế bào vách tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả dung hợp với tạo tế bào lai, đặc tính cho phép cải thiện giống trồng Quá trình dung hợp protoplast thực hai đối tượng lồi hay khác lồi Ni cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn thực vật nuôi cấy mơi trường thích hợp tạo thành mơ sẹo Mơ sẹo tái sinh thành hồn chỉnh đơn bội 2.1.3 Những vấn đề nhân giống vơ tính in vitro Tính bất định mặt di truyền Tính bất định mặt di truyền tác động số chất kích thích sinh trưởng Tần số biến dị thường khác không lặp lại Việc nuôi cấy mô sẹo SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh tế bào đơn thường tần số biến dị cao so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy phụ thuộc yếu tố: - Kiểu di truyền hay giống nuôi cấy - Loại mô cấy - Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, loại biến dị nhiễm sắc thể xuất cao thời gian ni cấy kéo dài Số lần cấy chuyền thời gian cấy chuyền hai lần ngắn làm giảm khả gây biến dị Sự nhiễm mẫu Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật Có thể giảm khả lại mẫu cách: - Sử dụng mẫu nuôi cấy mô phân sinh đỉnh - Sử dụng loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin, Vacomicin Penicillin với nồng độ phụ thuộc vào vật liệu ni cấy Sự hóa thủy tinh thể Hiện tượng thủy tinh thể dạng bệnh lý cây, bị nước chuyển từ mơi trường in vitro mơi trường ngồi Ngun nhân in vitro có lớp sáp bên ngồi biểu bì mỏng, tế bào chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước, cấu tạo khí khổng thường có hình trịn thay hình elip tự nhiên, khí khổng mở suốt q trình ni cấy mật độ khí khổng cao Ngồi nhu mơ thịt lớp mơ bảo vệ mặt ngồi phát triển, tế bào chất đậm đặc, diệp lục so với bình thường nên đưa mơi trường ngồi với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác, khơng thể thích nghi dẫn đến stress chết Có số phương pháp hạn chế q trình hóa thủy tinh thể sau: - Giảm hút nước in vitro cách tăng nồng độ đường môi trường cấy dùng chất có áp suất thẩm thấu cao Tuy nhiên, điều làm giảm tổng hợp diệp lục tố ức chế hình thành chồi SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp - GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Tránh gây thương tổn mẫu cấy khử trùng tiếp xúc với mơi trường cấy - Ở số lồi sử dụng chất ABA - Giảm nồng độ đạm môi trường cấy - Giảm C2H2 bình ni cấy cách thơng gió tốt, tăng cường ánh sáng giảm nhiệt độ phòng cấy 2.1.4 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng số lĩnh vực như: Lai tạo loài xa di truyền phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần) Nuôi cấy tế bào thực vật môi trường lỏng (nuôi cấy huyền phù tế bào) quy mô lớn để sản xuất hợp chất thứ cấp Chọn lọc tế bào có đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành thay chọn lọc ngồi đồng ruộng (ni cấy tế bào đơn) Sản xuất dịng đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn túi phấn) Vi nhân giống giống có giá trị khoa học thương mại Bảo quản phôi quan điều kiện nhiệt độ thấp Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử Nuôi cấy quang tự dưỡng 2.1.5 Sự khác nhân giống in vitro thân thảo thân gỗ Các lồi thân gỗ có khả tái sinh loài thân thảo Các nghiên cứu nhân giống thân gỗ bắt đầu trễ so với thân thảo Việc cảm ứng trẻ hóa thân gỗ khó thân thảo Tốc độ nhân giống thân gỗ thấp thân thảo SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Tác động trạng thái hưu miên tăng trưởng chồi kéo dài thân thân gỗ theo thời kì năm Cây thân gỗ dễ bị ảnh hưởng chất độc tiết môi trường ni cấy Mơ thân gỗ khó khử trùng đại đa số mọc ngồi thiên nhiên Cây thân gỗ bụi thường chọn lọc để nhân dòng sau trưởng thành Ở giai đoạn mô thường khó khơng thể sử dụng nhân giống in vitro Sự đa dạng mặt di truyền thân gỗ lớn so với nông nghiệp loại thân thảo khác, sau nhân giống thu nhiều kết khác khó kiểm sốt Cây thân gỗ khơng thể trồng nhà kính, việc thu mẫu bị ảnh hưởng nhiều điều kiện khí hậu điều kiện tăng trưởng khác 2.1.6 Sự khác nhân giống in vitro nhân giống in vivo Nhân giống vơ tính in vitro nhanh nhân giống vơ tính in vivo Có thể tạo số lồi thực vật mà khơng thể tiến hành in vivo nhân giống in vitro cảm ứng trẻ hóa mơ Sự tăng trưởng nhân giống vô tính in vitro thường mạnh nhân giống vơ tính in vivo trẻ hóa bệnh Việc nhân giống in vitro tạo bệnh có chọn lọc đối tượng bệnh để đưa vào ni cấy đồng thời xử lý mẫu cấy có mang mầm bệnh trước đưa vào môi trường nuôi cấy Các bệnh trao đổi dễ dàng nơi với có kích thước nhỏ không trồng đất Trong nuôi cấy in vitro sử dụng mẫu cấy ban đầu nhỏ chọn lọc kỹ lưỡng dễ dàng SVTH: Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống in vivo giảm chi phí lượng trường hợp loại cần nhân giống nhà kính Do in vitro ni cấy điều kiện hồn tồn thích hợp (nguồn dinh dưỡng điều kiện mơi trường) sản xuất quanh năm Có thể sử dụng nhân giống in vitro để làm mẹ cho bước nhân giống Có thể tạo đột biến điểm q trình ni cấy Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ngân hàng gen Các tế bào trần huyền phù tế bào đối tượng hữu dụng việc lai soma Một số loại bị khả sinh sản hữu tính đơn bội, bất thụ đực, bất thụ đột biến,… trì nhân giống phương pháp nhân giống in vitro Những bất lợi phương pháp nhân giống vơ tính in vitro: - Kiểu gen thực vật không ổn định số hệ thống nuôi cấy - Tạo khơng hồn tồn mong muốn: mọc um tùm số cịn giữ khả trẻ hóa q trình ni cấy - Đặc biệt, số loài thân gỗ, việc cảm ứng rễ khó thực Trong số trường hợp, có loại tạo rễ in vitro rễ không phù hợp tạo rễ sau chuyển trồng đất - Việc chuyển từ ống nghiệm vườn ươm khó số - Cây chuyển từ phịng thí nghiệm vườn ươm dễ bị cơng số loại bệnh hại quen sống điều kiện vơ trùng Vì vậy, cần phải xử lý môi trường giá thể sống thật cẩn thận SVTH: Trần Thị Thu Hiền 10 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh chọn đốt thân non tươi, khỏe, kết thu sau vô mẫu mơ sẹo để tiến hành thí nghiệm 3 Hình 4.1 Mơ sẹo mơi trường có bổ sung IBA kết hợp với BA [1]: Môi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.1 mg/l BA [2]: Môi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.25 mg/l BA [3]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA 0.5 mg/l BA Hình 4.2 Mơ sẹo mơi trường có bổ sung IBA kết hợp với Kinetine [1]: Môi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.1 mg/l Kinetine [2]: Môi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.25 mg/l Kinetine [3]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA 0.5 mg/l Kinetine Mô sẹo đám tế bào khơng phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường tạo xáo trộn trình tạo quan, SVTH: Trần Thị Thu Hiền 49 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) Các tế bào thuộc mô quan này, trừ tế bào mô phân sinh, phải chịu phản phân hóa trước lần phân chia (Halperin, 1969) Sự phản phân hóa có vai trị quan trọng, cho phép tế bào trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa) Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả phân chia tạo phôi soma điều kiện thích hợp (Pierik, 1987) Các tế bào thuộc mơ quan phân hóa song tử diệp thường phản phân hóa tác động auxin riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin mô sẹo Mô sẹo tạo nguyên nhân tế bào nhu mơ chịu phản phân hóa cịn phân chia tế bào tượng tầng, xáo trộn mô phân sinh sơ khởi hay xáo trộn trình tạo quan (Hunault, 1979) Khi đặt môi trường, mẫu cấy phồng ra, dày lên hấp thu nước, dinh dưỡng chất điều hịa sinh trưởng thực vật Có nhiều mơ quan thực vật sử dụng để làm vật liệu tạo mô sẹo như: thân, lá, phát hoa, cuống lá, rễ,… (Street, 1969) ; thí nghiệm sử dụng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ, cấy vào môi trường bổ sung auxin cytokinin mẫu cấy phồng chỗ phồng to dần tạo thành mơ sẹo Điều chứng minh Ochatt Caso (1986) người ta tạo mơ sẹo từ nhiều loại quan khác thể thực vật Tuy nhiên, với loại mô hay quan thường phải sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại nồng độ khác tùy theo mức độ nhạy cảm tế bào mơ hay quan Mơ sẹo phát sinh từ gân cuống cịn sót lại sớm từ phần phiến gần đồng thời với phát sinh mô sẹo từ thân cuống Điều hiểu gân có kiểu phân chia giống thân cuống (Bùi Trang Việt, 2000), mà thân, cuống (với mơ vỏ) có xu hướng tạo mô sẹo mô (Dương Công Kiên, 2003) Chọn mẫu cấy đốt thân mẫu đốt thân non, có xu hướng tạo mơ sẹo mơ lá, mơ hoa mười q nhỏ nên khó tạo mơ sẹo Cây non (nguyên vẹn hay cắt đoạn)hay mảnh thân non SVTH: Trần Thị Thu Hiền 50 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh trưởng thành dễ cho mô sẹo điều kiện nuôi cấy in vitro, tác động auxin mạnh áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000) Nhờ thân non ‘Sorbone’ tồn lượng auxin nội sinh cao nên mơi trường khơng chứa chất điều hịa nào, mẫu cấy tạo mô sẹo lên chồi Sự phát triển mơ sẹo chia thành giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào phân hóa Ở giai đoạn phân chia, tế bào mô cấy trở dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hóa Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mơ sẹo khác hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phơi Kết thí nghiệm cho thấy chất kích thích tăng trưởng nồng độ cảm ứng tạo mô sẹo, nên sử dụng môi trường nuôi cấy 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.1 mg/l BA 0.1 mg/l Kinetine mơi trường hình thành mơ sẹo mà lại tiết kiệm lượng chất kích thích điều hịa tăng trưởng thực vật Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần đơn vị thu sinh tạo mô sẹo Sự phát sinh chồi Torenia tuân theo nguyên tắc tỉ lệ A/C: A/C cao kích thích tạo rễ, A/C tiến gần kích thích tạo mơ sẹo, từ mơ sẹo sau hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp kích thích tạo chồi trực tiếp Tỉ lệ A/C xác định tạo quan, tỉ lệ cao tạo chồi, tỉ lệ thấp tạo rễ (Skoog Tsui, 1948; Miller Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959) 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả tái sinh chồi từ dòng mơ sẹo khác Mục đích thí nghiệm xem xét khả tái sinh chồi từ dịng mơ sẹo thu thí nghiệm từ tìm dịng mơ sẹo có khả cảm ứng lượng chồi nhiều phục vụ cho thí nghiệm Hình thái mơ sẹo phụ thuộc nhiều vào loại nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thực vật diện mơi trường ni cấy Qua số thí nghiệm, ghi nhận giữ nguyên nồng độ loại auxin môi trường SVTH: Trần Thị Thu Hiền 51 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh nuôi cấy, thay đổi thành phần nồng độ cytokinin hình thái mô sẹo thay đổi (Mehra Jaidka, 1985; Pal cộng sự, 1985; Shrikhande cộng sự, 1993) Ở thí nghiệm lượng auxin giữ nguyên lượng cytokinin tăng (auxin/cytokinin = 1:5) có tạo chồi từ mơ sẹo Những mô sẹo sau thành lập phát sinh chồi tác động cytokinin ngoại sinh Vì vậy, tổng số chồi tạo kết hai trình phát sinh trực tiếp gián tiếp Tuy nhiên, hình thành chồi từ mơ sẹo khơng kéo dài hoạt tính cytokinin giảm theo thời gian Do đó, đến thời điểm đó, mơ sẹo cịn chồi khơng phát sinh Lượng auxin nội sinh lúc có tác dụng lên trình tạo rễ chủ yếu Sự dừng phát sinh chồi từ mô sẹo sớm số lượng chiều dài rễ tạo lớn sử dụng cytokinin hoạt tính thấp Khả tái sinh chồi dịng mơ sẹo ghi nhận trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng IBA kết hợp với BA Kinetine lên phát sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác Nghiệm Môi trường thức 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine Số chồi Chiều cao trung bình chồi TB (cm) 12a(*) 1.24b 9b 1.34a Ghi chú: (*) Trong cột, giá trị trung bình theo sau chữ khơng kí tự có khác biệt có ý nghĩa mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05 Tuy nhiên, xét mặt hình thái chồi mơi trường có chất điều hịa khác khác nhau.Trên mơi trường có bổ sung IBA BA, mô sẹo tái sinh chồi, chồi khỏe, có thân màu hồng nhạt, chồi có màu trắng, chồi tươi, có màu xanh; mơi trường có bổ sung IBA SVTH: Trần Thị Thu Hiền 52 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Kinetin, mơ sẹo có khả tái sinh chồi chồi yếu, có màu hồng nhạt, đầu chồi bị đen chồi chết dần từ xuống (Hình 4.3) Cytokinin thuận lợi cho phân nhánh chồi non thân thảo Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin môi trường nuôi cấy giai đoạn tạo chồi in vitro Nhóm cytokinin đẩy nhanh phân chia tế bào, nhân chồi phát triển chồi Các chồi tăng trưởng kích thích mạnh mẽ nồng độ cytokinin Từ nhiều nghiên cứu, người ta rút kết luận vai trò cytokinin nuôi cấy chồi: tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định, cản tạo rễ (nồng độ cytokinin cao từ 0.5 – 10 mg/l thường cản làm chậm tạo rễ, đồng thời cản tăng trưởng rễ cản hiệu kích thích tạo rễ auxin) Cytokinin nhóm hormon thực vật đặc biệt đóng vai trị chu trình tế bào ảnh hưởng đến nhiều trình phát triển Srinivasan Mullin phát biểu cytokinin ngoại sinh hoạt hóa cytokinin nội sinh lên mạch mộc Sự thiếu hụt cytokinin thực vật làm xuất chồi bị lùn, đồng thời đỉnh sinh trưởng nhỏ lại, ti thể lạp thể kéo dài ra, tạo tế bào khoảng – 4% so với bình thường Ngồi ra, đỉnh sinh trưởng rễ phình to, phát triển nhanh có nhiều rễ nhánh Tất tượng cho thấy cytokinin yếu tố quan trọng thực vật giúp điều hịa hoạt động kiểm sốt phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng Qua thí nghiệm điều khiển hình thành quan từ đốt thân thuốc lá, Skoog thấy hoạt động cytokinin có ảnh hưởng đáng kể đến ribonucleic acid (RNA), ơng cho cytokinin điều hịa hình thành quan thông qua việc ảnh hưởng đến sinh tổng hợp yếu tố sinh trưởng khác như: thiamin, auxin, cytokinin cịn đóng vai trị chất điều hịa sinh tổng hợp protein Qua thấy tượng phổ biến sinh vât, xuất yếu tố làm thay đổi ngưỡng yếu tố khác Ảnh hưởng cytokinin mô, quan nuôi cấy phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu ni cấy, lồi thực vật nuôi cấy mẫu SVTH: Trần Thị Thu Hiền 53 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh cấy thu từ mơ cịn non hay mơ trưởng thành BA kích thích tăng sinh chồi bên Castanea, kinetine khơng có ảnh hưởng cả, kinetine kích thích tạo chồi bên trình ni cấy chồi Prunus để tăng sinh chồi cần sử dụng đến BA Qua kết cho thấy vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến phát sinh hình thái thực vật đáng kể khác lồi Khơng tái sinh chồi thơng qua mơ sẹo mà cịn tái sinh chồi trực tiếp từ quan như: lá, thân, cuống lá, chồi ngủ, đế hoa, lát mỏng tế bào,… Những chồi phát sinh từ mô trưởng thành không liên quan đến mô phân sinh gọi chồi bất định Về bản, quan thực vật có khả tái sinh mơ phân sinh chồi sinh quan trực tiếp hay gián tiếp Ở hạt kín, nguồn gốc chồi tế bào biểu bì, mô hàng rào, mô khuyết hay mô bao quanh mạch mơ cấy Trước phân hố để tạo chồi tế bào phân hố phải tái hoạt động Sự tái hoạt động trình phát sinh quan cần phải cảm ứng cách: gỡ hiệu ứng cản tương quan nguyên, cắt chồi để gỡ ưu tính ngọn; dùng mơi trường thích hợp cho mơ cấy mơ in vitro Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết cao sử dụng cytokinin nồng độ cao auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar cs., 2003) Kết ghi nhận nhiều đối tượng Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003) SVTH: Trần Thị Thu Hiền 54 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Hình 4.3 Chồi tái sinh từ dịng mơ sẹo mơi trường khác [1]: Mơi trường có bổ sung IBA BA [2]: Mơi trường có bổ sung IBA Kinetine Trong khởi đầu điều hoà tăng trưởng quan, chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trị quan trọng Khi ni cấy mơi trường có cytokinin auxin phát triển chồi kích thích Cần có cân nồng độ loại hormone loại mơ, vị trí chun biệt Khi tỷ lệ cytokinin/auxin (C/A) cao kích thích tạo chồi; ngược lại tỷ lệ C/A thấp kích thích tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) dựa vào thí nghiệm nên thí nghiệm cấy mẫu mơi trường sử dụng 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.5 mg/l BA 0.5 mg/l Kinetine Sự phát sinh chồi Torenia tuân theo nguyên tắc tỉ lệ A/C: A/C cao: kích thích tạo rễ, A/C tiến gần 1: kích thích tạo mơ sẹo, từ mơ sẹo sau hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp Tỉ lệ A/C xác định tạo quan: tỉ lệ cao: tạo chồi, tỉ lệ thấp: tạo rễ (Skoog Tsui, 1948; Miller Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959) Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp quan trọng việc tạo chồi nhiều loài thực vật khác Begonia (Ringe Nitsch, 1968; Heide, 1965), SVTH: Trần Thị Thu Hiền 55 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh cải ốc biển (horse radish) (Wurm, 1960; Sastri, 1963), mao địa hoàng (foxglove) (Dolfus Nicolas-Prat, 1969), Atropa belladonna (Zenkteler, 1971) bơng cải (Margara, 1969) Ngồi ra, tái sinh chồi phụ thuộc vào tượng ưu hình thành mơ phân sinh bên để hình thành chồi bên dọc theo trục chồi Ưu tượng chồi đỉnh ức chế phát triển chồi bên nằm bên Trong điều kiện ni cấy in vitro, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến tăng trưởng phát triển chồi, ức chế mối tương quan chồi đỉnh chồi bên nằm chồi đỉnh Trong loại chất điều hồ tăng trưởng, auxin cytokinin sử dụng để điều hồ tượng ưu tính Theo mơ hình giải thích cổ điển thì: auxin tổng hợp ngọn, sau di chuyển libe (hữu cực) tế bào (vô cực) đến quan cuối rễ Auxin điều hoà cách trực tiếp gián tiếp thông qua chế khác bao gồm hoạt hố chất điều hồ thứ cấp, điều hoà tỷ lệ A/C Khi gia tăng hàm lượng cytokinin mơ tượng ưu tính bị phá vỡ bật chồi kích thích cytokinin; trái ngược với tác động auxin (Bùi Trang Việt, 2000) Áp dụng vào thí nghiệm sử dụng auxin (IBA) cytokinin (BA Kinetine) BA loại cytokinin có hiệu cao cảm ứng tạo chồi nhiều loài thực vật Các loại cytokinin khác (kinetine, 2i – P, PBA zeatin) sử dụng BA (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Kết thí nghiệm cho thấy kết hợp IBA BA cho số chồi nhiều, cịn kết hợp IBA Kinetine cho số chồi chồi kéo dài thân Để phục vụ cho thí nghiệm cần số chồi để tiến hành tiếp nên tiếp tục khảo sát dải nồng độ khác IBA BA để đưa nồng độ thích hợp cho số chồi nhiều Hầu hết chứng nhu cầu cytokinin đặc biệt thực nuôi cấy chồi nhiều lồi thực vật khác Cytokinin hoạt hố phân chia tế bào cách kích thích tổng hợp mạnh mẽ acid nucleic, protein chất SVTH: Trần Thị Thu Hiền 56 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh cần thiết cho trình phân chia tế bào với điều kiện có auxin kết hợp Cytokinin tác động hai bước phân chia tế bào: phân nhân phân bào Cytokinin giúp gia tăng kích thước tế bào sinh tổng hợp protein, cytokinin cản kéo dài tế bào Ở giai đoạn gia tăng kích thước tế bào auxin có vai trị quan trọng, kích thích mạnh kéo dài tế bào diệp tiêu tế bào vùng kéo dài BA kích thích tăng sinh chồi bên Castanea (Vieitez, 1980) kinetine khơng có ảnh hưởng Zeatin có khuynh hướng kích thích tăng trưởng chồi làm tăng nhẹ nảy chồi bên Tương tự, 2-iP kinetine kích thích tạo chồi bên q trình ni cấy chồi Prunus; để tăng sinh chồi cần phải sử dụng đến BA (Martinelli, 1985) Ở thí nghiệm kết hợp IBA BA cho chồi tốt kết hợp IBA Kinetine Quan sát hình thái số lượng chồi cho thấy mơi trường có bổ sung IBA BA cho số lượng chồi nhiều chồi tươi tốt, cịn mơi trường có bổ sung IBA Kinetine chồi cao số lượng chồi chồi có xu hướng chết Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu tiếp mơi trường có bổ sung IBA BA để tái sinh chồi nhiều nồng độ khác để chọn nồng độ cho tỉ lệ chồi cao để tiến hành thí nghiệm 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng IBA BA lên khả tái sinh chồi từ mơ sẹo Với mục đích tạo chồi bất định kết hợp auxin cytokinin cho kết tốt sử dụng cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999) Ở thí nghiệm sử dụng kết hợp IBA BA với nồng độ khác để tái sinh chồi từ mô sẹo nhằm thu lượng chồi nhiều phục vụ cho thí nghiệm Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết cao sử dụng cytokinin nồng độ cao auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar cộng sự, 2003), kết ghi nhận nhiều đối tượng Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L SVTH: Trần Thị Thu Hiền 57 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003) Kết sau tuần nghiên cứu khả bật chồi mô sẹo môi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA nhiều nồng độ khác trình bày bảng bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng IBA kết hợp với BA lên phát sinh chồi Môi trường Số chồi trung bình C1 3.33b (*) C2 20.67ab C3 18b C4 22.33ab C5 20.0b C6 49.33a C7 24.33ab C8 22.67ab Ghi chú: (*) Trong cột, giá trị trung bình theo sau chữ khơng kí tự có khác biệt có ý nghĩa mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05 Trong hầu hết trường hợp, hình thành chồi, rễ từ mơ cịn non dễ từ trưởng thành Tuổi mô ảnh hưởng đến số lượng chồi hình thành kích thước chồi hay Mơ trẻ cho thấy nguồn mẫu tốt cho vài nghiên cứu Giai đoạn sinh lý mẹ ảnh hưởng đến hình thành chồi mơ ni cấy Các chất điều hịa kích thích hình thành chồi đáng kể tương tác khả tái sinh, tuổi mơ nồng độ chất điều hịa tăng trưởng tối ưu Sự tạo chồi rễ từ mô sẹo địi hỏi cần phải có điều chỉnh lại nồng độ auxin cytokinin cảm ứng ban đầu Khi nồng độ cytokinin cao auxin có tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, nồng độ auxin cao cytokinin xử lý với auxin rễ hình thành Trong tạo rễ SVTH: Trần Thị Thu Hiền 58 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh lượng cytokinin ngoại sinh chất cản Người ta cho auxin cảm ứng tạo rễ cảm ứng tổng hợp polyamine (Friedman cộng sự, 1985) Bởi tỉ lệ auxin cytokinin thí nghiệm có khác biệt rõ ràng để tạo mơ sẹo hay tạo chồi hay rễ từ mẫu cấy Hình 4.4 Chồi tái sinh mơi trường bổ sung IBA BA nồng độ khác [1]: Môi trường C1 bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.25 mg/l BA [2]: Môi trường C2 bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.5 mg/l BA [3]: Môi trường C3bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.75 mg/l BA [4]: Môi trường C4 bổ sung 0.1 mg/l IBA 1.0 mg/l BA [5]: Môi trường C5 bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.5 mg/l BA [6]: Môi trường C6 bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.75 mg/l BA [7]: Môi trường C7 bổ sung 0.25 mg/l IBA 1.0 mg/l BA [8]: Môi trường C8 bổ sung 0.25 mg/l IBA 1.25 mg/l BA Quan sát hình thái số liệu cho thấy, cố định lượng IBA, thay đổi lượng BA tăng số chồi tăng đến mức định số chồi lại giảm dần, số chồi tăng lên chiều cao chồi lại giảm số chồi nhiều chồi ko thể kéo dài thân Điều chứng minh Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên (2006), để kích thích tăng trưởng chồi bên làm SVTH: Trần Thị Thu Hiền 59 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh giảm tượng ưu tính ni cấy chồi lồi rộng, người ta thường bổ sung vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy giai đoạn II Cách cảm ứng tăng trưởng vài chồi nhỏ từ mẫu cấy sau khoảng – tuần Nồng độ cytokinin cao kích thích hình thành nhiều chồi nhỏ chồi kéo dài Để kích thích tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy gián tiếp qua tạo mơ sẹo người ta thường phối hợp cytokinin với auxin (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Ở môi trường có bổ sung 0.25 mg/l IBA kết hợp với 0.75 mg/l BA cho số lượng chồi cao chiều cao chồi thấp số lượng chồi nhiều Từ cho thấy chọn hai yếu tố số lượng chồi chiều cao chồi, muốn thu số lượng chồi nhiều khơng thể có chồi kéo dài thân Khi nồng độ cytokinin cao auxin có tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, nồng độ auxin cao xử lý auxin rễ hình thành Trong tạo rễ lượng cytokinin ngoại sinh chất cản Khi phối hợp với auxin cytokinin kích thích phân chia tế bào điều khiển phát sinh hình thái Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy chồi hợp chất phá vỡ trạng thái hưu miên chồi non kích thích hoạt động chồi bên Khi khơng có cytokinin mơi trường ni cấy kì chu trình tế bào bị kéo dài người ta cho cytokinin cần thiết điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào tăng trưởng phát triển tế bào Cytokinin có hiệu vai trị kích thích tạo chồi trực tiếp gián tiếp thực vật nguyên vẹn mô thực vật nuôi cấy in vitro Tác dụng cytokinin trở nên hiệu phối hợp với auxin Trong thí nghiệm, việc kết hợp hai loại chất điều hòa cytokinin auxin cho kết làm tăng số lượng chồi hình thành Đặc biệt kết hợp IBA BA cho lượng chồi hình thành cao SVTH: Trần Thị Thu Hiền 60 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Sau có số lượng chồi nhiều, tiến hành tách cụm chồi lớn thành cụm nhỏ cấy chuyển sang môi trường MS khơng bổ sung chất kích thích tăng trưởng để chồi kéo dài thân rễ thành Từ tiến hành nghiên cứu cấy chuyển sang môi trường kích thích tượng nụ hoa ống nghiệm tiến hành giai đoạn đưa vườn trồng Hình 4.5 Cây hồn chỉnh có chồi rễ SVTH: Trần Thị Thu Hiền 61 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Chương Kết luận – Đề nghị 5.1 Kết luận Nhân giống in vitro hoa mười cơng cụ giúp ích cho việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý cây, quy trình hoa khác với lồi khác nuôi cấy in vitro hoa tồn ngày với điều kiện hoàn toàn khác tự nhiên Qua q trình làm thí nghiệm tơi rút số kết luận sau: Công việc tạo nguồn mẫu vô trùng khó khăn ảnh hưởng nhiều yếu tố Dung dịch Javel 7% sử dụng thời gian phút điều kiện thích hợp để tạo nguồn mẫu vô trùng Chỉ cần lượng auxin cytokinin thấp bổ sung vào môi trường MS cho mẫu hoa mười cảm ứng tạo mơ sẹo Với tỉ lệ cytokinin cao lại cho chồi từ mẫu mô sẹo cấy Với nồng độ chất kích thích tăng trưởng IBA BA cho số lượng chồi kích thước chồi khác Dựa vào môi trường tạo chồi để phục vụ cho thí nghiệm nhân chồi, rễ, kéo dài thân, cho hoa ống nghiệm đem lại giá trị kinh tế cao 5.2 Đề nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm thiết bị sử dụng phịng thí nghiệm có hạn nên xin đưa số đề nghị để nghiên cứu hoàn thiện Nghiên cứu thêm loại hóa chất khử trùng khác đưa mẫu từ bên vào Nghiên cứu thêm mẫu cấy với loại mười có lớn Khảo sát thêm ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng khác lên khả tái sinh mô sẹo SVTH: Trần Thị Thu Hiền 62 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Khảo sát thêm ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng khác lên khả tái sinh chồi Nghiên cứu giai đoạn nhân chồi, cho rễ Nghiên cứu cho tượng nụ hoa ống nghiệm Đưa in vitro vườn ươm, theo dõi sinh trưởng hoa mười giai đoạn vườn ươm đến đạt tiêu chuẩn đem trồng để xem in vitro trồng ngồi tự nhiên không SVTH: Trần Thị Thu Hiền 63