TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NG HIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH ĐẠI CƯƠNG GVHD Đỗ Thị Hoàng Tuyến Nhóm 6 Ngô Gia Hạo 2022221204 ( Bài 1 2 ) Lớp Tiết 7[.]
TRƯỜNG ĐẠI HIỆP THỰC THÀNH PHỐ KHOA SINH TRƯỜNG HỌC CƠNG NGPHẨM HỒ CHÍ MINH HỌC & MƠI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH ĐẠI CƯƠNG GVHD: Đỗ Thị Hồng Tuyến Nhóm 6: Ngơ Gia Hạo - 2022221204 ( Bài - ) Lớp: Tiết 7-11 thứ TP Hồ Chí Minh, 2023 BÀI 1: GIỚI THIỆU THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT 1.4 Yêu cầu viết báo cáo Trình bày quy tắc an tồn PTN vi sinh vật - Khi làm việc phòng thí nghiệm vi sinh vật học phải tuyệt đối giữ vệ sinh, tơn trọng tính ngăn nắp trật tự phịng thí nghiệm - Mỗi cá nhân nhóm làm việc độc lập, sử dụng dụng cụ, trang thiết bị nhóm, thiếu phải hỏi cán phụ trách giáo viên phụ trách không tự ý sử dụng người khác - Khơng ăn uống, hút thuốc phịng thí nhiệm VSV - Mặc áo blouse thời gian thực hành - Không dùng miệng hút ống hút (pipette) để định lượng VSV hay hóa chất, mà phải dùng bóp cao su thao tác hút ống hút - Hộp Petri đổ môi trường sau nuôi cấy VSV, không mở nắp, dùng tay để sờ dùng mũi để ngửi - Khi lỡ tay làm đổ VSV nơi làm việc, dùng khăn hay giấy tẩm cồn 70º để lau lau lại khăn hay giấy tẩm cồn 70º khác - Khi sử dụng que cấy để gieo cấy VSV cần phải khử trùng cách đốt lửa đèn cồn tránh vương vãi xung quanh - Trước sau thao tác VSV cần lau tay kỹ cồn 70º Khi thực phiện thao tác cần phải tránh xa lửa đèn cồn tay ướt - Cần ghi tên chủng VSV ngày tháng thí nghiệm lên dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy VSV - Tất chất thải môi trường chứa nhiễm VSV cần hấp khử trùng trước đem đổ vào thùng rác Các dụng cụ nhiễm VSV cần ngâm dung dịch sát khuẩn trước rửa - Không đổ thạch vào bồn rửa ống thoát nước - Sau làm việc xong, phải vệ sinh nơi làm việc mình, vệ sinh dụng cụ máy móc, dụng cụ thí nghiệm Rửa tay sát trùng cốn trước khỏi phòng Mơ tả sơ quy trình chỉnh KHV quang học - Bước Đặt tiêu lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ giọt dầu soi chìm phiến kính soi vật kính x100 - Bước Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp - Bước Điều chỉnh độ sáng nguồn ánh sáng để đảm bảo độ sáng phù hợp cho trình quan sát - Bước Điều chỉnh tụ quang: vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang đoạn giữa, vật kính x100 Điều chỉnh ống kính vật kính cho ống kính nằm vị trí vật kính nằm vị trí - Bước Sử dụng ống kính để điều chỉnh độ phóng đại hình ảnh - Bước Sử dụng vật kính để điều chỉnh độ phóng đại hình ảnh - Bước Điều chỉnh độ sáng tập trung ánh sáng vào mẫu để tăng độ tương phản hình ảnh - Bước Kiểm tra lại độ nét độ sáng hình ảnh để đảm bảo q trình quan sát xác - Lưu ý q trình chỉnh kính hiển vi quang học khác tùy thuộc vào loại kính hiển vi mẫu quan sát Vẽ kết quan sát hình thái nấm men, nấm mốc vi khuẩn Phân biệt hình thái ba nhóm vi khuẩn, nấm men nấm mốc ✤ Vi khuẩn: - Hình dạng phổ biến hình cầu hình que - Kích thước nhỏ từ 02 đến 10 micro met Đặc biệt vi khuẩn nhỏ Nanobacteria: đường kính tế bào 0,05-0,2 μ m , vi khuẩn lớn Thiomargarita namibiensis: đường kính tế bào 100-750 μ m - Khơng có hệ thống nội bào phức tạp có tế bào đơn lẻ - Khơng có hệ thống tế bào chun biệt khơng có màng nhân hệ thống lồng hệ thống bánh xe , ✤ Nấm men: - Hình dạng: hình cầu, hình trứng, hình oval, hình elip - Kích thước lớn vi khuẩn, kích thước 2,5-10 x 4,5-21 μ m - Có hệ thống nội bào phức tạp bao gồm nhiều tế bào chuyên biệt - Đơn bào có nhân ✤ Nấm mốc: - Hình dạng đa dạng tròn bầu dục trục , - Kích thước lớn nắm men từ 10 đến 100 micromet - Tế bào nấm thường bao bọc thành tế bào chitin ( đặc trưng cho nấm mốc) - Màu sắc nấm mốc xác định bào tử sinh màu xanh, vàng, đen, nâu Nêu cách vận hành nồi hấp khử tự động cơ: Cách vận hành nồi hấp tự động: - Bước Mở nắp nồi hấp ra, lấy hai giỏ inox nhỏ giỏ inox lớn - Bước Cho nước cất vào nồi hấp cho ngập ốc cảm ứng mực nước khoảng – cm (bên cạnh vịng điện trở) Sau cho giỏ inox lớn vào nồi - Bước Cho dụng cụ môi trường vào giỏ nhỏ, đưa vào nồi hấp - Bước Đóng nắp nồi hấp khóa valve exhaust - Bước Bật CP bên hông, cài đặt thông số 121 ºC, 15 phút, bấm nút ‘set’ bấm nút ‘start’ - Bước Khi nồi hấp có báo hiệu ‘tit…tit…’ lần 2, mặt hiển thị báo nhiệt độ 97 ºC có đèn báo ‘complete’ chớp chớp màu đỏ, mở nồi hấp ra, chờ phút cho bớt nóng lấy dụng cụ mơi trường Cách vận hành nồi hấp cơ: - Bước Kiểm tra mực nước khoảng an toàn - Bước Bật công tắc để gia nhiệt trước (10-15 phút) - Bước Đặt dụng cụ dụng cụ chứa môi trường vào buồng hấp - Bước4 Kiểm tra đóng valve xả valve an toàn - Bước Đậy nắp vặn ốc đối xứng đôi - Bước Khi đồng hồ áp lực 0,4 – 0,5kg/cm2 xả khí lần đồng hồ áp lực 0,1 kg/cm2 hay thấy luồng khí xả xuất dịng khí trắng liên tục đóng valve xả - Bước Chờ cho đồng hồ áp lực atm hay nhiệt độ 121ºC, tính canh 15 phút - Bước Hết giờ, mở valve xả khí từ từ, áp suất giảm mở valve lớn - Bước Khi đồng hồ áp lực kg/cm valve xả khơng cịn thấy dịng khí xả màu trắng, mở nắp nồi hấp lấy dụng cụ dụng cụ chứa môi trường nồi hấp 1.6 Câu hỏi thảo luận Nêu kỹ thuật chỉnh kính hiển vi quan sát trạng thái sống trạng thá i chết - Đặt mẫu lên bàn kính hiển vi đưa ống kính vào vị trí mẫu - Sử dụng nhìn để tìm vị trí tốt để quan sát Điều chỉnh độ lớn ống kính ống nhìn để có hình ảnh rõ nét - Sử dụng nút điều chỉnh độ sáng để điều chỉnh độ sáng hình nh Điều giúp tăng độ tương phản giảm độ chói - Nếu cần thiết sử dụng nút điều chỉnh độ sâu để điều chỉnh độ sâu hình ảnh Điều giúp tăng độ sâu hình ảnh gip quan sát tiết nhỏ - Nếu cần thiết sử dụng nút điều chỉnh độ lớn để điều chỉnh độ lớn hình ảnh Điều giúp tăng độ phóng đại hình ảnh giúp quan sát tiết nhỏ - Sau hoàn tất bước kiểm tra lại hình ảnh để đảm bảo rõ nét đủ sáng để quan sát Nếu cần thiết tiến hành điều chỉnh lại thơng số để có hình ảnh tốt Sau quan sát hình thả i cúa VSV, em nêu khác biệt hình dạng vi khuẩn, nắm men nấm mốc? ✤ Vi khuẩn: - Hình dạng đơn giản thường trịn trục xoắn - Kích thước nhỏ từ 02 đến 10 micromet - Khơng có hệ thống nội bào phức tạp có tế bào đơn lẻ ✤ Nấm men: - Hình dạng trịn bầu dục - Kích thước lớn vi khuẩn từ đến 50 micromet - Có hệ thống nội bào phức tạp bao gồm nhiều tế bào chuyên biệt ✤ Nấm mốc: - Hình dạng đa dạng trịn bầu dục trục , - Kích thước lớn nắm men từ 10 đến 100 micromet - Có hệ thống nội bào phức tạp bao gồm nhiều tế bào chuyên biệt Sự khác biệt cách sử dụng nồi hấp tự động nôi hấp cơ? Nồi hấp tự động nồi hấp hai loại nồi hấp sử dụng để nấu ăn chế biến thực phẩm Tuy nhiên có khác biệt hai loại nồi hấp này: - Cách hoạt động: Nồi hấp tự động điều khiển máy tính tự động điều chỉnh nhiệt độ áp suất thời gian nấu Trong nồi hấp điều khiển tay yêu cầu người sử dụng phải tự điều chỉnh nhiệt độ áp suất thời gian nấu - Độ xác: Nồi hấp tự động có độ xác cao so với nồi hấp điều chỉnh nhiệt độ áp suất cách xác Điều giúp cho thực phẩm nấu chín giữ hương vị tốt - Tiện lợi: Nồi hấp tự động có tính tự động giú tiết kiệm thời gian công sức người sử dụng Trong nồi hấp yêu cầu người sử dụng phải thường xuyên kiểm tra điều chỉnh nhiệt độ áp suất thời gian nấu - Giá cả: Nồi hấp tự động thường có giá cao so với nồi hấp tính tự động độ xác cao - Tóm lại nồi hấp tự động nồi hấp có ưu điểm nhược điểm riêng Người sử dụng cần phải cân nhắc lựa chọn loại nồi hấp phù hợp với nhu cầu điều kiện sử dụng BÀI KỸ THUẬT PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG 2.4 Yêu cầu viết báo cáo Nêu vắn tắt sở lý thuyết việc pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV - Chuẩn bị môi trường lỏng + Cân thành phần môi trường + Hịa tan thành phần mơi trường lượng nước nhỏ Sau trộn lẫn tất tất thành phần dinh dưỡng với thêm nước cho đủ thể tích xác định + Kiểm tra pH môi trường pH kế chỉnh pH dung dịch HCl NaOH Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa, đóng nút bơng (bơng khơng thấm nước), bịt nắp giấy hay vặn nắp ống nghiệm có nắp + Hấp tiệt trùng (121 °C, 15 phút) nồi hấp làm nguội nhiệt độ phòng, gieo cấy VSV đem bảo quản tủ lạnh (~ 4°C) - Chuẩn bị môi trường rắn bán rắn + Đối với mơi trường có chứa chất làm đặc : agar, gelatin cần phải nấu chảy agar 1/2 thể tích nước dùng để pha môi trường + Cân khuấy tan thành phần khác mơi trường '% lượng nước cịn lại + Khi agar tan chảy hoàn toàn, trộn lẫn dung dịch chất dinh dưỡng với dung dịch có chứa agar với nhau, khuấy + Phân phối môi trường nóng chảy vào dụng cụ chứa + Các bước tương tự môi trường lỏng - Khử trùng dụng cụ mơi trường VSV bị tiêu diệt tác nhân : nhiệt độ, tia xạ, lọc hóa chất Đối PTN vi sinh thường người ta khử trùng dụng cụ môi trường nhiệt, số trường hợp mơi trường có thành phần dễ bị phân huỷ nhiệt độ người ta dùng phương pháp lọc Khử trùng nhiệt khô : + Các dụng cụ thuỷ tinh khử trùng cách sấy 170 – 180 °C Các dụng cụ khử trùng dạng cần gói giấy trước cho vào tủ sấy + Đốt cháy: Các que cấy khử trùng cách đốt lửa đèn cồn Khử trùng nhiệt ẩm : + Phương pháp Pasteur : Đun 63 °C 30 phút 72 °C 15 phút làm lạnh nhanh, tiêu diệt VSV gây bệnh hay VSV hoại sinh thực phẩm + Đun sơi nước: Đun 100 °C tiêu diệt tế bào sinh dưỡng VSV Sử dụng khử trùng nhanh dụng cụ kim tiêm, kéo, kẹp, dao, cốc Trình bày dụng cụ, hóa chất thiết bị cần thiết DỤNG CỤ HÓA CHẤT THIẾT BỊ Ống nghiệm DRBC Nồi hất Hộp petri Cao thịt Cân điện tử Bình tam giác Pepton Tủ ấm Ống hút 1ml Agar Tủ sấy Ống hút 10ml NaCl Tủ lạnh Cốc thủy tinh 100ml HCl Bể điều nhiệt Cốc thủy tinh 250ml Nước cất Giá để ống nghiệm Bông không thấm nước Đũa thủy tinh Bông thấm nước Quả bóp cao su Cồn 90o Giấy báo Thun buộc Hộp quẹt Nêu bước tiến hành pha chế môi trường dinh dưỡng bả n, hấp khử trùng đổ môi trường vào đĩa Petri · Pha chế môi trường - Pha chế môi trường Cao thịt – pepton Bước Cân agar cho vào thể tích nước định sẵn cho nhóm Sau đó, nấu sơi bắp điện (có miếng amiante) cho agar nở hết Bước Cân thành phần cao thịt, pepton NaCl môi trường theo công thức cho trước Sau đó, hịa tan chúng vào % thể tích nước cịn lại Bước Đổ thể tích dịch chứa cao thịt, pepton NaCl vào % thể tích dịch agar sôi, khuấy tắt bếp Bước Phân phối vào dụng cụ chứa, làm nút không thấm nước, bịt nắp giấy, dán nhãn có tên nhóm tên môi trường, đem hấp tiệt trùng - Pha chế môi trường Czapek – Dox: Bước Cân agar cho vào % thể tích nước định sẵn cho nhóm Sau đó, nấu sơi bếp điện (có miếng amiante) cho agar nở hết Bước Cân thành phần khống có khả gây tủa (K-HPO4) với muối khoáng khác để riêng Bước Cân muối khống cịn lại mơi trường theo cơng thức cho trước Sau đó, hịa tan chúng vào thể tích nước cịn lại Bước Đồ % thể tích dịch chứa thành phần muối khống vào '% thể tích dịch agar sôi, khuấy tắt bếp Bước Khi nhiệt độ môi trường hạ xuống 50 °C, cho K2HPO4 vào hỗn hợp bước khuấy Bước Phân phối vào dụng cụ chứa, làm nút không thấm nước, bịt nắp giấy dán nhãn tên nhóm tên mơi trường, đem hấp tiệt trùng - Pha chế môi trường MRS Đối với môi trường đông khô thương phẩm, ta cần cân bột mơi trường (theo hướng dẫn ngồi bao bì) thêm nước, khuấy tan nấu cho tan chảy lò viba trước chia cho tổ Trường hợp tổ tự pha, không cần phải nấu tan chảy, mà cần khuấy cho tan (agar không tan), làm nút bơng, bao gói hấp khử trùng - Pha chế môi trường Gause 1: Cách thức pha chế tương tự môi trường Czapek – Dox - Hấp khử trùng môi trường Môi trường để hấp tiệt trùng: Các bình tam giác ống nghiệm chứa mơi trường cao thit-pepton, Czapek-Dox Dụng cụ để hấp tiệt trùng: Đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy vòng, que trang, khăn trắng Tất bao giấy trước cho vào nồi hấp - Đổ đĩa Bước Đĩa Petri sau hấp tiệt trùng phải sấy khô Bước Tắt quạt, lau khu vực làm việc, lau tay cồn 70°C mặt bàn khô cồn đốt đèn cồn Bước Chờ cho môi trường nguội đến 45 –55°C, dùng khăn trắng hấp tiệt trùng cầm bình tam giác đổ mơi trường vào đĩa Petri với độ dày – mm tính từ đáy lên khơng gian vơ trùng gần lửa đèn cồn Trong trình đổ đĩa, sinh viên khơng nói chuyện làm động tác mạnh gây xáo trộn khơng khí Bước Đặt đĩa Petri mặt phẳng ngang, chờ cho đông thạch, gói lại bảo quản Chú ý : Bình thưởng phải làm thao tác tủ cấy vô trùng 2.4.4 Ý nghĩa việc bao gói hấp khử trùng dụng cụ mơi trường ni cấy VSV Việc bao gói hấp khử trùng dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật bước quan trọng trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật Các bước có ý nghĩa vơ quan trọng: - Bảo vệ sức khỏe: Việc bao gói hấp khử trùng giúp ngăn chặn lây lan vi sinh vật gây bệnh giảm nguy lây nhiễm cho người sử dụng người tiếp xúc - Đảm bảo chất lượng: Việc bao gói hấp khử trùng giúp đảm bảo tinh khiết môi trường nuôi cấy vi sinh vật giảm thiểu ô nhiễm đảm bảo chất lượng kếtả thí nghiệm - Tiết kiệm thời gian chi phí: Việc bao gói hấp khử trùng giúp tiết kiệm thời gian chi phí q trình chuẩn bị mơi trường ni cấy vi sinh vật đồng thời giảm thiểu lãng phí tăng hiệu công việc - Dễ dàng sử dụng: Việc bao gói hấp khử trùng giúp dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ dàng sử dụng bảo quản đồng thời giảm thiểu hư hỏng mát trình sử dụng Nhận xét thảo luận nguyên nhân bị nhiễm VSV trình đổ đĩa Các nguyên nhân bị nhiễm vi sinh vật q trình đổ đĩa: - Vệ sinh dụng cụ khơng không khử trùng cách - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật không chuẩn bị cách không bảo quản cách - Vi sinh vật lấy từ mẫu thử không chuẩn bị xử lý cách - Người làm thí nghiệm khơng tn thủ thao tác quy trình vệ sinh tiến hành thí nghiệm làm thí nghiệm - Q trình đổ đĩa không thực theo hướng dẫn đổ mơi trường khơng tắt quạt, điện, khơng đóng cửa, nói chuyện phịng thí nghiệm,… 2.6 Câu hỏi thảo luận: 1: Trong kỹ thuật nuôi cấy VSV, lồi nhóm VSV khác nhau, cần phải pha chế loại chất khác hàm lượng khác nhau? - Các lồi nhóm VSV khác có yêu cầu chất dinh dưỡng điều kiện ni cấy khác Do đó, pha chế chất dinh dưỡng hàm lượng khác cần thiết để đáp ứng yêu cầu đặc biệt loại VSV Chất dinh dưỡng cần phải cân cung cấp đầy đủ để đảm bảo tăng trưởng sinh sản hiệu VSV Nếu cân đắn đầy đủ chất dinh dưỡng, ảnh hưởng đến tăng trưởng sinh sản VSV chí gây tử vong cho chúng 2: Khi pha chế môi trường Czapek-Dox, phải cân riêng thành phần K2HPO4 cho vào sau trộn chung thể tích hỗn hợp chất hịa? - Cần phải cân riêng thành phần K2HPO4 để hạn chế tượng kết tủa K2HPO4 Agar Khi môi trường kết tủa tác động đến khả hấp thụ nguồn dinh dưỡng vi sinh vật Vì để tránh tình trạng K2HPO4 cân riêng cho vào sau trộn chung 1/2 thể tích agar nóng chảy 1/2 thể tích hỗn hợp chất hịa tan khác Việc giúp đảm bảo mơi trường Czapek-Dox có độ nhớt độ dày phù hợp để nuôi cấy vi sinh vật 3: Hãy cho biết môi trường thạch đĩa cần phải úp ngược sau làm nguội ? - Kiểm tra chất lượng thạch đổ - Không để nước đọng nắp rớt xuống làm hỏng khuẩn lạc nuôi cấy - Hạn chế phần tạp nhiễm thời gian nuôi cấy phần đáy nặng có xu hướng úp từ xuống nên đậy kín đĩa thạch - Dễ dàng cầm nắm, vận chuyển đĩa thạch mà không bi rơi nắp bất ngờ làm ngoại nhiễm - Nếu không úp ngược đĩa Petri sau làm nguội mơi trường thạch đĩa bị biến dạng bị nứt co rút gel