Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.Thu nhận astaxanthin từ Vi tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Rhodosporidium sp., thử nghiệm một số hoạt tính sinh học.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN QUANG VINH THU NHẬN ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS VÀ NẤM MEN RHODOSPORIDIUM SP., THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 Thành phố Hồ Chí Minh – 2022 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Ngô Đại Nghiệp Người hướng dẫn khoa học 2: GS TS Hoàng Nghĩa Sơn Phản biện 1: ………………………………………………… Phản biện 2: ………………………………………………… Phản biện 3: ………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …’, ngày … tháng … năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ngày nay, hợp chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên mối quan tâm hàng đầu, astaxanthin nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng, phát có hoạt tính chống oxy hóa mạnh β-caroten, lycopen, lutein hay vitamin E, astaxanthin ngăn ngừa phát triển tế bào ung thư, làm giảm cholesterol máu, bảo vệ da khỏi tia cực tím, ngăn ngừa lão hóa da, thối hóa điểm vàng Hiện nay, hầu hết astaxanthin thương mại sản phẩm tổng hợp hóa học carotenoid Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng sản phẩm tự nhiên tăng nhanh giá thành cao sản phẩm nhân tạo nên việc tìm kiếm khai thác nguồn astaxanthin tự nhiên đặc biệt quan tâm Vì vậy, luận án nghiên cứu ni cấy, gây stress để tích lũy astaxanthin cao tế bào tảo Haematococcus pluvialis, Ngoài ra, nấm men Rhodosporidium toruloides đối tượng mới, nhóm nghiên cứu phân lập định danh có khả sinh tổng hợp astaxanthin từ tự nhiên, điều kiện Việt Nam, dùng để nghiên cứu thu nhận tách chiết astaxanthin dùng để thử nghiệm số hoạt tính sinh học nhằm ứng dụng cho ngành y dược, mỹ phẩm thủy sản Mục tiêu nghiên cứu luận án Tối ưu hóa quy trình ni cấy tảo H pluvialis nấm men Rhodosporidiumtoruloides sinh tổng hợp astaxanthin có hàm lượng cao Thu nhận, tách chiết astaxanthin từ tảo H pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides; Đánh giá số hoạt tính sinh học astaxanthin, nhằm định hướng ứng dụng cho ngành y dược, mỹ phẩm, chăn nuôi thủy sản Các nội dung nghiên cứu luận án - Nghiên cứu, tối ưu hóa nâng cấp quy trình ni cấy tảo H pluvialis thu nhận astaxanthin; thí nghiệm gây stress ánh sáng đơn sắc hàm lượng Nitơ nhằm thu nhận hàm lượng astaxanthin cao - Nghiên cứu, tối ưu hóa quy trình ni cấy nấm men Rhodosporidium toruloides thu nhận hàm lượng astaxanthin cao; Nâng cấp quy trình ni cấy quy mơ 10 lít, nhằm tách chiết thu nhận astaxanthin - Thu nhận, tách chiết astaxanthin từ sinh khối tảo H Pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides - Thử nghiệm đánh giá số hoạt tính sinh học astaxanthin thu nhận từ 02 đối tượng như: tính khử, tính oxy hóa, tính kháng khuẩn khả tăng cường sắc tố cá dĩa đỏ Symphysodon sp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu astaxanthin tảo Haematococcus pluvialis 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới Theo nghiên cứu Esra Imamoglu cộng (2009), ban đầu trình tăng sinh tế bào H pluvialis thực môi trường BG11 đến tế bào đạt mật độ cao chuyển môi trường RM với thay đổi thành phần dinh dưỡng cường độ chiếu sáng để gây stress Kết thu môi trường RM diện nitơ cường độ chiếu sáng 546 μmol photon/m2/s hàm lượng astaxanthin tích lũy cao (30,07 mg/g) vào ngày thứ 13 (Ye cs., ctv, 2012) Trong đó, tế bào H pluvialis mơi BBM (đối chứng) bắt đầu tích lũy astaxanthin vào ngày thứ 9, hàm lượng astaxanthin tối đa 4,17 mg/g Li cs., (2011) đánh giá hiệu kinh tế việc sản xuất astaxanthin từ nuôi trồng Haematococcus quy mô lớn Trung Quốc với mơ hình ni trồng hai giai đoạn lồi vi tảo 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước Kết nghiên cứu Đặng Diễm Hồng cs., (2012) cho thấy, nồng độ nitrate môi trường ni cấy tăng lên gấp lần mật độ tế bào cực đại tăng 25%, đạt 0,95×106 TB/ml Đồng thời, ni cấy H pluvialis mơi trường có nồng độ nitrate cao kết hợp với việc điều chỉnh chế độ chiếu sáng, làm môi trường chứng minh phương pháp hiệu để đạt mật độ tế bào cao Mật độ tế bào cực đại H pluvialis đạt 3,2×106 TB/ml sau 22 ngày nuôi môi trường RM - 4X (nồng độ NaNO3 1.200 mg/l), kết hợp chiếu ánh sáng trắng UV với cường độ chiếu tương ứng 4,3 klux 1,4 klux, chu kỳ sáng tối 16:8 10 chiếu ánh sáng trắng chiếu ánh sáng trắng kết hợp UV Lê Thị Thơm cs., (2013) nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nitrate môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng H pluvialis Flotow cấp độ bình tam giác 250 mL Các nồng độ nitrate thí nghiệm là: 219 mg/L, 438 mg/L, 876 mg/L, 1314 mg/L, 1752 mg/L 2190 mg/L, nồng độ nitrate 876 mg/L (nồng độ nitrate cao gấp lần so với môi trường RM bản), xác định thích hợp cho sinh trưởng lồi vi tảo Tại nồng độ nitrate thích hợp nêu trên, mật độ tế bào, hàm lượng chlorophyll a astaxanthin đạt cao 1,74 × 106 TB/mL, 2.081 μg/L, 1.053 μg/L, tương ứng Nghiên cứu Trịnh Thị Lan Chi (2010), thử nghiệm bổ sung sắc tố astaxanthin canthaxanthin vào thức ăn cho cá chép Nhật (cá chép koi – cyprinus carpio) kết cho thấy: Với hàm lượng bổ sung > 25 mg/kg thức ăn, astaxanthin có tác dụng tích cực việc cải thiện màu sắc cá chép Nhật, hàm lượng hiệu 78,22 ± 5,84 mg/kg thức ăn 1.2 Tình hình nghiên cứu astaxanthin từ Rhodosporidium toruloides 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Yang cs., (2011) sử dụng bã sắn - phế phụ phẩm cơng nghiệp, dùng cho q trình lên men chủng Phaffia rhodozyma nhằm thu nhận astaxanthin Các yếu tố thích hợp sau: hàm lượng đường tổng bã sắn 40 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, MgSO4 0,5 g/l Cao nấm men (NH4)2SO4 với tỷ lệ 3:2 (w:w) cho nguồn nitơ tốt cho phát triển nấm men Phaffia rhodozyma Hàm lượng astaxanthin thu nhận lên đến 2,98 mg/l Ferrao Garg (2012) tập trung vào khảo sát yếu tố ảnh hưởng carbon nitơ đến thu nhận β-carotene chủng Rhodotorula graminis Nghiên cho thấy manitol (đóng vai trị nguồn cung cấp carbon) có tác động tích cực đến tích lũy sinh khối hàm lượng β-carotene, với hàm lượng manitol dao động từ 10 – 20 g/l nguồn nitơ chọn cao nấm men với hàm lượng dao động khoảng 9,5 – 10 g/l, kết trọng lượng sinh khối khô tối đa đạt 3,8 - 4,3 g/l hàm lượng β-carotene tối đa 190 - 220 mg/l Anfeng Xiao cs., (2015) nghiên cứu mối liên quan chất chuyển hoá nội bào tích luỹ astaxanthin q trình lên men chủng đột biến Phaffia rhodozyma Kết cho thấy, tích luỹ enthanol, protein nội bào, acid béo tác động cạnh tranh tổng hợp astaxanthin Trong đó, chủng P rhodozyma JMUVDL668 JMU-7B12 đạt sản lượng thấp (1.7 1.2 mg/L) so với chủng JMU-MVP14 JMU-17W (20.4 3.9 mg/L) Carla Dias cs., 2016 nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy (3,5-6,0) carotenoid lipid (như axit béo) sản xuất men Rhodosporidium toruloides NCYC 921, kết cho thấy nồng độ sinh khối nấm men lipid cực đại pH 4,0 (5,90 g/L 21,85% w/w, tương ứng), hàm lượng carotenoid tối đa (63,37 mg/g) thu pH 5,0 Các kết báo cáo đóng góp cho q trình tối ưu hóa lên men Rhodosporidium toruloides 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước Võ Thị Hồng Triều (2015) tiến hành khảo sát nguồn cacbon khác sử dụng để nuôi cấy chủng Rhodosporodium toruloides bao gồm rỉ đường, glucose, saccharose gylcerol nhằm thu nhận hàm lượng carotenoid cao Kết cho thấy nuôi chủng Rhodosporodium toruloides với rỉ đường nguồn cacbon thu hàm lượng carotenoid cao (2,5 ml/L dịch nuôi cấy) CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu môi trường điều kiện nuôi cấy thu nhận astaxanthin tảo H pluvialis - Chủng tảo H pluvialis có khả sinh tổng hợp astaxanthin cung cấp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Chọn lọc môi trường, thiết lập điều kiện nhân sinh khối H pluvialis Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng đến vòng đời tăng trưởng H pluvialis Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng môi trường C, RM, F/2 B Môi trường (mg/l) Thành phần môi trường C RM F/2 B NaNO3 - 300 75 250 NaH2PO4.H2O - - - Na2SiO3.9H2O - - 30 - Na2EDTA 2,71 - 4,36 - CoCl2.6H2O 0,012 - 0,01 - CuSO4.5H2O - 0,08 0,01 0,06 FeCl3.6H2O 5,888 17 3,15 - MnCl2.4H2O 0,108 - 0,18 - Na2MoO4.2H2O 0,0075 - 0,006 - ZnSO4.7H2O 0,066 0,1 0,022 0,2 HCl Thiamin 0,01 - 0,1 - Biotin 0,0001 - 0,0005 - B12 0,0001 - 0,0005 - K2HPO4 - 80 - 75 KH2PO4 - 20 - 175 CaCl2 - - - 25 NaCl - 20 - 25 40 10 - 75 FeCl3 - - - 0,3 MnSO4.4H2O - - - 0,3 H3BO3 - 0,3 - 0,2 Ca(NO3)2 150 - - - KNO3 100 - - - 50 - - - - 58,5 - - MgSO4.7H2O β – Na2glycerolphosphate CaCl2 H2O Môi trường (mg/l) Thành phần môi trường C RM F/2 B EDTA - 7,5 - - MnSO4 H2O - 1,5 - - (NH4)6Mo7O24 H2O - 0,3 - - Co(NO3) H2O - 0,26 - - 500 - - - Trisaminomethiane 2.2 Nghiên cứu gây stress ánh sáng đơn sắc hàm lượng Nitơ nhằm thu nhận astaxanthin Khảo sát ảnh hưởng chế độ ánh sáng đến hiệu tích lũy astaxanthin H pluvialis Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ nồng độ nitơ thích hợp cho sinh trưởng tảo H pluvialis 2.3 Nghiên cứu điều kiện môi trường nuôi cấy thu nhận astaxanthin nấm men Rhodosporidium toruloides Chủng nấm men Rhodosporidium toruloides có khả sinh tổng hợp astaxanthin giải trình tự gen rDNA-ITS với cặp mồi ITS1-ITS4-5.8S rDNA Nam Khoa BioTek 2.4 Tối ưu hóa quy trình ni cấy nấm men Rhodosporidium toruloides thu nhận astaxanthin Tối ưu hóa quy trình phương pháp đáp ứng bề mặt Box – Behnken dùng phần mền Design Expert nhằm thu nhận carotenoid chứa astaxanthin cao 2.5 Nâng cấp quy trình ni cấy, tách chiết thu nhận astaxanthin từ sinh khối tảo H Pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides Nâng cấp quy mơ 20 lít tảo H Pluvialis quy mơ 10 lít nấm men Rhodosporidium toruloides Tiến hành tách chiết tác nhân học, dung môi, acid HCl enzyme nhằm thu astaxanthin cao 2.6 Thử nghiệm đánh giá số hoạt tính sinh học astaxanthin thu nhận từ tảo H Pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides Đánh giá tính khử, tính oxy hóa, tính kháng khuẩn khả tăng cường sắc tố cá dĩa đỏ Symphysodon sp CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận astaxanthin tảo H pluvialis Vòng đời vi tảo H pluvialis trải qua giai đoạn với hình thái, kích thước hàm lượng sắc tố khác Trong nghiên cứu này, quan sát giai đoạn sinh trưởng tảo: giai đoạn tế bào (TB) sinh dưỡng, giai đoạn tạo bào nang, giai đoạn TB nang hoàn chỉnh giai đoạn nảy mầm Môi trường RM tảo đạt mật độ tế bào cực đại, hàm lượng astaxanthin, trọng lượng khô cao với giá trị tương ứng 5,13x105 TB/ml, 487 μg/l, 2,32 g/l Tảo phát triển môi trường F2 Trong 14 ngày nuôi cấy đầu mật độ tế bào (MĐTB) tăng dần đạt cực đại vào ngày ni thứ 14, sau giảm dần Ngược lại, trọng lượng khơ tảo lại có xu hướng tăng dần theo thời gian ni Điều giải thích MĐTB tảo vào pha ổn định (ngày nuôi thứ 14), tế bào tảo giảm phân chia tảo chuyển từ giai đoạn tế bào sinh dưỡng sang giai đoạn tạo bào nang nên kích thước tế bào giai đoạn bắt đầu tăng lên mà trọng lượng khô tảo tăng dần Sau thời gian nuôi cấy sau 18 ngày, lúc môi trường trở nên thiếu thức có cường độ chiếu sáng 180 μmol/m2/s hàm lượng astaxanthin lại giảm nhanh đa phần tảo bị lắng đáy chết dần Như vậy, với cường độ chiếu sáng 120 μmol/m2/s, nhiệt độ 350C điều kiện phù hợp cho tích lũy astaxanthin Vậy gây stress tảo cường độ chiếu sáng 120 μmol/m2/s thời gian ngày (pha II) hàm lượng astaxanthin cao tương ứng 4.618,67 μg/l trọng lượng khô thu cao 4,44 g/l (nhiệt độ 350C) Bảng 1: Hàm lượng astaxanthin H pluvialis gây sốc cường độ chiếu sáng khác Nghiệm thức Ngày ĐC 120 180 (μmol/m /s) (μmol/m /s) (μmol/m2/s) 14 324,8 ± 0,00a 324,8 ± 0,00a 324,8 ± 0,00a 558,93 ± 26,06b 724,27 ± 16,03a 752,53 ± 33,57a 628,27 ± 16,11b 942,4 ± 31,96a 360 ± 54,19c 968,53 ± 54,19b 1891,2 ± 3,2a 96 ± 135,1c 1073,6 ± 66,7b 4618,67 ± 12,1a 0,00 ± 0,00c 2 Số liệu trình bày bảng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn nghiệm thức, số liệu hàng có chữ khác thể sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 3.3 Stress hàm lượng nitơ trình nuôi cấy tảo H pluvialis thu nhận astaxanthin Trong suốt trình tảo H Pluvialis tăng trưởng làm tiêu tốn lượng lớn nitơ, cụ thể bốn lơ thí nghiệm cho kết tương đồng nhau, hàm lượng nitơ ngày nuôi cấy lô thứ thứ 112,14 mg/L 112,42 mg/L cịn lơ lơ 4, hàm lượng nitơ 111,07 mg/L Sau chuyển sang nuôi tảo H Pluvialis pha 2, giá trị giảm dần tế bào tảo H Pluvialis chuyển từ trạng thái bào nang sang bào nang hồn chỉnh, tức tích lũy lượng lớn astaxanthin, lúc hàm lượng nitơ lô 10 thứ giảm xuống cịn 63,38 mg/L, lơ lơ 63,05 mg/L, riêng lô thứ hàm lượng nitơ giảm cịn 60,23 mg/L Dựa vào kết phân tích cho thấy, hàm lượng astaxanthin sau ly trích dao động từ 5.144 μg/L – 7.535,8 μg/L tương ứng với 2,34 – 2,61 %/SKK Bảng 2: Hàm lượng astaxanthin sau ly trích Thơng số lơ lơ lô lô Sinh khối khô (g/L) 0,25 0,3 0,22 0,3 Hàm lượng astaxantin (μg/L) 6.530,5 7.520 5.144 7.535,8 Astanxanthin sinh khối khô (%) 2,61 2,51 2,34 2,51 3.4 Thử nghiệm hoạt tính khử oxy hóa khả tăng cường sắc tố đỏ cá dĩa astaxanthin từ vi tảo H pluvialis Dịch chiết astaxanthin thu từ tảo H Pluvialis có hoạt tính kháng oxy hóa có khả kháng oxy hóa cao chứng dương BHA, kết có khả khử mạnh BHA 1,17 lần khả bắt gốc ABTS+ mạnh gấp 1,53 lần so với mẫu BHA Kết nghiên cứu tăng màu sắc cá dĩa với liều lượng 75 mg/kg thức ăn astaxanthin thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis, cho kết tăng cường sắc tố đỏ cá dĩa 3.5 Thu nhận astaxanthin nấm men Rhodosporidium toruloides 3.5.1 Xác định số thành phần rỉ đường trước sau xử lý cần cho q trình ni cấy nấm men Rhodosporidium toruloides để thu nhận astaxanthin 11 Kết cho thấy thành phần khống bổ sung vào mơi trường rỉ đường MgSO4.7H2O g/l, urea 0,5 g/l, KH2PO4 g/l, tỷ lệ giống so với môi trường nuôi cấy 10% (mật độ tế bào từ đến 10x106 tế bào/ml), hàm lượng đường tổng rỉ đường 25 g/l Thời điểm thu nhận astaxanthin từ Rhodosporodium toruloides 82 3.5.2 Kết xây dựng đường cong tăng trưởng chủng Rhodosporidium sp môi trường rỉ đường khảo sát yếu Log(N/ml) tố thích hợp 10 09 09 08 08 07 07 06 06 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian (giờ) 12 Dựa vào giá trị OD610nm từ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 số lượng tế bào nấm men tương ứng với giá trị OD610nm để tính mật độ tế bào ml môi trường log (N/ml) Kết nghiên cứu xây dựng đường tương quan tuyến tính mật độ tế bào OD610nm, sở xây dựng đường cong tăng trưởng chủng Rhodosporidium toruloides môi trường rỉ đường khảo sát Chủng nấm men Rhodosporidium toruloides môi trường rỉ đường cho thấy khung thời gian giai đoạn sinh trưởng khác sau: Pha tiềm tàng khoảng đầu, pha tăng trưởng hàm mũ vào khoảng thứ đến thứ 30, pha ổn định từ thứ 32 đến thứ 80, pha suy tàn từ thứ 82 trở sau 3.5.3 Tối ưu hóa Thành phần mơi trường phần mềm Design Expert Thành phần môi trường tối ưu dự đoán để thu nhận astaxanthin cao chủng nấm men Rhodosporidium toruloides thể bảng 3.6 Chúng tiến hành nuôi chủng nấm men mơi trường dự đốn thu kết bảng sau Bảng 3.3: Kết thực nghiệm dự đốn hàm lượng astaxanthin mơi trường tối ưu Hàm MgSO4 lượng Urea 7H2O đường (g/l) (g/l) tổng (g/l) Dự 26,04 1,04 3,0 đoán Thực 26,04 1,04 3,0 nghiệm KH2PO4 (g/l) pH Hàm lượng carotenoi d (µg/g) 2,0 5,96 183,162 2,0 5,96 186,48 Kết thu nhận sau tối ưu hóa thành phần mơi trường nuôi chủng nấm men Rhodosporidium toruloides môi trường rỉ đường với hàm lượng đường tổng 26,04 g/l, hàm 13 lượng urea 1,04 g/l, MgSO4.7H2O g/l, KH2PO4 2g/l, pH 5,96 tỷ lệ giống 10%, thời gian 82 nuôi cấy (v/v) thu hàm lượng carotenoid cao 186,48 µg/g 3.6 Nâng cấp khảo sát điều kiện nuôi cấy thu nhận astaxanthin hệ thống lên men 10 lít Trọng lượng sinh khối khô hàm lượng astaxanthin hệ thống nuôi cấy 10 lít với tỉ lệ giống 10% Rhodosporodium toruloides mơi trường rỉ đường tối ưu Q trình khảo sát yếu tố thích hợp cho ni cấy nấm men Rhodosporodium toruloides (thể tích 100 ml) để thu nhận astaxanthin hiệu với hàm lượng đường tổng 25 g/l, urea công nghiệp 0,5 g/l, MgSO4.7H2O công nghiệp g/l, KH2PO4 g/l, tỷ lệ giống 10% so với thể tích dịch mi cấy ni 80 thu hàm lượng astaxanthin 1.186,88 µg/l trọng lượng sinh khối khô 6,3312 g/l Bảng 4: Hàm lượng astaxanthin thu thể tích ni cấy 100 ml Hàm lượng astaxanthin Trọng lượng sinh khối (µg/g sinh khối khơ) (µg/l dịch ni cấy) 187.666 ± 3.695 1186.88 13.638 khô thu (g/l) 6.3312 ± 0.0507 Dựa vào kết ta thấy nuôi cấy chủng nấm men Rhodosporodium toruloides môi trường rỉ đường nâng cấp hệ thống 10 lít, trọng lượng sinh khối khơ thu 6,3682 (g/l), hàm lượng astaxanthin tính thể tích dịch ni cấy tương ứng 1932,21(µg/l) 3.7 Tách chiết astaxanthin acid HCl/DMSO/enzyme cellulase 14 Hàm lượng astaxanthin thu nhận phương pháp tách chiết khác Trong đó, tách DMSO cho lượng astaxanthin cao (287,159 µg/g), tiếp đến HCl cho lượng astaxanthin thấp (133,428 µg/g) Tách chiết enzyme cellulase thấp (82,319 µg/g) Tách chiết DMSO cho hàm lượng astaxanthin cao DMSO có khả liên kết kỵ nước với lớp phospholipid màng tế bào, gắn kết làm giãn nở màng, chí dẫn đến trương phồng tế bào, DMSO phá vỡ tương tác lipit protein làm ảnh hưởng chức màng tế bào Một số dung mơi hịa tan nước acetone, ethanol methanol thâm nhập vào lớp nước bên ngồi cách dễ dàng trích xuất astaxanthin khỏi nấm men hồng hiệu quả, acetone dung môi chiết rút astaxanthin hiệu phù hợp với nghiên cứu Hui cs (Hui Ni, 2008) 3.8 Thử nghiệm hoạt tính khử oxy hóa khả tăng cường sắc tố đỏ cá dĩa astaxanthin từ nấm men Rhodosporodium toruloides Từ dịch chiết astaxanthin DMSO, đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn (hàm lượng astaxanthin xác định HPLC/MS 5,09 µg/mg) Kết hoạt tính kháng oxi hóa thể qua lực khử bắt gốc tự ABTS+ DPPH Khả bắt gốc tự DPPH, IC50 vitamin C BHA cao so với dịch chiết astaxanthin 2,62 lần 1,93 lần Bắt gốc tự ABTS+ dịch chiết astaxanthin có giá trị IC50 14,83 µg/ml tương đương vitamin C BHA 14,33 µg/ml 14,43 µg/ml, lực khử dịch chiết astaxanthin 25 µg/ml cao gấp 1,28 lần so với đối chứng vitamin C gấp 1,16 lần so với BHA Như astaxanthin 15 chất có hoạt tính kháng oxi hóa cao cao so với chất chuẩn vitamin C BHA Astaxanthin có khả kháng khuẩn cao: Đạt đường kính (mm) kháng khuẩn khoảng 16 đến 18 mm (tùy theo phương pháp tách chiết) nồng độ astaxanthin 100 µg/ml chủng Bacillus subtilis, E.coli, Salmonella typhi, Pseudogonas aeroginasa Staphylococcus aureus Kháng sinh chloramphenicol làm đối chứng dương có đường kính (mm) kháng khuẩn cao từ 20 mm đến 35 mm tùy theo chủng Dịch chiết astaxanthin thu nhận từ nấm men hồng Rhodosporidium sp có khả ức chế lên đường cong tăng trưởng vi khuẩn: Bacillus subtilis, E coli, Pseudomonas aeroginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus từ nồng độ 12,5 µg Như nồng độ ức chế tối thiểu astaxanthin lên năm chủng vi khuẩn mà nghiên cứu (MIC) đạt 12,5 µg/ml Kết nghiên cứu cho thấy khả tăng cường màu sắc sắc tố đỏ cá dĩa astaxanthin thu nhận từ nấm men Rhodosporidium toruloides với liều lượng 90 mg/kg thức ăn 3.9 So sánh kết tảo H pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides Kết so sánh đối chiếu kết astaxanthin thu nhận từ Tảo Haematococcus pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides, thử nghiệm số hoạt tính sinh học thể bảng 3.3.3 Bảng 3.3: Đối chiếu kết thu nhận hoạt tính sinh học astaxanthin chiết suất từ tảo Haematococcus pluvialis nấm men Rhodosporidium toruloides 16 Nội dung Vi tảo Nấm men Haematococcus Rhodosporidium pluvialis toruloides Vòng đời tảo Vòng đời nấm men Haematococcus Rhodosporidium pluvialis: Từ 12 đến toruloides: môi 14 ngày nuôi tiếp trường rỉ đường chia làm theo, tảo dạng tế bào pha, pha tiềm tàng hình khối cầu, màu khoảng đầu, pha tăng xanh, hai roi, trưởng hàm mũ vào khơng có khả khoảng thứ đến chuyển động Từ 14 thứ 30, pha ổn định từ đến 20 ngày nuôi tiếp thứ 32 đến thứ 80, pha Nuôi cấy thu nhận astaxanthin theo, tảo chuyển sang suy tàn từ thứ 82 trở giai đoạn tạo bào sau nang, nội chất bên Thành phần khoáng bổ tế bào có màu sung vào mơi trường rỉ nâu tảo bắt đầu tích đường MgSO4.7H2O lũy astaxanthin g/l, urea 0,5 g/l, KH2PO4 Môi trường RM tảo đạt g/l, tỷ lệ giống so với mật độ tế bào cực đại, môi trường nuôi cấy hàm lượng 10% (mật độ tế bào từ astaxanthin, trọng đến 10x106 tế bào/ml), lượng khô cao hàm lượng đường tổng với giá trị tương rỉ đường 25 g/l ứng 5,13x105 TB/ml, Thời 487 μg/l, 2,32 g/l 17 điểm astaxanthin thu nhận từ Tảo H pluvialis sinh Rhodosporodium trưởng phát triển toruloides 82 mạnh ánh sáng Tối ưu để thu nhận trắng (mật độ tế bào carotenoid từ chủng nấm cực đại 5,53x105 men Rhodosporidium TB/ml, hàm lượng toruloides, thành phần mơi 469,33 trường tối ưu hóa rỉ đường astaxanthin μg/l trọng lượng thu nhận carotenoid gồm khô 2,35 g/l thấp hàm lượng đường tổng ánh sáng đỏ 26,04 g/l, hàm lượng urea (mật độ tế bào cực đại 1,04 g/l, MgSO4.7H2O 2,6x105 TB/ml, g/l, KH2PO4 g/l, pH 5,96 lượng tỷ lệ giống 10% (v/v), hàm astaxanthin 66,67 μg/l thời gian nuôi cấy 80 trọng lượng khô giờ, thu hàm lượng 0,62 g/l) carotenoid cao 186,48 µg/g Tách chiết Tách chiết DMSO có DMSO có hàm lượng hàm lượng astaxanthin astaxanthin cao cao (287,159 µg/g), Tách chiết mẫu chiết tiếp đến HCl thủy tinh (133,428 µg/g) thấp thu nhận ezyme 82,319 ± 4,4823 μg/g Thử nghiệm Dịch astaxanthin tách Dịch chiết astaxanthin từ hoạt tính chiết từ tảo sinh học pluvialis có hoạt tính Rhodosporodium 18 H nấm men kháng oxi hóa qua toruloides có hoạt tính lực khử gốc kháng oxi hóa mạnh gấp ABTS+ mạnh gấp 2,62 lần DPPH 1,93 1,53 lần so với mẫu lần; lực khử dịch BHA mẫu chiết astaxanthin 25 µg/ml astaxanthin thu cao gấp 1,28 lần so với đối có khả khử chứng vitamin C gấp 1,16 mạnh BHA 1,17 lần so với BHA Dịch chiết ức chế lên lần Kết nghiên cứu đường cong tăng trưởng tăng màu sắc cá vi khuẩn: Bacillus dĩa với liều lượng 75 subtilis, E coli, mg/kg thức ăn, cho Pseudomonas aeroginosa, kết tang cường Salmonella sắc tố đỏ cá dĩa Staphylococcus typhi, aureus từ nồng độ 12,5 µg Kết với liều lượng 90 mg/kg thức ăn, cho kết tăng cường sắc tố đỏ cá dĩa CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Đối với vi tảo Haematococcus pluvialis - Môi trường RM tảo đạt mật độ tế bào cực đại, hàm lượng astaxanthin, trọng lượng khô cao với giá trị tương ứng 5,13x105 TB/ml, 487 μg/l, 2,32 g/l Tảo phát triển môi trường F2 19 - Tảo H pluvialis sinh trưởng phát triển mạnh ánh sáng trắng (mật độ tế bào cực đại 5,53x105 TB/ml, hàm lượng astaxanthin 469,33 μg/l trọng lượng khô 2,35 g/l thấp ánh sáng đỏ (mật độ tế bào cực đại 2,6x105 TB/ml, hàm lượng astaxanthin 66,67 μg/l trọng lượng khô 0,62 g/l) - Khi stress tảo cường độ chiếu sáng 120 μmol/m2/s thời gian ngày (pha 2) hàm lượng astaxanthin tương ứng 4.618,67 μg/l trọng lượng khô thu cao 4,44 g/l (nhiệt độ 350C); Còn gây stress thêm thời gian chiếu sáng lên 24 hàm lượng astaxanthin 3.076,8 μg/l trọng lượng khô thu cao 3,72 g/l (nhiệt độ cao 330C) - Đã xây dựng quy trình ni sinh khối tảo H Pluvialis quy mơ 20 lít theo quy trình ni tảo pha: pha I sử dụng môi trường lỏng RM, mật độ tảo ban đầu 105 TB/ml, ánh sáng đèn led màu trắng với cường độ chiếu sáng 90 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ, sục khí liên tục, cung cấp khí CO2 với hàm lượng 18ppm cho tảo quang hợp; pha cường độ chiếu sáng 120 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 Hàm lượng astaxanthin sau ly trích đạt từ 5.144 – 7.535,8μg/L chiếm từ 2,34 - 2,61%/SKK - Dịch chiết astaxanthin thu từ tảo H Pluvialis có hoạt tính kháng oxy hóa có khả kháng oxy hóa cao chứng dương BHA, kết có khả khử mạnh BHA 1,17 lần khả bắt gốc ABTS+ mạnh gấp 1,53 lần so với mẫu BHA Ngoài ra, dịch chiết astaxanthin từ tảo H Pluvialis với liều lượng 75 mg/kg thức ăn làm tăng cường sắc tố đỏ cá dĩa Đối với Nấm men Rhodosporodium toruloides - Thành phần khoáng bổ sung vào môi trường rỉ đường MgSO4.7H2O g/l, urea 0,5 g/l, KH2PO4 g/l, tỷ lệ giống so với 20 môi trường nuôi cấy 10% (mật độ tế bào từ đến 10x106 tế bào/ml), hàm lượng đường tổng rỉ đường 25 g/l Thời điểm thu nhận astaxanthin từ Rhodosporodium toruloides 82 - Nuôi cấy chủng nấm men Rhodosporodium toruloides môi trường rỉ đường hệ thống 10 lít trọng lượng sinh khối khô thu 6,3682 (g/l), hàm lượng astaxanthin tính thể tích dịch ni cấy tương ứng 1.243,13 (µg/l) - Đã tối ưu hóa thành phần mơi trường để thu nhận astaxanthi từ chủng nấm men Rhodosporidium toruloides, thành phần mơi trường tối ưu hóa rỉ đường thu nhận astaxanthin gồm hàm lượng đường tổng 26,04 g/l, hàm lượng urea 1,04 g/l, MgSO4.7H2O g/l, KH2PO4 g/l, pH 5,96 tỷ lệ giống 10% (v/v), thời gian nuôi cấy 80 giờ, thu hàm lượng astaxanthin cao 186,48 µg/g So sánh kết thực nghiệm với kết dự đốn ni môi trường tối ưu, hàm lượng carotenoid môi trường tối ưu thực nghiệm 186,48 µg/g, cao so với hàm lượng carotenoid dự đốn 3,318 µg/g - Tách chiết astaxanthin dung môi DMSO, HCl 0,4N enzyme cellulase để thu nhận astaxanthitn từ nấm men Rhodosporidium toruloides kết DMSO cao (287,159 µg/g), tiếp đến HCl 0,4N (133,428 µg/g) thấp thu nhận ezyme 82,319 ± 4,4823 μg/g - Từ dịch chiết astaxanthin DMSO, đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn (hàm lượng astaxanthin xác định HPLC/MS 5,09 µg/mg) Kết hoạt tính kháng oxi hóa qua lực khử bắt gốc tự ABTS+ DPPH Khả bắt gốc tự DPPH, IC50 vitamin C BHA cao so với dịch chiết astaxanthin 2,62 lần 1,93 lần Bắt gốc tự ABTS+ dịch chiết astaxanthin có giá trị IC50 14,83 µg/ml tương đương vitamin C 21 BHA 14,33 µg/ml 14,43 µg/ml, lực khử dịch chiết astaxanthin 25 µg/ml cao gấp 1,28 lần so với đối chứng vitamin C gấp 1,16 lần so với BHA Như astaxanthin chất có hoạt tính kháng oxi hóa cao cao so với chất chuẩn vitamin C BHA - Astaxanthin có khả kháng khuẩn cao: Đạt đường kính (mm) kháng khuẩn nồng độ astaxanthin 100 µg/ml lần lượt: Chủng Bacillus subtilis, E.coli, Salmonella typhi, Pseudogonas aeroginasa Staphylococcus aureus khoảng 16 đến 18 mm (tùy theo phương pháp tách chiết) Kháng sinh chloramphenicol làm đối chứng dương có đường kính (mm) kháng khuẩn cao từ 20 mm đến 35 mm tùy theo chủng - Dịch chiết astaxanthin thu nhận từ nấm men hồng Rhodosporidium sp có khả ức chế lên đường cong tăng trưởng vi khuẩn: Bacillus subtilis, E coli, Pseudomonas aeroginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus từ nồng độ 12,5 µg Như vậy, nồng độ ức chế tối thiểu astaxanthin lên năm chủng vi khuẩn mà chúng tơi nghiên cứu (MIC) đạt 12,5 µg/ml - Astaxanthin chiết xuất từ sinh khối nấm men có tác dụng cải thiện màu sắc cá dĩa đỏ Symphysodon sp liều 90 mg/kg thức ăn sau cho cá ăn ba tháng 4.2 Kiến nghị - Cần nghiên cứu thêm hoạt tính kháng ung thư dòng tế bào astaxanthin Nghiên cứu tạo nano-astaxanthin để tăng tính tan nước astaxanthin ứng dụng dược phẩm nuôi trồng thủy sản 22 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Nghiên cứu sâu vào quy trình chế sinh tổng hợp astaxanthin tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis áp dụng công nghệ ánh sáng đơn sắc (LEDs) ảnh hưởng nitơ đến sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis quy trình phịng thí nghiệm nâng cấp Quy mơ pilot 20 lít - Từ chủng nấm men Rhodosoridium toruloides phân lập định danh Việt Nam, nghiên cứu sâu việc tận dụng phụ phế phẩm rỉ đường làm môi trường ni cấy tối ưu hóa quy trình ni cấy nhằm sinh tổng astaxanthin có hàm lượng cao từ tự nhiên nâng cấp quy trình ni cấy quy mơ 10 Lít nhằm nâng cao sinh khối tách chiết thu nhận astaxanthin ứng dụng thực tiễn - Nghiên cứu so sánh astaxanthin thu từ tự nhiên (từ tảo nấm men Rhodosporidium turoloides) so với astaxanthin tổng hợp hóa học hoạt tính sinh học: tính kháng oxy hóa DPPH, tính oxy hóa với khả bắt gốc tự ABTS+ lực khử; tính kháng khuẩn định hướng phục vụ ngành Dược, Mỹ phẩm; đánh giá tăng cường màu sắc cá cảnh định hướng phục vụ ni trồng thủy sản nói chung nghề ni cá cảnh nói riêng DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Quang-Vinh Tran, Quoc-Cuong Duong, Dang-Khoa Tran, Dai-Nghiep Ngo, Rhodosporidium sp growth in molasses medium and extraction of its astaxanthin by using Hcl, Journal of Scienceand Technology, 2017-55 (1A) (2017) 8-18 Tuyet Nhung Tran, Quang-Vinh Tran, Hao Thanh Huynh, Nghia-Son Hoang, Hoang Chinh Nguyen, Dai-Nghiep Ngo, 23 Astaxanthin Production by Newly Isolated Rhodosporidium toruloides: Optimization of Medium Compositions by Response Surface Methodology,Not Bot Horti Agrobo, 2019, 47(2):320-327 Trần Quang Vinh, Nguyễn Thị Kim Liên, Ngô Đại Nghiệp, 2020, Nghiên cứu ảnh hưởng việc bổ sung astaxanthin βglucan ly trích từ sinh khối nấm men Rhodospridium sp vào thức ăn cho cá dĩa đỏ Symphysodon sp., Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ Thủy sản, số 3/2020, ISSN:1859 – 2252 Trần Quang Vinh, Hồng Nghĩa Sơn, Ngơ Đại Nghiệp, Hoạt tính khử bắt gốc dpph astaxanthin tách chiết từ Rhodosporidium sp cellulase, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, chuyên san Nấm Công nghệ sinh học – 2020, ISSN:08668566 Trần Quang Vinh, Dương Quốc Cường, Ngô Đại Nghiệp, Hoàng Nghĩa Sơn, Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn dịch chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp DMSO, Tạp chí Trường Đại học Tây Nguyên -Số 47/2021, ISSN 1859-4611 24