Luận án Tiến sĩ Khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cây dứa (Ananas comosus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ THU HẬU KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ THU HẬU MÃ SỐ NCS: 0917003 KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS.TS TRẦN NHÂN DŨNG PGS.TS HUỲNH VĂN BÁ NĂM 2022 Luận án Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ em nhận hướng dẫn, động viên, giúp đỡ thầy cơ, gia đình, bạn bè vật chất lẫn tinh thần Em xin gửi lời cảm ơn ghi nhận hỗ trợ, lời động viên vơ q báu để em có thành ngày hôm Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tất thầy, cô ngồi Viện tận tình truyền đạt giúp đỡ em chun mơn khó khăn khác suốt trình theo học Nghiên cứu sinh Trường Đại học Cần Thơ Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Trần Nhân Dũng, PGS TS Huỳnh Văn Bá, PGS TS Nguyễn Minh Chơn TS Nguyễn Đức Độ người thầy truyền đạt cho em nhiều kiến thức thực tế nghiên cứu Khoa học đồng thời thầy giúp đỡ em tháo gỡ khó khăn suốt trình nghiên cứu Luận án Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Kiên Giang, quý thầy cô giáo, bạn đồng nghiệp tạo điều kiện tốt thời gian, tinh thần giúp em hoàn thành Luận án Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ em Con cảm ơn bố mẹ bên con, che chở, động viên mệt mỏi gục ngã Con nhớ câu nói bố: “Thời bố mẹ khổ khơng có điều kiện học, có điều kiện phải cố gắng…” Cảm ơn gia đình ln tin tưởng ủng hộ đường mà lựa chọn Một lần xin chân thành cảm ơn xin chúc tất người mà yêu thương luôn vui vẻ, hạnh phúc thành công Kiên Giang, ngày 02 tháng 04 năm 2022 Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Dứa loại ăn có giá trị dinh dưỡng cao thuộc họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Paraguay trồng phổ biến nhiều vùng sinh thái khác Việt Nam Mục tiêu luận án khảo sát khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao chiết từ phận dứa (lá, thân, thịt vỏ quả) Hòn Đất Tắc Cậu thuộc tỉnh Kiên Giang Luận án sử dụng phương pháp định danh loài phương pháp phân tích đặc điểm hình thái đồng thời có kiểm định lại phương pháp giải trình tự, trích ly cao phương pháp ngâm dầm kết hợp với đánh sóng siêu âm, khảo sát khả kháng oxy hóa in vitro mẫu cao chiết thực thông qua ba phương pháp gồm: phương pháp trung hòa gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); phương pháp khử ion Fe3+ phương pháp khử ion Cu2+, phương pháp khảo sát ức chế hoạt động enzyme tyrosinase in vitro, phương pháp sắc ký cột silica gel để tách cao phân đoạn vỏ dứa Tắc Cậu Sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào động vật, khảo sát ức chế hình thành melanin dịng tế bào hắc tố B16F10 phân tích phổ GC-MS cao phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa ức chế tyrosinase mạnh Kết nghiên cứu cho thấy, vùng sinh thái Tắc Cậu, Kiên Giang dung mơi methanol thích hợp phục vụ nghiên cứu luận án Dựa vào đặc điểm hình thái trình tự gen ITS cho thấy dứa thuộc chi Ananas với tên khoa học (Ananas comosus (L.) Merr.) Kết định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol tổng cao mẫu chiết xuất methanol hàm lượng flavonoid tổng cao mẫu methanol vỏ dứa Kết kháng oxy hóa từ ba phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa khác cho thấy kết khơng giống Khả trung hịa DPPH cao chiết methanol mạnh so với mẫu cịn lại, cao chiết lámethanol có giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) là: 31,27 ± 3,91µg/mL, hoạt tính khử ion Fe3+, khử ion Cu2+ mạnh chiết xuất vỏ-methanol với số IC50 là: 97,72 ± 0,42; 220,95 ± 8,2 Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro cho thấy, chiết xuất vỏ-methanol có hoạt tính mạnh so với chiết xuất thơ cịn lại nên chọn để trích ly cao phân đoạn Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao phân đoạn thu cho thấy F1 có hoạt tính cao Hoạt tính kháng oxy hóa F1 qua hoạt tính khử DPPH, Cu2+ với giá trị IC50 là: 14,52 ± 0,44; 18,78 ± 2,55 µg/mL hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro với giá trị IC50 là: 84,98 ± 5,06 µg/mL đồng thời in vivo (trên dịng tế bào sắc tố B16F10) nồng độ 25 µg/mL ức chế sản sinh melanin 50,79% Kết phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) F1 có diện succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, 2-ethylhexyl benzoatelà hợp chất có khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase mạnh Kết nghiên cứu cho thấy vỏ dứa nguồn giàu hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng oxy hóa ức chế tyrosinase Từ khóa: Dứa, GC-MS, kháng oxy hóa, Tắc Cậu, tyrosinase Chun ngành Cơng nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT Pineapple is a fruit with high nutritional value belonging to the Bromeliaceae family originating from Paraguay and cultivated grown in many different ecological regions in Vietnam The purpose of the thesis is Investigation of antioxidant and tyrosinase inhibitory ability of extracts from parts of Pineapple tree (leaves, stems, flesh and peel) in Hon Dat and Tac Cau in Kien Giang province The thesis uses the method of species identification by morphological characterization at the same time with re-verification by sequencing method, extraction by soaking method combined with ultrasonic wave, investigation of the in vitro antioxidant capacity of the extracts was carried out through three methods including: method to neutralize free radicals DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl); Fe3+ deionization activity method; Cu2+ deionization activity method; method to investigate the inhibition of tyrosinase enzyme activity in vitro, silica gel column chromatography method to separate high fractions of Tac Cau pineapple peel Next, using the cell culture method and investigating the inhibition of melanin formation on the melanoma cell line B16F10 and the GC-MS spectral analysis method of the high fraction with strong antioxidant activity and strong tyrosinase inhibitor Research results show that, Tac Cau, Kien Giang eco-regions and methanol solvent are suitable for the research of the thesis Based on the morphological characteristics and ITS gene proved that Pineapple is Ananas genus with the scientific name (Ananas comosus (L.) Merr) The quantitative results showed that, the highest total polyphenol content in the high leaf methanol sample was also the highest total flavonoid content in the pineapple peel methanol sample Antioxidant results from three different antioxidant activity assays showed dissimilar results The ability to neutralize DPPH of leaf methanol extract was strongest compared to other samples, leaf-methanol extract had IC50 value (50% inhibitory concentration) was: 31.27 ± 3.91 µg/mL, the most powerful Fe3+ deionization activity, the strongest Cu2+ deionization activity is methanol-peel with IC50 value of 97.72 ± 0.42 respectively; 220.95 ± 8.2 Investigating the inhibitory activity of tyrosinase in vitro showed that the shell-methanol extract has the strongest activity compared to the remaining crude extracts, so it is recommended to prepare the fractionation by silica gel column chromatography Investigation of antioxidant and tyrosinase inhibitory activities of the obtained fractions showed that had the highest activity among the fractions Antioxidant activity of F1 through reducing activity of DPPH, Cu2+ with IC50 value is 14.52 ± 0.44 respectively; 18.78 ± 2.55 µg / mL and in vitro tyrosinase inhibitory activity with an IC50 value of: 84.98 ± 5.06 µg/mL simultaneously in vivo (on a B16F10 pigment cell line) at concentration 25 µg/mL inhibited melanin production by 50.79% Results of gas chromatographic analysis of mass spectrometry (GC-MS) of F1 in the presence of Succinic acid, Ferulic acid, p-coumaric acid, Cinnamic acid, Benzoic acid, 2-ethylhexyl are compounds with resistance oxidizes and inhibits tyrosinase strongly The results of the study showed that peel Pineapple is a rich source of secondary compounds with antioxidant and tyrosinase inhibitory activity Keyword: Ananas comosus, antioxidant, GC-MS, Tac Cau, tyrosinase Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT .ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH xi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu luận án 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.4.1 Đối tượng nghiên cứu .3 1.4.2 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa nghiên cứu 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.6 Tính luận án CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan dứa (Ananas comosus) 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân Loại 2.1.3 Đặc điểm sinh học dứa 2.1.4 Phân bố .7 2.1.5 Công dụng Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Các nghiên cứu nước 2.2.1 Những nghiên cứu nước 2.2.2 Những nghiên cứu nước 14 2.3 Tổng quan hợp chất thứ cấp thực vật 16 2.3.1 Nhóm polyphenol 19 2.3.2 Terpene dẫn xuất terpene 22 2.3.3 Saponin 23 2.3.4 Nhóm alkaloid 23 2.4 Tổng quan kháng oxy hóa, chất kháng oxy hóa chế 24 2.4.1 Khái qt q trình oxy hóa tế bào 24 2.4.2 Khái quát gốc tự 25 2.4.3 Tác hại gốc tự thể .26 2.4.4 Chất kháng oxy hóa 26 2.4.5 Cơ chế hoạt động chất kháng oxy hóa tự nhiên .27 2.5 Tổng quan tyrosinase, chế hoạt động chất ức chế tyrosinase 33 2.5.1 Tổng quan enzyme tyrosinase 33 2.5.2 Cơ chế hoạt động tyrosinase 36 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động tyrosinase .37 2.5.4 Các chất ức chế Tyrosinase 38 2.5.5 Cơ chế ức chế enzyme tyrosinase 39 2.5.6 Tiềm sử dụng chất ức chế tyrosinase 40 2.6 Tổng quan melanocyte, chế hoạt động chất ức chế 41 2.6.1 Tế bào hắc tố 41 2.6.2 Cơ chế hoạt động melanocyte 42 2.7 Tổng quan phương pháp định danh thực vật 45 2.7.1 Nhận diện định danh thực vật đặc điểm hình thái 45 2.7.2 Nhận diện định danh thực vật di truyền phân tử .45 2.8 Phương pháp chiết xuất phân tách hợp chất từ thực vật 46 2.8.1 Phương pháp chiết xuất rắn-lỏng 46 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ 2.8.2 Phương pháp chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm 46 2.8.3 Phương pháp sắc ký cột silica gel 47 2.9 Tổng quan phương pháp định lượng, kháng oxy hóa, ức chế enzyme tyrosinase (in vitro), phân tich khối phổ GC-MS 48 2.9.1 Các phương pháp định lượng hợp chất thứ cấp thực vật 48 2.9.2 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa .49 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 3.1 Phương tiện nghiên cứu 53 3.1.1 Thời gian địa điểm .53 3.1.2 Nguyên vật liệu .53 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 53 3.1.4 Hóa chất 54 3.2 Phương pháp nghiên cứu 54 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu dung mơi trích ly cao chiết 54 3.2.2 Nội dung 2: Đánh giá khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao methanol dứa Tắc Cậu .63 3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao phân đoạn dứa 71 3.2.4 Nội dung 4: Khảo sát khả ức chế sản sinh melanin dòng tế bào hắc tố B16F10 cao phân đoạn F1 78 3.2.5 Nội dung 5: Phân tích phổ GC-MS cao phân đoạn F1 vỏ dứa 79 3.3 Phương pháp xử lý số liệu 80 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 81 4.1 Kết khảo sát chọn nguồn nguyên liệu 81 4.1.1 Kết kháng oxy hóa cao chiết ethanol dứa hai vùng sinh thái Hòn Đất Tắc Cậu 81 4.1.2 Kết kháng oxy hóa cao chiết ethanol/methanol dứa vùng Tắc Cậu, Kiên Giang 86 4.1.3 Kết giải trình tự gen dứa Tắc Cậu .91 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ 4.2 Kết khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao methanol dứa Tắc Cậu 93 4.2.1 Kết định lượng polyphenol tổng flavonoid cao methanol dứa 93 4.2.2 Kết kháng oxy hóa cao methanol dứa Tắc Cậu .97 4.2.3 Mối quan hệ hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng với khả kháng oxy hóa dứa Tắc Cậu 100 4.2.4 Kết ức chế tyrosinase cao methanol dứa vùng Tắc Cậu 100 4.3 Kết kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao phân đoạn vỏ dứa 103 4.3.1 Kết sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol vỏ dứa 103 4.3.2 Kết định lượng polyphenol tổng flavonoid tổng cao phân đoạn vỏ dứa 105 4.3.3 Kết kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao phân đoạn vỏ dứa .106 4.3.4 Mối quan hệ hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng với khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase cao phân đoạn vỏ dứa 110 4.4 Kết ức chế sản sinh melanin dòng tế bào sắc tố B16F10 cao phân đoạn F1 vỏ dứa 111 4.5 Kết phân tích phổ khối GC-MS mẫu cao phân đoạn F1 vỏ dứa 114 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 118 5.1 Kết luận 118 5.2 Đề nghị 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 131 PHỤ LỤC A PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỬ TẾ BÀO B16F10 PHỤ LỤC C: XỬ LÝ THỐNG KÊ PHỤ LỤC D: GIẢI GC-MS Chuyên ngành Công nghệ sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC D: GIẢI GC-MS Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc