Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ hàu crassostrea gigas thủy phân bằng protease

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ hàu (crassostrea gigas) thủy phân protease NGUYỄN VĂN KHƠI Ngành Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Quản Lê Hà Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2023 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ hàu (Crassostrea gigas) thủy phân Protease NGUYỄN VĂN KHƠI Ngành Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Quản Lê Hà Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2023 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Nguyễn Văn Khôi Đề tài luận văn: Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ hàu (crassostrea gigas) thủy phân protease Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: 20211166M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 19/04/2023 với nội dung sau: - Sắp xếp lại bố cục luận văn, trình bày đọng phần tổng quan - Phương pháp nghiên cứu cần có trích dẫn rõ ràng, so sánh kết nghiên cứu với nghiên cứu trước bình luận - Chỉnh sửa xếp lại tài liệu tham khảo theo quy cách - Chỉnh sửa lỗi tả, in ấn Hà Nội, ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm 2023 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học, Đại Học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện cho tơi q trình học tập Xin gửi lời tri ân tới Quý Thầy/Cô tận tình giảng dạy lớp cao học CH2021A, chuyên ngành Công nghệ sinh học Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Quản Lê Hà, người tận tình giúp đỡ, bảo tơi suốt trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới tất bạn bè, đồng nghiệp gia đình người ln ủng hộ, động viên tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng Tác giả Nguyễn Văn Khơi năm 2023 Tóm tắt nội dung luận văn Dịch hàu thủy phân có chứa axit amin peptide, thành phần cấu tạo chúng phụ thuộc vào điều kiện thủy phân loại enzyme xúc tác Trong nghiên cứu này, mục đích hướng tới tối ưu hóa điều kiện thủy phân thịt hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) với yếu tố ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian thủy phân, tỉ lệ enzyme/cơ chất để thu nhận peptide có hoạt tính sinh học Đối tượng nghiên cứu Hàu Thái Bình Dương enzyme Alcalase, phạm vi nghiên cứu quy mơ phịng thí nghiệm Các nội dung nghiên cứu chính: - Khảo sát đánh giá xử lý ngun liệu, xây dựng mơ hình thí nghiệm khảo sát điều kiện tối ưu thủy phân thịt hàu Alcalase - Đánh giá hiệu việc làm chín thịt hàu khả thủy phân chống oxy hóa dịch thủy phân - Tối ưu điều kiện thu nhận dịch thủy phân có khả chống oxy hóa cao - Khảo sát khả ức chế enzyme chuyển Angiotensin điều kiện tối ưu thu Kết nghiên cứu đưa điều kiện tối ưu cho việc thủy phân hàu thu dịch thủy phân chứa peptide chức năng, có khả chống oxy hóa Đồng thời tìm mối liên hệ hoạt tính sinh học dịch thủy phân mức độ thủy phân dịch Trong tương lai hướng tới tinh sạch, giải trình tự peptide dịch thủy phân với hoạt tính chống oxy hóa cao Đồng thời tối ưu để thu dịch thuỷ phân có khả ức chế enzyme ACE tốt HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên Mục Lục DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hàu 1.1.1 Nguyên liệu hàu 1.1.2 Tình hình ni hàu Việt Nam 1.2 Peptide chức 1.2.1 Định nghĩa peptide peptide chức 1.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa peptide chức 1.2.3 Hoạt tính ức chế enzyme ACE 1.3 Nghiên cứu thuỷ phân tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học 11 1.3.1 Khái quát trình thủy phân 11 1.3.2 Lựa chọn enyme thuỷ phân 12 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein hàu 13 1.3.4 Một số cơng trình nghiên cứu thu nhận peptide có hóa tính sinh học từ hàu thủy phân kết thu 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Thiết bị 19 2.1.3 Hóa chất 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm hàm lượng protein hàu 20 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ Protease 21 2.2.3 Phương pháp thuỷ phân 25 2.2.4 Chuẩn bị dịch thuỷ phân 28 2.2.5 Phương pháp đánh giá mức độ thuỷ phân DH (Degree of hydrolysis) 29 2.2.6 Phương pháp đánh giá khả chống oxy hoá 31 ii 2.2.7 Khả ức chế ACE 32 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Độ ẩm hàm lượng protein thịt hàu 34 3.2 Xử lý nguyên liệu đầu vào 34 3.3 Tối ưu điều kiện thuỷ phân để đạt hiệu chống oxy hoá cao 35 3.4 Khảo sát khả ức chế enzyme ACE 43 KẾT LUẬN 46 3.5 Kết luận 46 3.6 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 51 Phụ lục 1: Đường chuẩn vitamin C 51 Phụ lục 2: Giá trị OD mẫu thí nghiệm ức chế enzyme ACE 52 Phụ lục 3: Hình minh họa dịch trước sau thủy phân 52 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng hàu Thái Bình Dương với màu vỏ khác (C.gigas) tính % trọng lượng khô Bảng 1.2 : thành phần axit amin protein C gigas Bảng 2.1: Thành phần mẫu thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme 22 Bảng 2.2: Nồng độ tyrosine pha xây dựng đường chuẩn 23 Bảng 2.3: Giá trị OD tương ứng nồng độ Tyrosine 24 Bảng 2.4: Kết xác định hoạt độ enzyme 25 Bảng 2.5: Các phản ứng điều kiện cần thực thu từ Design Expert 11 sử dụng phương pháp Box-behnken 26 Bảng 2.6: Thông tin khảo sát cân pH thịt hàu 27 Bảng 2.7 : Thí nghiệm đánh giá việc xử lý thịt hàu trước thuỷ phân 28 Bảng 2.8: Thành phần thí nghiệm xác định hàm lượng axit amin 29 Bảng 2.9: Giá trị OD tương ứng nồng độ axit glutamic 30 Bảng 2.10: Thành phần phản ứng đánh giá khả ức chế enzyme ACE 33 Bảng 3.1: So sánh độ ẩm hàm lượng protein nguyên liệu hàu với nghiên cứu trước 34 Bảng 3.2: Các phản ứng điều kiện khảo sát để khảo sát xử lý nguyên liệu đầu vào 35 Bảng 3.3: Hiệu thuỷ phân DH khả loại bỏ gốc DPPH dịch thuỷ phân hàu qua 15 thí nghiệm theo mơ hình xây dựng Design Expert 11 36 Bảng 3.4: Tính phù hợp đề xuất khảo sát 37 Bảng 3.5: So sánh kết với nghiên cứu công bố 42 Bảng 3.6: Các điều kiện khảo sát khả ức chế enzyme ACE 44 Bảng 3.7: Mối liên hệ ACEI axit amin dịch thủy phân 44 Bảng 3.8: Kết nghiên cứu peptide có khả ức chế ACE từ nguồn nguyên liệu khác 45 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái hàu Crassostrea gigas Hình 1.2: Vịng đời Hàu Hình 1.3: Trình tự peptide chức SCAP Hình 1.4: Hệ thống Renin-angiotensin Hình 1.5: ảnh hưởng việc thủy phân thịt hàu protesae khác nhau, đến hoạt tính ức chế enzyme ACE dịch thủy phân 10 Hình 1.6: Phân loại protease 12 Hình 2.1: Quy trình xử lý hàu trước thuỷ phân hàu đươc giã đơng nhiệt độ phịng; hàu rửa để ráo; hàu xay nhuyễn 19 Hình 2.2: Đường chuẩn Tyrosine 24 Hình 2.3: Quy trình thuỷ phân 27 Hình 2.4: Thu hồi dịch thuỷ phân 1-Dịch thuỷ phân sau bất hoạt enzyme; 2- Ly tâm; 3,4- Thu hồi dịch trong, loại cặn; 5- Lọc thu dịch 28 Hình 2.5: Cơ chế tương tác ninhydrin quy trình thí nghiệm xác định hàm lượng axit amin 29 Hình 2.6 Đường chuẩn axit glutamic 31 Hình 2.7: Cấu tạo phân tử DPPH 31 Hình 2.8: Cơ chế phản ứng DPPH với chất cho H+ quy trình thí nghiệm đo khả qt gốc DPPH 32 Hình 3.1: Biểu đồ kết ảnh hưởng nhệt độ tỉ lệ enzyme/cơ chất 38 Hình 3.2: Biểu đồ kết ảnh hưởng thời gian phản ứng tỉ lệ enzyme/cơ chất 39 Hình 3.3: Biểu đồ kết phản ứng lặp lại 40 Hình 3.4: Các bề mặt phản ứng biểu đồ đường yếu tố biến số tác động lên khả quét gốc DPPH 41 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT ACE ACEI AU NGHĨA TIẾNG ANH Angiotensin Converting Enzyme NGHĨA TIẾNG VIỆT Enzyme chuyển đổi angiotensin Angiotensin Converting Ức chế Enzyme chuyển đổi Enzyme Inhibitory angiotensin Anson Unit Đơn vị Anson BALB / c Chủng chuột bạch tạng Mức độ thủy phân DH Degree of Hydrolysis DPPH 2,2 diphenyl-picryl hydrazyl E/S Enzyme/Substrate Enzyme/ Cơ chất Ferric Reducing Antioxidant Khả chống oxy hóa Power khử sắt Oxygen Radical Antioxidant Đo khả chống oxy hóa gốc Capacity oxy FRAP ORAC OXH PA Oxy hóa Proteases of mixed Protease nucleophile hỗn nucleophile, superfamily A hợp , siêu họ A RAS Renin-angiotensin TCA Trichloroacetic Acid WFI Water for Injection Nước dùng để tiêm Da Dalton Đơn vị khối lượng nguyên tử kDa Kilodalton 1000 Dalton HHL L'Histidyl-L-leucine V/W volume/weight Thể tích/khối lượng W/W weight /weight Khối lượng/khối lượng vi với thời gian thủy phân Lược bỏ yếu tố khơng có tác động, phương trình ảnh hưởng yếu tố tới khả quét gốc DPPH biểu diễn sau: % QUÉT GỐC DPPH = 188.91 – 3.24261*A – 0.002148*B – 15.93727*C + 0.000041*AB + 0.280598*AC + 0.016610A2 Ảnh hưởng nhiệt độ tỉ lệ E/S % 120 100 80 60 40 20 99.02 85.13 67.3 72.73 61.72 7780 (4) 7780 (9) Nhiệt độ oC 23339 Tỉ lệ E/S (Au/kg protein) (12) ( TT thí ngiệm) % Quét gốc DPPH % Ảnh hưởng nhiệt độ tỉ lệ E/S 99.02 85.13 67.3 72.73 85.11 73.4871.54 61.72 7780 (4) B 23339 (10) DH% A 120 100 80 60 40 20 85.11 73.4871.54 23339 (10) DH% 7780 (9) Nhiệt độ oC 23339 Tỉ lệ E/S (Au/kg protein) (12) ( TT thí ngiệm) % Qt gốc DPPH Hình 3.1: Biểu đồ kết ảnh hưởng nhệt độ tỉ lệ enzyme/cơ chất Khi cố định thời gian thủy phân ngưỡng 3,5 thay đổi điều kiện nhiệt độ tỉ lệ E/S cho kết hình 3.1 So sánh kết Thí nghiệm 14, 15 hình A có thời gian thủy phân thay đổi, nhận thấy việc tăng nhiệt độ thủy phân làm tăng DH khả quét gốc DPPH tăng theo Cùng với so sánh kết thí nghiệm 15, 14 hình B có tỉ lệ E/S thay đổi, nhận thấy tăng tỉ lệ E/S sử dụng cho hiệu thủy DH % Quét gốc DPPH tăng lên đáng kể 38 % 120 100 80 60 40 20 Ảnh hưởng thời gian tỉ lệ E/S 99.02 85.13 67.3 72.73 85.11 73.4871.54 61.72 7780 (4) 23339 (10) Nhiệt độ oC 23339 Tỉ lệ E/S (Au/kg protein) (12) ( TT thí ngiệm) % Quét gốc DPPH DH% % A 7780 (9) 120 100 80 60 40 20 99.02 85.13 61.72 7780 (4) B 72.73 67.3 23339 (10) DH% 85.11 73.48 71.54 7780 (9) Thời gian 23339 Tỉ lệ E/S (Au/kg protein) (12) ( TT thí ngiệm) % Quét gốc DPPH Hình 3.2: Biểu đồ kết ảnh hưởng thời gian phản ứng tỉ lệ enzyme/cơ chất Khi cố định nhiệt độ 60oC, thay đổi yếu tố E/S thời gian thủy phân ta thu kết hình 3.2 Từ kết thí nghiệm số 9, 10 12 hình A thấy việc tăng thời gian thủy phân từ lên cho hiệu thủy phân DH tăng lên cách đáng kể % quét gốc DPPH tăng theo So sánh kết thí nghiệm 10, 12 hình B lần khẳng định việc tăng tỉ lệ E/S cho hiệu thủy phân cao với % quét gốc DPPH tăng Kết phù hợp với lý thuyết ảnh hưởng thời gian thuỷ phân, nhiệt độ tỉ lệ enzyme/cơ chất tăng dần yếu tố ngưỡng điều kiện tối ưu hiệu thuỷ phân khả quét gốc DPPH dịch thuỷ phân tăng dần 39 % Kết phản ứng lặp lại 100 91.41 90.73 70.94 80 71.54 90.22 71.54 60 40 20 3.5 60 (2) %DH 3.5 60 (7) 3.5 60 (13) Thời gian Nhiệt độ ( TT thí ngiệm) % Qt gốc DPPH Hình 3.3: Biểu đồ kết phản ứng lặp lại Biểu đồ hình 3.3 cho thấy kết phản ứng lặp lại khơng có chênh lệch đáng kể thí nghiệm số 2, 13 Điều đảm bảo độ xác cho phản ứng thực Bề mặt đáp ứng yếu tố ảnh hưởng đến khả quét gốc DPPH (hình 3.4) 40 A: Nhiệt độ tỉ lệ Enzyme chất B: Nhiệt độ thời gian thuỷ phân A C: Tỉ lệ Enzyme chất thời gian thuỷ phân Hình 3.4: Các bề mặt phản ứng biểu đồ đường yếu tố biến số tác động lên khả quét gốc DPPH Tối ưu hoá yếu tố phần mềm, tối ưu nhằm lựa chọn thời gian thuỷ phân ngắn để đạt hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, nhằm ứng dụng vào sản xuất nhận điều kiện tối ưu nhiệt độ 70 oC, thời gian 2,23 giờ, E/S 23339 41 (AU/kg protein) khả quét gốc DPPH 79,04 % Tối ưu nhằm thu dịch thuỷ phân có khả quét gốc DPPH cao ta thu thông số lý thuyết điều kiện 68,8 oC, E/S 21964,5 (AU/kg protein) thời gian 4,45 ta thu dịch thuỷ phân có khả quét gốc DPPH lên tới 90,84 % Các thông số tối ưu lý thuyết sử dụng để thực thực nghiệm nghiên cứu sau Thực thí nghiệm lặp lại với điều kiện tối ưu lý thuyết, thu kết khả loại bỏ gốc DPPH chênh lệch không đáng kể:  Ở 70 oC, thời gian 2,23 giờ, E/S 23339 (AU/kg protein): 78,16%  Ở 68.8 oC, thời gian 4,45 giờ, E/S 21964,5 (AU/kg protein): 88,98% Thực tế thí nghiệm cho điều kiện thu dịch peptide có khả quét gốc tự DPPH cao 88,98 % 68,8 oC, thời gian 4,45 giờ, E/S 21964,5 (AU/kg protein) tương đương hàm lượng axit amin 22,51 mg/ml dịch thủy phân So sánh với khả quét gốc DPPH dịch thủy phân với cá nghiên cứu công bố trước (bảng 3.5) Bảng 3.5: So sánh kết với nghiên cứu công bố Nghiên cứu Nguồn nguyên liệu Khả quét gốc DPPH % Nguồn nguyên liệu hàu Kong Y.-Y, et al Phụ phẩm cá thu Tây 27,7 % nồng độ 0,56 mg (2015) [16] Ban Nha peptide/mL sau tinh Ali Bougatef, et Cơ trơn cá mập 50% với 1.1± 0.06 mg peptide/mL al ( 2009) [2] (Mustelus mustelus) tinh tinh Nguyên liệu hàu Hàu Umayaparvathi, et al (2014) [25] (Saccostrea 85,7 ± 0,37% nồng độ mg peptide/ml peptide tinh cucullata) 42 Hàu 77.8% 45% tương ứng peptide (Crassostrea S1 S6 tinh talienwhanensis) nồng độ 25 µg peptide/mL Wang Qiukuan, et al (2014) [28] Hàu Hao, Gengxin et al (2013) [11] (Ostrea plicatula 50% nồng độ 2,82 ± 0,44 mg peptide /mL sau lọc phân đoạn Gmelin) Zhang, Li et al Hàu 85.25% nồng độ 10 mg (2015)[29] (Crassostrea gigas) peptide/mL sau tinh Kết nghiên cứu đề tài Hàu 88,98 % nồng độ 22,51 mg axit amin/mL dịch thuỷ phân sau lọc (Crassostrea gigas) 0,2 µm Từ bảng 3.5 thấy để đánh giá dịch thuỷ phân từ hàu (Crassostrea gigas) có nguồn thu nhận peptide chống oxy hố tiềm hay khơng, ta cần tinh peptide có dịch sau thuỷ phân, xác định nồng độ peptide chức tinh khiết khả quét gốc DPPH peptide tinh Tuy nhiên với khả chống oxy hoá cao từ sản phẩm sau thuỷ phân kể trên, dịch thuỷ phân hàu Alcalase lựa chọn tốt cho ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm sau 3.4 Khảo sát khả ức chế enzyme ACE Từ điều kiện tối ưu để khả chống oxy hoá dịch thuỷ phân thu nhận đạt tối đa từ mục 3.2, lựa chọn khảo sát đề 2.2.7 Ta có điều kiện khảo (bảng 3.6) 43 Bảng 3.6: Các điều kiện khảo sát khả ức chế enzyme ACE Thí nghiệm Nhiệt độ Tỉ lệ E/S (AU/kg protein) Thời gian (giờ) TN1 70 oC TN2 70 oC 15559,5 TN3 70 oC 23339 2,23 TN4 68,8 oC 21964,5 4,45 Thực khảo sát điều kiện tương ứng TN1 không bổ sung enzyme, TN2 bổ sung enzyme, TN3 điều kiện tối ưu cho khả quét gốc DPPH với tiêu chí thời gian ngắn nhất, TN4 điều kiện tối ưu cho khả quét gốc DPPH cao Từ kết đo OD mẫu thí nghiệm phụ lục kết xác định hàm lượng axit amin dịch thuỷ phân ta thu kết (bảng 3.7): Bảng 3.7: Mối liên hệ ACEI axit amin dịch thủy phân Hàm lượng axit amin Thí nghiệm % ức chế ACE TN1 56,85 7,1 TN2 34,87 16,96 TN3 26,22 22,2 TN4 18,6 22,51 dịch thuỷ phân (mg/ml) Kết thu từ bảng 3.7 cho thấy điều kiện không sử dụng enzyme cho việc thuỷ phân chất (chỉ có enzyme nội sinh thí nghiệm (TN1) cho hiệu ức chế enzyme ACE cao Tuy nhiên tối ưu điều kiện cho khả chống oxy hố hiệu ức chế ACE lại giảm, cụ thể bổ sung thêm 0,2% v/w Alcalase thuỷ phân với thời gian tương đương điều kiện nhiệt độ, khả ức chế enzyme ACE dịch thuỷ phân giảm từ 56,85% (TN1) xuống 34,87 %(TN2) Đặc biệt điều kiện tối ưu cho việc thu dịch thuỷ phân có hoạt tính chống oxy hố, sản phẩm thuỷ phân khả ức chế 26,22% ACE (TN3) 18,6% TN4 Từ thí nghiệm thực nghiệm kể thấy thí nghiệm số dịch thuỷ phân vừa có khả chống 44 oxy hố vừa có khả ức chế enzyme ACE ngưỡng cân đối cho mục tiêu Cùng với tăng lên hàm lượng axit amin tối ưu cho việc thu dịch có khả chống oxy hố dịch thuỷ phân mẫu khả ức chế enzyme ACE giảm dần Điều đặt câu hỏi nguyên nhân tượng trên, đối chiếu nghiên cứu peptide có khả ức chế enzyme ACE trước (bảng 3.8) Bảng 3.8: Kết nghiên cứu peptide có khả ức chế ACE từ nguồn nguyên liệu khác Nghiên cứu Nguyên liệu Kết Wang Jiapei Hàu (Crassostrea Thu peptide có khả ức chế et al (2008) talienwhanensis ACE, khối lượng 1195 Da có trình tự: [26] Crosse) Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe Chang-Bum Phụ phẩm cá hồi Ahn et al (2012) [4] Thu chuỗi peptide có khả ức chế ACE sau: (P1) Val-Trp-Asp-Pro-Pro-Lys-Phe-Asp (P2) Phe-Glu-Asp-Tyr-Val-Pro-Leu-SerCys-Phe (P4) Phe-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr-Glu Gao, D et al Hạt (2019) [9] Thu chuỗi peptide có khả ức chế ACE, khối lượng 763,4 Da trình tự: Phe-Pro-Ala-Ile-Gly-Met-Lys Từ kết nghiên cứu trước bảng 3.8, thấy peptide chức có hoạt tính ức chế ACE peptide có mạch tương đối dài từ 7- 10 axit amin Trong khi ta tiến hành thuỷ phân, tăng hàm lượng axit amin dịch tức protein cắt thành phần nhỏ Từ kết luận việc phân cắt nhỏ chuỗi protein thịt hàu nguyên nhân khiến cho khả ức chế enzyme ACE giảm Cùng với nghiên cứu trước hoạt tính ức chế ACE Guo.Z cộng (2020) thuỷ phân thịt hàu (Crassostrea gigas) Pepsin đưa kết luận, việc làm chín thịt hàu sau thuỷ phân lại cho nhiều peptide có hoạt tính ức chế enzyme ACE so với thuỷ phân hàu sống [10] Kết luận dẫn đến việc xử lý nguyên liệu đầu vào để tối ưu khả chống oxy hoá ức chế enzyme ACE cần xem xét 45 KẾT LUẬN 3.5 Kết luận Việc khảo sát xử lý nguyên liệu đầu vào cho thấy việc làm chín thịt hàu trước thuỷ phân không cần thiết Sản phẩm thuỷ phân sau thực nghiệm xác nhận có khả quét gốc tự DPPH cao 88,98 %, tương ứng với hàm lượng axit amin 22,51 mg /mL, thủy phân nhiệt độ 68,8 oC, tỷ lệ E/S 21964,5 (AU/kg protein) thời gian 4,45 Điều kiện tối ưu cho yếu tố khả quét gốc tự DPPH cao với tiêu chí thời gian thủy phân ngắn nhiệt độ thủy phân 70 oC, thời gian 2.23 giờ, tỷ lệ E/S 23339 (AU/kg protein) khả quét gốc tự DPPH đạt 78,16% Việc khảo sát khả ức chế enzyme ACE cho kết tương đối rõ ràng, việc phân cắt nhỏ protein ảnh hưởng đáng kể tới hiệu ức chế Việc khảo sát khả ức chế enzyme ACE giúp cân việc đạt hiệu chống oxy hoá tốt nhất, bên cạnh trì khả ức chế enzyme ACE 3.6 Kiến nghị Hướng tới tinh sạch, giải trình tự peptide dịch thủy phân với hoạt tính chống oxy hóa cao Đồng thời tối ưu để thu dịch thuỷ phân có khả ức chế enzyme ACE tốt 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Abd El-Fattah, Alaa Mohamed; Sakr, Sally Samir; El-Dieb, Samia Mahmoud; Elkashef, Hany Abdel Satar, "Bioactive peptides with ACE-I and antioxidant activity produced from milk proteolysis," 2016 [2] Ali Bougatef; Mohamed Hajji; Rafik Balti; Imen Lassoued; Yosra TrikiEllouz; Moncef Nasri, "Antioxidant and free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases," Food Chemistry, vol 114, no 4, p 1198–1205, 2009 [3] Chai, T.-T.; Law, Y.-C.; Wong, F.-C.; Kim, S.-K, "Enzyme-Assisted Discovery of Antioxidant Peptides from Edible Marine Invertebrates: A Review," no 42, p 26, 15 Mar 2017 [4] Chang-Bum Ahn; You-Jin Jeon; Yong-Tae Kim; Jae-Young Je, "Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from salmon byproduct protein hydrolysate by Alcalase hydrolysis," vol 47, 2012 [5] Cheng-Liang Xie,Jin-Soo Kim,Jong-Myung Ha,Se-Young Choung,and Yeung-Joon Choi, "Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitor Derived from Cross-Linked Oyster Protein," Research Article, vol 2014, 23 june 2014 [6] Cushman DW, Cheung HS, "Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung," in Biochemical Pharmacology, vol 20, 1971, p 1637–1648 [7] Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Nguyễn Thị Xn Sâm, “Thí nghiệm hố sinh cơng nghiệp”, NXB Bách Khoa Hà Nội, 1997 [8] Daniele Salvi, Armando Macali, Paolo Mariottini, "Molecular Phylogenetics and Systematics of the Bivalve Family Ostreidae Based on rRNA Sequence-Structure Models and Multilocus Species Tree," vol 9, no 9, 24 september 2014 [9] Gao, D., Zhang, F., Ma, Z., Chen, S., Ding, G., Tian, X., & Feng, R., " Isolation and identification of the angiotensin-I converting enzyme (ACE) 47 inhibitory peptides derived from cottonseed protein: optimization of hydrolysis conditions," vol 22, no 1, 22 july 2019 [10] Guo, Z., Zhao, F., Chen, H et al “Heat treatments of peptides from oyster (Crassostrea gigas) and the impact on their digestibility and angiotensin I converting enzyme inhibitory activity” Food Sci Biotechnol 29, 961– 967 (2020) https://doi.org/10.1007/s10068-020-00736-4 [11] HAO, Gengxin; CAO, Wenhong; HAO, Jiming; ZHANG, Chaohua (2013) “In Vitro Antioxidant Activity and In Vivo Anti-fatigue Effects of Oyster (Ostrea plicatula Gmelin) Peptides Prepared Using Neutral Proteinase,” Food Science and Technology Research, 19(4), 623– 631 doi:10.3136/fstr.19.623 [12] Hui Chen, Yu Chen, Huizhen Zheng, Xingwei Xiang, Lu Xu, "A novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptide from oyster: Simulated gastro-intestinal digestion, molecular docking, inhibition kinetics and antihypertensive effects in rats," Nutrition and Food Science Technology, vol 9, 23 August 2022 [13] Ion Neda1, Paulina Vlazan1, RalucaOana Pop1, Paula Sfarloaga1, Ioan Grozescu1 Adina-Elena Segnean., "Peptide and Amino Acids Separation and Identification from Natural Products," in Analytical Chemistry, Ira S Krull, 2012 [14] J A Kaplan, Essentials of Cardiac Anesthesia, California: Elsevier, 2018 [15] JONES JR, J B., et al, “Kjeldahl method for nitrogen determination”, Micro-Macro Publishing, 1991 [16] Kong, Y.-Y., Chen, S.-S., Wei, J.-Q., Chen, Y.-P., Lan, W.-T., Yang, Q.W., & Huang, G.-R, "Preparation oAf Antioxidative Peptides from Spanish Mackerel (Scomberomorus niphonius) Processing Byproducts by Enzymatic Hydrolysis," vol 14, no 4, p 188–193, 2015 [17] Liu, Z Dong, S, Xu, J.Zeng, M.Song, H.& Zhao, Y, "Production of cysteine-rich antimicrobial peptide by digestion of oyster (Crassostrea gigas) with Alcalase and bromelin," vol 19, no 3, p 231–235, 2008 [18] M Moo-Young, " Proteases," in Comprehensive Biotechnology, Pergamon, 2011, pp 571-582 48 [19] Moayedi, Ali; Mora, Leticia; Aristoy, Maria Concepción; Safari, Mohammad; Hashemi, Maryam; Toldrá, Fidel, " Peptidomic analysis of antioxidant and ACE-inhibitory peptides obtained from tomato waste proteins fermented using Bacillus subtilis," 2018 [20] Nguyễn Đức Lượng et al, “Công nghệ enzyme”, NXB Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh, 2004 [21] O P Sharma and T K Bhat, "DPPH antioxidant assay revisited," in Journal of Food Chemistry, vol 113, 2009, p 1202–1205 [22] Qian, B., Zhao, X., Yang, Y., & Tian, C, "Antioxidant and antiinflammatory peptide fraction from oyster soft tissue by enzymatic hydrolysis," vol 8, no 7, pp 3947-3956, 2020 [23] Thu T T M, Mười N V & Thủy L T M, "Nghiên cứu chế độ thủy phân đầu cá lóc (Channa striata) thu hồi dịch đạm enzyme flavourzyme," pp 93-100, 2021 [24] Trần Thị Ngà et.al "Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thịt hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) hỗn hợp enzym neutraza flavozym", Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn 2016, số 20 tr.89-96 [25] Umayaparvathi, S.; Meenakshi, S.; Vimalraj, V.; Arumugam, M.; Sivagami, G.; Balasubramanian, T, "Antioxidant activity and anticancer effect of bioactive peptide from enzymatic hydrolysate of oyster (Saccostrea cucullata)," vol 4, no 3, p 343–353, 2014 [26] Wang J, Hu J, Cui J, Bai X, Du Y, Miyaguchi Y, Lin B, "Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the antihypertensive effect of hydrolysate in spontaneously hypertensive rats," vol 111, no 2, pp 302-308, 15 November 2008 [27] Wang YK, He HL, Wang GF, Wu H, Zhou BC, Chen XL, Zhang YZ, "Oyster (Crassostrea gigas) hydrolysates produced on a plant scale have antitumor activity and immunostimulating effects in BALB/c mice," vol 8, no 2, p 255–268, Feb 2010 49 [28] Wang, Qiukuan; Li, Wei; He, Yunhai; Ren, Dandan; Kow, Felicia; Song, Linlin; Yu, Xingju (2014) Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters (Crassostrea talienwhanensis) Food Chemistry, 145(), 991–996 doi:10.1016/j.foodchem 2013.08.099 [29] Zhang, Li; Liu, Yezhou; Tian, Xin; Tian, Zhenhua (2015) Antimicrobial Capacity and Antioxidant Activity of Enzymatic Hydrolysates of Protein from Rushan Bay Oyster (Crassostrea gigas) Journal of Food Processing and Preservation, 39(4), 404–412 doi:10.1111/jfpp.12245 [30] Zhang, Z., Su, G., Zhou, F., Lin, L., Liu, X., & Zhao, M, "Alcalasehydrolyzed oyster (Crassostrea rivularis) meat enhances antioxidant and aphrodisiac activities in normal male mice," vol 120, p 178–187, jun 2019 [31] Zhu, Y., Li, Q., Yu, H., & Kong, L, "Biochemical Composition and Nutritional Value of Different Shell Color Strains of Pacific Oyster Crassostrea gigas," vol 17, no 4, pp 897-904, 2018 [32] https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/search/protease?focus=products& page=1&perpage=30&sort=relevance&term=protease&type=product [33] https://www.medicalnewstoday.com/articles/what-do-we-really-knowabout-antioxidants [34] https://suckhoe123.vn/suc-khoe/blog/gia-tri-dinh-duong-tu-hau12481.html [35] https://www.fao.org/fishery/docs/DOCUMENT/aquaculture/CulturedSp ecies/file/en/en_pacificcuppedoyster.htm [36] https://thuonghieuquangninh.gov.vn/giac-mo-lam-giau-tu-hau-thai-binhduong.html [37] http://www.chemistryexplained.com/Hy-Kr/Hydrolysis.html 50 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn vitamin C Đường chuẩn vitamin C: Dung dịch vitamin C 100 µg/ l: (dung dịch A) Nồng độ dung dịch xây dựng đường chuẩn Vitamin C Pha lỗng (lần) Nồng độ (µg/l) OD Nước / dịch 2,5 3,9/0,1 từ A 3,8/0,2 từ A 7,5 3,7/0,3 từ A 10 3,6/0,4 Từ A 12,5 3,5/0,5 từ A 15 3,4/0,6 từ A 17,5 3,3/0,7 từ A 20 3,8/0,2từ A Phương trình đường chuẩn Vitamin C có dạng y = 1.4544x + 0.532 Với R² = 0.9955 Phương trình đường chuẩn VTM C 35 y = 1.4544x + 0.532 R² = 0.9955 % Quét gốc DPPH 30 25 20 15 10 0 10 15 20 25 Hàm lượng VTM C ( µg/l) Đường chuẩn vitamin C 51 Phụ lục 2: Giá trị OD mẫu thí nghiệm ức chế enzyme ACE Khả ức chế enzyme ACE dịch thuỷ phân hàu điều kiện Điều kiện thuỷ phân TN1 Mẫu Gái trị tb Gía trị tb TB TN2 TN3 As Ao TN4 Ao As Ao As Ao As 0,374 0,3 0,324 0,243 0,314 0,223 0,224 0,208 0,205 0,373 0,302 0,325 0,251 0,322 0,247 0,211 0,206 0,374 0,301 0,325 0,247 0,318 0,235 0,227 0,210 0,206 0,23 Ac %ức chế 56,85 34,87 26,22 18,6 ACE Phụ lục 3: Hình minh họa dịch trước sau thủy phân Dịch trước Dịch sau Dịch sau Dịch sau thủy phân thủy phân ly tâm lọc 52