Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất 6 shogaol trong cao gừng (zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (apium graveolens

ii LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ thực hoàn thành Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn GS TS Nguyễn Cửu Khoa Trong thời gian học tập chương trình đào tạo thạc sĩ Học viện Khoa học Công nghệ, nhận nhiều kiến thức bổ ích từ tập thể Giảng viên khoa Hóa học – Học viện Khoa học Công nghệ Những kiến thức giúp tơi phát triển kĩ tri thức, áp dụng vào đơn vị cơng tác hồn thành luận văn tốt nghiệp Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS TS Nguyễn Cửu Khoa hết lòng hướng dẫn, định hướng tạo điều kiện cho thực luận văn cách tốt Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy thuộc khoa Hóa học ln sẵn sàng hỗ trợ kiến thức tạo điều kiện trang thiết bị, máy móc có liên quan đến luận văn Cảm ơn cán Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng trực tiếp hỗ trợ giải đáp thắc mắc suốt q trình tơi thưc Cảm ơn gia đình tập thể lớp cao học khóa 2018B ln động viên tơi thực luận văn tốt nghiệp Kính chúc quý thầy cô dồi sức khỏe thành công nghiệp khoa học Chúc bạn học viên khóa 2018B thành công Tôi xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 06 năm 2021 Học viên cao học Lê Nguyễn Tường Vi iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ MeCN Acetonitrile COSY Homonuclear Correlated Spectroscopy Nghĩa tiếng Việt Phổ tương tác proton carbon kế cận CTPT Công thức phân tử brs Mũi đơn rộng d doublet Mũi đôi DEPT Distortionles Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT D2O Deuterated oxide EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol EtOH abs EtOH absolute Cồn tuyệt đối HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng m multiplet Mũi đa MeOH Methanol MeOD Deuterated methanol NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm Part per million Một phần triệu q quartet Mũi bốn s singlet Mũi đơn SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối iv SKĐ Sắc kí đồ t triplet Mũi ba TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TMS Tetramethylsilane UV-Vis Ultraviolet-visible spectroscopy δH, δC Phổ tử ngoại-khả kiến Độ chuyển dịch hóa học proton carbon v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu hóa chất 18 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị dụng cụ 20 Bảng 2.3 Dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính [6]-shogaol 30 Bảng 2.4 Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính apigenin 33 Bảng 2.5 Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính fucoidan 37 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly cao gừng 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả trích ly cao gừng 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến khả trích ly cao gừng 42 Bảng 3.5 Dữ liệu NMR hợp chất phân lập từ gừng so với TLTK 45 Bảng 3.6 Kết định lượng [6]-shogaol nguyên liệu gừng 46 Bảng 3.7 Kết định lượng [6]-shogaol mẫu gừng thị trường 47 Bảng 3.8 Kết định lượng [6]-shogaol mẫu sản phẩm chiết tách 47 Bảng 3.9 Kết tính tương thích hệ thống [6]-shogaol 49 Bảng 3.10 Độ đặc hiệu [6]-shogaol 50 Bảng 3.11 Đường chuẩn [6]-shogaol phương pháp HPLC 51 Bảng 3.12 Độ lặp lại quy trình định lượng [6]-shogaol HPLC 52 Bảng 3.13 Độ quy trình thẩm định [6]-shogaol 52 Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly cao cần tây 54 Bảng 3.15 Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả trích ly cao cần tây 55 Bảng 3.16 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả trích ly cao cần tây 56 Bảng 3.17 Kết NMR hợp chất phân lập từ cần tây so với TLTK 59 Bảng 3.18 Kết định lượng apigenin nguyên liệu cần tây 61 Bảng 3.19 Kết định lượng apigenin cao cần tây thị trường 62 Bảng 3.20 Kết định lượng apigenin sản phẩm chiết tách 63 Bảng 3.21 Kết tính tương thích hệ thống apigenin 64 Bảng 3.22 Độ đặc hiệu quy trình thẩm định apigenin 65 Bảng 3.23 Độ lặp lại quy trình thẩm định apigenin HPLC 66 vi Bảng 3.24 Đường chuẩn apigenin phương pháp HPLC-PDA 66 Bảng 3.25 Độ quy trình thẩm định apigenin 68 Bảng 3.26 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly rong nâu 69 Bảng 3.27 Ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly rong nâu 70 Bảng 3.28 Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả trích ly rong nâu 71 Bảng 3.29 Kết định lượng fucoidan HPLC 75 Bảng 3.30 Kết định lượng fucoidan UV-Vis 76 Bảng 3.31 Tính tương thích hệ thống fucoidan phương pháp UV-Vis 76 Bảng 3.32 Độ đặc hiệu fucoidan dùng phương pháp UV-Vis 77 Bảng 3.33 Khoảng tuyến tính fucoidan sử dụng phương pháp UV-Vis 78 Bảng 3.34 Độ lặp lại quy trình định lượng fucoidan UV-Vis 79 Bảng 3.35 Độ phương pháp định lượng fucoidan UV-Vis 79 vii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Củ gừng (Zingiber officinale) Hình 1.2 Một số hợp chất có gừng Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất [6]-shogaol Hình 1.4 Cần tây (Apium graveolens L.) 10 Hình 1.5 Một số hợp chất cần tây 11 Hình 1.6 Cấu trúc hợp chất apigenin 13 Hình 1.7 Rong nâu (Sargassum mcclurei) 14 Hình 1.8 Một số hợp chất có rong nâu 15 Hình 1.9 Cấu trúc hợp chất fucoidan 17 Sử dụng dung môi chiết ban đầu ethanol gừng 39 Hình 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly cao gừng 39 Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly cao gừng 40 Hình 3.3 Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả trích ly gừng 41 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến q trình trích ly gừng 42 Hình 3.5 Quy trình chiết xuất [6]-shogaol cao gừng 43 Hình 3.6 TLC phân đoạn cao gừng so chuẩn 45 Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất phân lập từ củ gừng 46 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu gừng 47 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu gừng thị trường 47 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu sản phẩm cao gừng chiết tách 48 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu thẩm định tính tương thích hệ thống [6]-shogaol 49 Hình 3.12 SKĐ độ đặc hiệu [6]-shogaol 50 Hình 3.13 Đồ thị đường chuẩn [6]-shogaol phương pháp HPLC 51 Hình 3.14 SKĐ khoảng tuyến tính [6]-shogaol phương pháp HPLC 51 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly cao cần tây 54 Hình 3.16 Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả trích ly cao cần tây 55 Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến khả trích ly cao cần tây 56 viii Hình 3.18 Quy trình chiết xuất apigenin từ cần tây 59 Hình 3.19 TLC cao cần tây (a) apigenin (b) soi đèn UV 59 Hình 3.20 Cấu trúc hợp chất phân lập từ cần tây 61 Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu apigenin chuẩn ppm 61 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu cần tây 62 Hình 3.23 Sắc ký đồ apigenin cao cần tây thị trường 62 Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu apigenin sản phẩm chiết tách 63 Hình 3.25 Sắc ký đồ thẩm định tính tương thích hệ thống apigenin 64 Hình 3.26 Độ đặc hiệu mẫu trắng (a); apigenin chuẩn (b); mẫu thử 10 ppm (c) 65 Hình 3.27 Đồ thị đường chuẩn apigenin phương pháp HPLC-PDA 67 Hình 3.28 SKĐ đường chuẩn apigenin phương pháp HPLC 67 Hình 3.29 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly rong nâu 69 Hình 3.31 Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả trích ly rong nâu 72 Hình 3.32 Cấu trúc hợp chất phân lập từ rong nâu 73 Hình 3.33 Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu 74 Hình 3.34 Sắc ký đồ mẫu fucoidan chuẩn (a), mẫu nguyên liệu (b), mẫu sản phẩm thị trường (c), mẫu sản phẩm chiết (d) 76 Hình 3.35 Phổ đồ mẫu chuẩn mẫu thử fucoidan 50 ppm 77 Hình 3.36 Đồ thị đường chuẩn fucoidan phương pháp UV-Vis 78 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CỦ GỪNG (ZINGIBER OFFICINALE) 1.1.1 Mô tả thực vật 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Thành phần hoá học gừng 1.1.4 Hoạt tính sinh học gừng 1.1.5 Một số nghiên cứu [6]-shogaol gừng (Zingiber officinale) 1.2 CẦN TÂY (APIUM GRAVEOLENS L.) 1.2.1 Mô tả thực vật 1.2.2 Phân bố 10 1.2.3 Thành phần hóa học cần tây 10 1.2.4 Hoạt tính sinh học cần tây 11 1.2.5 Một số nghiên cứu apigenin cần tây (A.graveolens L.) 12 1.3 RONG NÂU (SARGASSUM MCCLUREI) 13 1.3.1 Mô tả thực vật 13 1.3.2 Phân loại phân bố 13 1.3.3 Thành phần hóa học rong nâu 14 1.3.4 Hoạt tính sinh học rong nâu 15 1.3.5 Một số nghiên cứu fucoidan rong nâu 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT 18 2.2 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 19 2.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.4 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.4.1 Khảo sát điều kiện chiết tách 21 2.4.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất 22 2.4.3 Phương pháp định lượng HPLC 23 2.4.4 Phương pháp định lượng UV-Vis 24 2.4.5 Thẩm định phương pháp định lượng 24 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 27 2.5 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ GỪNG 28 2.5.1 Chiết tách [6]-shogaol từ củ gừng 28 2.5.2 Định lượng [6]-shogaol phương pháp HPLC 28 2.5.3 Thẩm định quy trình phân tích [6]-shogaol từ củ gừng 29 2.6 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG CẦN TÂY 31 2.6.1 Chiết tách apigenin từ cần tây 31 2.6.2 Định lượng apigenin phương pháp HPLC-PDA 32 2.6.3 Thẩm định quy trình phân tích apigenin từ cần tây 32 2.7 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN TRONG RONG NÂU 34 2.7.1 Chiết xuất fucoidan từ rong nâu 34 2.7.2 Định lượng fucoidan phương pháp HPLC 35 2.7.3 Định lượng fucoidan phương pháp UV-Vis 35 2.7.4 Thẩm định quy trình phân tích fucoidan từ rong nâu UV-Vis 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU [6]-SHOGAOL TỪ CỦ GỪNG 39 3.1.1 Điều kiện chiết tách [6]-shogaol 39 3.1.2 Quy trình chiết xuất [6]-shogaol 42 3.1.3 Định lượng [6]-shogaol phương pháp HPLC 46 3.1.4 Thẩm định quy trình định lượng [6]-shogaol từ củ gừng 48 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU APIGENIN TỪ CẦN TÂY 53 3.2.1 Điều kiện chiết tách apigenin 53 3.2.2 Quy trình chiết xuất apigenin 56 3.2.3 Định lượng apigenin phương pháp HPLC-PDA 61 3.2.4 Thẩm định quy trình định lượng apigenin từ cần tây 63 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 69 3.3.1 Điều kiện chiết tách fucoidan từ rong nâu 69 3.3.2 Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu 72 3.3.3 Định lượng fucoidan phương pháp HPLC 75 3.3.4 Định lượng fucoidan phương pháp UV-Vis 76 3.3.5 Thẩm định quy trình định lượng fucoidan UV-Vis 76 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 4.1 KẾT LUẬN 81 4.2 KIẾN NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC 90 138 Component Name 6-shogaol Total Time Area Area % Height 2.021 190.2 0.02 158.8 2.206 6,147.2 0.57 1,420.8 2.429 10,005.8 0.93 2.966 5,822.0 Resolution Tailing Factor Plates (FoleyDorsey) Plates (Tangent) 1.296 44,566 117,482 2.93 0.786 4,628 7,395 1,660.2 2.16 0.817 11,901 8,601 0.54 829.6 2.65 0.938 5,489 1,554 4.036 1,045,295.3 96.94 114,512.7 3.94 1.085 4,270 4,424 5.110 10,222.1 0.95 485.4 4.68 0.572 14,802 8,924 8.153 150.4 0.01 205.8 25.86 1.344 2,073,144 2,943,094 8.861 489.4 0.05 159.0 0.628 369,927 1,078,322.4 100.00 Phụ lục 1.69: Độ [6]-shogaol ppm 100% lần 139 Component Time Name 6-shogaol Total Area Area % Height 2.206 4,822.7 0.44 1,281.8 2.431 6,828.4 0.63 1,202.0 2.971 5,751.4 0.53 754.9 4.041 Resolution Tailing Factor Plates (FoleyDorsey) Plates (Tangent) 0.858 6,930 8,374 2.21 0.775 15,583 8,104 3.88 0.929 3,922 4,858 1,052,866.8 96.92 114,952.2 5.16 1.083 4,271 4,375 5.161 14,687.4 1.35 426.9 4.46 0.553 11,674 6,430 8.372 172.2 0.02 223.4 23.14 1.818 1,402,142 2,761,226 8.956 501.4 0.05 253.8 6.25 1.650 234,840 46,104 9.010 539.0 0.05 236.2 0.37 3.140 144,006 85,434 9.530 173.8 0.02 181.8 7.26 2.249 1,431,174 3,598,281 1,086,342.9 100.00 Phụ lục 1.70: Độ [6]-shogaol ppm 100% lần 140 Component Time Name 6-shogaol Total Area Area % Height Resolution Tailing Factor 1,875 Plates (Tangent) 2.208 10,174.3 0.87 1,782.9 2.432 18,360.3 1.58 3,564.2 2.490 43,474.3 3.74 3,510.7 2.970 6,686.2 0.57 929.1 3.143 326.7 0.03 206.2 3.432 370.4 0.03 144.8 3.519 188.4 0.02 192.9 4.039 1,068,383.5 91.80 115,351.3 3.81 1.082 4,217 4,308 5.142 15,869.5 812.0 0.634 9,571 6,556 1.36 1.167 Plates (Foley-Dorsey) 5,465 2,832 1.24 2.898 24,172 49,868 264,970 4.41 1,163,833.5 100.00 Phụ lục 1.71: Độ [6]-shogaol ppm 100% lần 141 Component Time Name 6-shogaol Total Area Area % Height 0.722 1,328.7 0.10 159.2 2.208 9,507.1 0.74 1,683.3 2.440 8,916.2 0.70 2.987 5,382.7 0.42 4.047 5.190 Resolution Tailing Factor Plates (FoleyDorsey) Plates (Tangent) 0.532 288 28 4.47 1.259 1,813 5,524 1,446.2 2.02 0.784 11,450 7,669 777.6 3.59 0.734 5,933 3,833 1,237,863.9 96.69 133,755.7 4.82 1.080 4,233 4,308 17,205.7 453.2 0.550 9,976 5,199 1.34 4.28 1,280,204.2 100.00 Phụ lục 1.72: Độ [6]-shogaol ppm 120% lần 142 Component Name 6-shogaol Total Time Area Area % Height 2.200 11,707.3 0.92 1,790.6 2.423 8,306.3 0.66 1,615.6 2.939 535.6 0.04 185.0 4.036 5.252 Resolution Tailing Plates Plates Factor (Foley-Dorsey) (Tangent) 1.032 1,570 3,448 1.79 0.823 12,713 9,647 5.21 0.657 50,098 13,958 1,215,788.8 95.91 132,717.4 6.39 1.073 4,316 4,381 31,254.4 783.0 0.609 4,467 2,243 2.47 3.54 1,267,592.4 100.00 Phụ lục 1.73: Độ [6]-shogaol ppm 120% lần 143 Component Name 6-shogaol Total Time Area Area % Height 2.205 11,742.0 0.89 1,733.3 2.434 16,989.2 1.28 3,496.8 2.510 44,881.6 3.39 3,650.6 2.966 6,519.5 0.49 883.1 4.040 1,224,978.6 92.61 5.190 17,493.0 8.674 141.0 Resolution Tailing Factor Plates (Foley-Dorsey) Plates (Tangent) 1,379 4,131 0.989 3,734 1,718 132,781.3 4.05 1.073 4,288 4,381 1.32 407.7 4.24 0.563 7,867 4,821 0.01 179.9 21.79 1.233 2,028,834 2,798,882 1,322,744.9 100.00 Phụ lục 1.74: Độ [6]-shogaol ppm 120% lần 144 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN BẰNG UV-VIS Tính tương thích hệ thống Phụ lục 1.75: Tính tương thích hệ thống fucoidan Độ đặc hiệu 145 146 Phụ lục 1.76: Độ đặc hiệu fucoidan mẫu chuẩn mẫu thử 147 Độ lặp lại 148 149 Phụ lục 1.77: Bước sóng thẩm định độ lặp lại mẫu fucoidan 150 Phụ lục 1.78: Số liệu thẩm định độ lặp lại fucoidan 151 Khoảng tuyến tính Phụ lục 1.84: Đồ thị khoảng tuyến tính fucoidan nồng độ 2,4,5,6,8,10,15 ppm 152 Độ Phụ lục 1.85: Độ fucoidan phương pháp UV-Vis