Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng.BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG CHUYÊN NGÀN.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG CHUYÊN NGÀNH DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 9.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nợi – 2023 Cơng trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Xuân Viết PGS TS Thái Thanh Bình Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Đăng Tôn Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phản biện 2: PGS TS Đặng Thị Lụa Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Quang Huy Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … … ngày … tháng… năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ưa sống vùng biển nước ấm, từ 18-30oC độ mặn dao động từ 25-30‰ (Hà Đức Thắng, 2010) Tu hài chủ yếu lọc ăn mùn bã hữu cơ, tảo khuê sinh vật phù du (Hà Đức Thắng, 2010) Ở Việt Nam, tu hài phân bố tự nhiên nuôi nhiều vùng biển thuộc tỉnh Quảng Ninh, Hải Phịng tỉnh Khánh Hịa với tổng diện tích mặt nước nuôi tu hài đạt khoảng 1.000 ha, sản lượng ni đạt khoảng 2.621,6 tấn, thu nhập ước tính 200 tỷ đồng/ năm (Tổng cục Thủy sản, 2014) Thịt tu hài có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm khống chất, đặc biệt thịt tu hài có chứa nhiều axit amin không thay (Đỗ Đăng Khoa cs, 2014) Những năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ tu hài ngày tăng, hiệu kinh tế mang lại từ ni tu hài lớn, nên diện tích nuôi trồng tu hài thương phẩm tăng lên đáng kể, nhu cầu giống chất lượng với số lượng lớn khơng ngừng tăng lên Theo báo cáo tổng cục thủy sản, ước tính năm thị trường nuôi tu hài thương phẩm cần khoảng 100 triệu giống cấp I (Tổng cục Thủy sản, 2014) Trong đó, chương trình chọn giống tiên tiến nước ta nghề nuôi tu hài thương phẩm chưa áp dụng, việc sản xuất giống theo phương pháp truyền thống vừa không cung cấp đủ nhu cầu giống đạt chuẩn vừa gây tượng thối hóa giống giao phối cận huyết khâu sản xuất giống Tu hài nuôi biểu tăng trưởng chậm hơn, không đồng dễ bị nhiễm bệnh (Phòng NN&PTNT Vân Đồn, 2019) Theo Quyết định 1664/QĐ-Tg ngày 04/10/2021 chiến lược phát triển đối nuôi trồng thủy sản biển đến năm 2030 tầm nhìn đến năm 2045, ni biển nói chung ni nhuyễn thể nói riêng, có tu hài hướng tới phát triển sản xuất bền vững, hạn chế tối thiểu tác động tiêu cực đến môi trường hệ sinh thái biển (Chính Phủ, 2021) Để thực chiến lược cần trọng khai thác phát triển nguồn giống địa có ứng dụng chương trình chọn giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống, tăng trưởng nhanh có khả chống chịu với điều kiện môi trường Chọn giống với hỗ trợ thị phân tử ngày trọng ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống nói chung với nghề ni thủy sản nói riêng đạt thành tựu đáng tự hào (Gjedrem cs, 2012) Với đời ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gene hệ (NGS), nhiều hệ gene sinh vật nói chung, lồi thủy sản nói riêng giải trình tự Khai thác trình tự hệ gene hệ gene phiên mã (transcriptome), nhiều thị phân tử công bố công cụ đáng tin cậy hiệu nhà chọn tạo giống việc nhanh chóng tạo giống cải thiện di truyền giống có (Hetzel cs, 2000) Trong số đó, thị đa hình nucleotide đơn (SNP) xem thị xác, hiệu phổ biến áp dụng chọn tạo giống liên quan đến suất chất lượng (Liu, 2007) Với mạnh vượt trội, thị SNP sử dụng công cụ chọn lọc đắc lực tính trạng quan tâm chương trình chọn giống nhiều lồi vật ni nói chung lồi thủy sản nói riêng (Liu, 2007) Điều quan trọng SNP xuất vùng gen mã hóa, tác động trực tiếp đến tính trang quan tâm, hiệu việc xác định mối tương quan SNP tính trạng (Beuzen cs, 2000) Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhận dạng xác lồi quan tâm việc sử dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự gene hệ cung cấp tư liệu trình tự hệ gene để từ phát triển thị phân tử nói chung, thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài nói riêng có ý nghĩa lý luận thực tiễn nghề nuôi tu hài Xuất phát từ lý luận thực tiễn nêu trên, lựa chọn tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) theo hướng tăng trưởng” Mục tiêu nghiên cứu Phát triển thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài góp phần phát triển nghề ni tu hài nói riêng nghề ni biển Việt Nam nói chung Nợi dung nghiên cứu - Điều tra, đánh giá thành phần lồi tu hài, trạng tiềm nghề ni tu hài huyện Vân Đồn – tỉnh Quảng Ninh - Nghiên cứu xây dựng DNA barcoding cho tu hài vịi trắng (Lutraria rhynchaena) - Nghiên cứu giải trình tự hệ gene tu hài phát triển thị SNP cung cấp sở liệu hệ gene tu hài (Lutraria rhynchaena) thu huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh - Nghiên cứu phát triển số thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: - Đề tài luận án cung cấp số liệu quan trọng thành phần tu hài tự nhiên phân bố Vân Đồn, trạng tiềm nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh - Kết nghiên cứu xây dựng mã vạch DNA tu hài sở khoa học quan trọng để nhận dạng xác lồi tu hài phục vụ lấy mẫu nghiên cứu giải trình tự hệ gene có ý nghĩa phục vụ truy xuất nguồn gốc sản phẩm từ thịt tu hài Việt Nam - Dữ liệu trình tự hệ gene tu hài xây dựng từ kết đề tài luận án có giá trị khoa học nghiên cứu hệ gene, sở để khai thác phát triển thị phân tử cho nhà nghiên cứu chọn tạo giống tu hài - Phát triển số thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài cung cấp công cụ sinh học phân tử có giá trị cơng tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng Việt Nam Ý nghĩa thực tiễn: - Mã vạch DNA phát cung cấp cơng cụ phân tử nhận dạng xác tu hài phục vụ nghiên cứu truy xuất nguồn gốc - Với liệu hệ gene lần cung cấp hệ gene tham chiếu tu hài (Lutraria rhynchaena) - Một số thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng phát triển có ý nghĩa phục vụ công tác chọn tạo giống tu hài theo hướng tăng trưởng nhờ thị phân tử Những đóng góp luận án - Luận án đánh giá thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên Vân Đồn, tiềm nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh - Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài dựa trình tự gene 16S rRNA COI, cung cấp thêm cơng cụ nhận dạng phân loại xác lồi tu hài (Lutraria rhynchaena) - Giải trình tự cơng bố hệ gene tu hài (Lutraria rhynchaena) GenBank góp phần cung cấp liệu hệ gene tham chiếu, phục vụ nghiên cứu khai thác liệu hệ gene tu hài - Qua sàng lọc liệu hệ gene, phát tuyển chọn 11 thị SNPs liên quan đến tăng trưởng phục vụ cho công tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu tu hài 1.1.1 Vị trí phân loại học Ngành động vật thân mềm: Mollusca Linnaeus, 1758 Lớp hai mảnh vỏ: Bivalvia Linnaeus, 1758 Bộ ngao (biện mang): Veneroida Bieler R., 2010 Họ vọp: Mactridae Lamarck, 1799 Giống: Lutralia Lamarck, 1799 Loài: Lutralia rhynchaena, Jonas 1844 (Tên đồng danh L philippinarum Reeve, L philippinarum Deshayes) Lồi Lutralia rhynchaena (Jonas 1844), có tên tiếng Việt tu hài vòi trắng tên tiếng Anh Snout Otter Clam, Otter Clam Hình 1.1 Tu hài (Lutralia rhynchaena) thu Vân Đồn, Quảng Ninh 1.1.2 Phân bố tự nhiên tu hài Trên giới, tu hài phân bố chủ yếu vùng biển phía Tây Nam nước Úc, số nước châu Á như: Trung Quốc, Thái Lan, Philippine vùng Bắc Mỹ (Beuzen cs, 2000) Ở Việt Nam, tu hài phân bố chủ yếu vùng biển phía Bắc, độ mặn ổn định từ 25 – 30 ‰, có đáy cát, cát sỏi nhỏ, vỏ động vật thân mềm vùng biển vịnh Lan Hạ thuộc đảo Cát Bà - TP Hải Phòng đến huyện đảo Vân Đồn - Quảng Ninh (Phạm Thược, 2006) 1.1.3 Tình hình nuôi, khai thác tu hài Trên giới, theo thống kê sản lượng khai thác thủy sản toàn cầu năm 2018 đạt gần 80 triệu tấn, năm 2020 đạt 94,6 triệu tấn, sản lượng động vật thân mềm chiếm 1/3, sản lượng tu hài ước đạt triệu (FAO, 2020) Ở nước, sản lượng tu hài khai thác ước đạt 2.621,6 (Tổng cục Thủy sản, 2020) 1.2 DNA barcoding ứng dụng việc phân loại, nhận dạng loài 1.2.1 DNA barcoding DNA barcoding (Mã vạch DNA) trở thành thuật ngữ phổ biến, quan trọng có ý nghĩa thập kỷ qua toàn giới Năm 2003, lần khái niệm mã vạch DNA giáo sư Paul Hebert đưa giúp nhận dạng mẫu vật, cách sử dụng đoạn DNA ngắn từ đoạn gene cụ thể kết hợp nhiều gen (Hebert cs, 2003) Sử dụng kỹ thuật DNA barcoding nghiên cứu giúp nhà phân loại học định danh xác lồi, đồng thời góp phần đánh giá đa dạng di truyền loài sinh vật (Zalapa cs, 2012) 1.2.2 Ứng dụng DNA barcoding phân loại động vật nhuyễn thể Mã vạch DNA ứng dụng để phân loại cho nhiều loài sinh vật: phân loại cá (Lara cs, 2010), (Murgarella cs, 2016), (Weigt cs, 2012), phân loại lồi tơm hùm nhờ trình tự vùng gene COI, có lồi tơm hùm Việt Nam loài khác thu Úc Sri Lanka (Hiếu cs, 2019) Trên đối tượng nhuyễn thể, mã vạch DNA ứng dụng thành cơng việc xác định 14 lồi hai mảnh vỏ, trình tự COI đóng góp vào phát liên quan đến tính đa dạng sinh học cao động vật thân mềm (Moira, 2021), mã vạch DNA ứng dụng chứng minh hiệu việc phân loại hàu biển (Trivedi cs, 2012), da gai (Ward, 2019), ốc hương (Bình cs, 2017) Trong phân tích mã vạch ngao, Liu (2018) sử dụng trình tự DNA vùng gen COI 56 lồi trình tự gene 16S 19 loài để xác định mối quan hệ phát sinh lồi ngao (Liu Zhang, 2018) 1.3 Cơng nghệ giải trình tự gene chỉ thị phân tử SNPs 1.3.1 Cơng nghệ giải trình tự gene ứng dụng Cơng nghệ giải trình tự hệ (Next generation sequencing – NGS) đời bối cảnh đó, đời cơng nghệ NGS dựa phát triển đồng loạt kỹ thuật chuẩn bị mẫu (Template preparation), nguyên lý đọc trình tự (Sequencing and imaging), so sánh lắp ráp gene (Genome aligment and assembly) Việc sử dụng công nghệ NGS tạo khối lượng liệu khổng lồ (Giải từ Gb đến 600 Gb), giá thành rẻ, chi phí thấp ưu điểm vượt trội giải trình tự nhanh xác Hệ thống giải trình tự hệ sử dụng phổ biến giải trình tự Roche 454 (454 Life Sciences), HiSeq 2000/4000 (Illumina) AB SOLiD (Life Technologies) Kỹ thuật giải trình tự RAD- Sequencing (Restriction site Associated DNA Sequencing) kỹ thuật giải trình tự hệ gen cách sử dụng enzyme cắt giới hạn để phân cắt DNA gen thành phân đoạn ngắn gắn adapter vào đầu, số lượng lớn biến thể di truyền SNPs xác định từ liệu trình tự DNA giải trình tự hệ (Baird cs, 2008) Cơng nghệ giải trình tự gene ứng dụng để giải mã thành công gene 13 loài nhuyễn thể, bao gồm: Argopecten purpuratus (Li cs, 2018), Bathymodiolus platifrons (Sun cs, 2017), Chlamys farreri (Li cs, 2017), C gigas (Zhang cs, 2012), Limnoperna fortunei (Uliano-Silva cs, 2018), Modiolus philippinarum (Sun cs, 2017), Mytillus galloprovosystemis (Nguyen cs, 2014), Patinopecten yessoensis (Wang cs, 2017), Pinctada fucata (Takeuchi cs, 2012), (Du cs, 2017), Ruditapes philippinarum (Mun cs, 2017), Saccostrea glomerata (Powell cs, 2018), Scapharca bringonii (Bai cs, 2019) Venustaconcha ellipsiformis (Renaut cs, 2018) 1.3.2 Chỉ thị phân tử SNPs ứng dụng Đa hình nucleotide đơn (SNP) biến đổi trình tự DNA xảy đơn nucleotide (A, T, C G) trình tự gene bị thay đổi xảy quần thể Sự phân bố SNP hệ gen không đồng nhất, SNP thường xảy với tần số khác phần nhiễm sắc thể khác vùng khơng mã hóa thường cao so với vùng mã hóa (Liu Cordes, 2004), hầu hết SNP dạng hai alen liên quan đến thay Cytosine (C) với Thymine (T), biến thể phong phú chuỗi DNA cá thể quần thể Chỉ thị SNP ứng dụng trong nghiên cứu số vật ni có tầm quan trọng, mật độ SNP thay đổi từ 6,5K đến 930K (Wall cs, 2014) Trong vùng gên mã hóa protein hàu Thái Bình Dương, 60 bp chứa SNP, vùng gên không mã hóa 40 bp chứa SNP (Sauvage cs, 2007) Trong hàu dẹt châu Âu, mật độ SNP chứng minh tương đối cao, vùng mã hóa protein 76 bp chứa SNP vùng khơng mã hóa protei 47 bp chứa SNP (Harrang cs, 2013) 1.4 Một số gen liên quan đến tính trạng tăng trưởng nhuyễn thể hai mảnh vỏ Một số nghiên cứu đa hình gene có liên quan đến tăng trưởng nhuyễn thể hai mảnh vỏ, nhóm nghiên cứu Liying cs (2014) tiến hành nghiên cứu đặc điểm gene IGFBP (PyIGFBP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng lồi sị điệp Yesso (Liying cs, 2014) Hai SNP có liên quan đến tăng trưởng sị gồm PyE2F3-1 PyE2F3-2, gene PyE2F3-1 có tương quan đến tăng trưởng chiều dài, chiều cao vỏ, trọng lượng thể trọng lượng (Xianhui cs, 2019) Trên đối tượng hàu phân tích liên kết haplotype đa hình nucleotide đơn (SNP), xác định bốn SNP (ở vị trí - 904, - 522, - 272, - 262 bp) hai haplotype (CCCC TCTC) có liên quan trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng C gigas (Liting cs, 2021) CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: Mẫu thu thập Trung tâm giống Thủy sản lợ mặn, Trường Cao đẳng Kinh tế, Kỹ thuật Thủy sản Mẫu thu gồm 01 mẫu mô màng áo tu hài thu thập phục vụ giải trình tự hệ gen tu hài Mẫu mơ màng áo 30 cá thể tu hài tăng trưởng nhanh, 30 cá thể tu hài tăng trưởng chậm phục vụ gải trình tự sàng lọc SNP Mẫu mơ tiêu hóa tu hài thu để phục vụ giải trình tự hệ gene phiên mã Địa điểm nghiên cứu: Việc tách chiết, tinh sản phẩm DNA thực phịng cơng nghệ sinh học, Trường Cao đẳng Kinh tế, Kỹ thuật Thủy sản, thành phố Từ Sơn – tỉnh Bắc Ninh Giải trình tự đọc kết tiến hành Trung tâm công nghệ Genomic, Đại học Deakin, Victoria – Australia 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Điều tra thành phần loài tu hài, trạng nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh tiềm phát triển nghề ni tu hài 2.2.1.1 Khảo sát thành phần lồi tu hài huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh - Sử dụng phương pháp khảo sát áp dụng cho vùng triều, sử dụng kĩ thuật khung định lượng (10m2) điểm thu mẫu Mẫu thu bảo quản theo tài liệu English (1994) (English cs, 1997) Quy phạm điều tra tổng hợp biển Ủy ban Khoa học Kỹ thuật Nhà nước (Ủy ban khoa học Kỹ thuật nhà nước, 1981) Quy trình điều tra Tài nguyên Môi trường biển (Viện tài ngun Mơi trường biển, 1994) - Định danh lồi tu hài phương pháp hình thái: Các cá thể tu hài thu thập định loại dựa đặc điểm hình thái ngồi (hình dạng, màu sắc vỏ, màu sắc vịi, tiêu phân loại hình thái) theo khóa phân loại động vật thân mềm hai mảnh vỏ Đặng Ngọc Thanh (Đặng Ngọc Thanh, 2007) 2.2.1.2 Đánh giá trạng tiềm nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn Thơng tin diện tích, hình thức nuôi, mật độ thả nuôi, thời gian nuôi thương phẩm, kích cỡ thu hoạch, tình hình dịch bệnh, tỷ lệ sống, sản lượng hiệu kinh tế, việc tuân thủ quy định pháp luật thực biện pháp bảo vệ môi trường sở khảo sát từ 400 hộ có nghề ni tu hài xã Thắng Lợi, Quan Lạn, Đoàn Kết, Ngọc Vừng, Đông Xá, Bản Sen, Vạn Yên Thị trấn Cái Rồng thuộc huyện Vân Đồn Thông tin điều kiện tự nhiên, điều kiện môi trường nước biển, thị trường tiêu thụ, giá bán tu hài thương phẩm thu thập từ Chi cục Thủy sản tỉnh Quảng Ninh phịng Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn huyện Vân Đồn sử dụng để phân tích, đánh giá tiềm phát triển nghề nuôi tu hài 10 quan đến tính trạng tăng trưởng Thư viện DNA hệ gen tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm phát triển kỹ thuật ezRAD (Toonen cs, 2013), sử dụng kit TruSeq Nano HT Library Preparation (Illumina) Thư viện DNA thu từ kỹ thuật ezRAD dải band có kích thước từ 350 – 550 bp Giải trình tự ezRAD: Giải trình tự hệ thống máy giải trình tự hệ HiSeq6000 (Illumina), Trung tâm Công nghệ genomic, Trường Đại học Deakin, Australia 2.3.5 Phương pháp phân tích xử lý liệu 2.3.5.1 Khảo sát thành phần loài tu hài đánh giá trạng, tiềm nghề nuôi tu hài: Thực theo tài liệu Quy trình điều tra Tài nguyên Môi trường biển, 2014 thuộc phần điều tra khảo sát động vật đáy biển Việc tính tốn giá trị trung bình, độ lệch chuẩn so sánh khác biệt nghiệm thức xử lý thống kê, phân tích ANOVA nhân tố phần mềm Minitab 16.4 ứng dụng Microsoft Office Excel 2016 để thống kê, phân tích nhằm thể rõ kết biểu đồ, đồ thị 2.3.5.2 Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L rhynchaena: Các trình tự DNA vùng gene 16S rRNA, COI loài Lutraria chỉnh sử dụng phần mềm Bioedit MAFFT (Katoh Standley, 2013) Sau tiến hành phân tích phần mềm BioEdit (Hall cs, 1999), MEGA X (Kumar cs, 2018) 2.3.5.3 Phân tích hệ gene hệ gene phiên mã tu hài L rhynchanena: Xác định kích thước gene tu hài: Tiền xử lý liệu thô sử dụng công cụ Fastp (v0.19.4) (Chen cs, 2018), chất lượng liệu tiền xử lý với chương trình Trimmomatic (v0.36) (Bolger cs, 2014) Đánh giá chất lượng lắp ráp trình tự gene tu hài phần mềm bowtie2 v2.3.3.1 (Langmead Salzberg, 2012) Ước lượng kích thước hệ gene tu hài giá trị kmer chng trỡnh vi Jellyfish v2.2.6 (Marỗais v Kingsford, 2011) Sử dụng phầm mềm GenomeScope để xây dựng biểu đồ k-mer ước tính kích thước gene tu hài (Vurture cs, 2017) Lắp ráp hệ gene tu hài phần mềm MaSuRCA (De novo) (Zimin cs, 2013), đánh giá mức độ hồn chỉnh q trình lắp ráp BUSCO v3.0.2 (Simão cs, 2015) Chỉnh sửa 11 lần đọc dài lắp ráp phần mềm minimap2 (Li, 2018), chỉnh sửa lỗi phần mềm Purge Haplotigs (Renaut cs, 2018) *Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp tìm kiếm đa hình: Phát đa hình nucleotide đơn (SNP) phầm mềm bowtie2 (Langmead Salzberg, 2012), xác định trình tự lặp lại phần mềm RECON RepeatScout (Chen, 2018), (Price cs, 2005) Xác định kích thước hệ gene phiên mã tu hài (L rhynchaena) *Lắp ráp hệ gene phiên mã: Thư viện RNA-seq giải trình tự, liệu thô tiền xử lý hệ phiên mã tạo để hỗ trợ cho việc dự đoán hệ gene Lắp ráp de novo thực phần mềm Trinity (Grabherr, 2011) Xử lý trình tự đọc ngắn phần mềm Bowtie2 (Langmead Salzberg, 2012) Căn chỉnh hệ gene phiên mã phần mềm GMAP (Zalapa cs, 2012) *Dự đốn thích gene: Dự đoán gene thực phần mềm MAKER (Holt Yandell, 2011), nhóm protein chỉnh phần mềm MAFFT v7.394 (Katoh Standley, 2013), protein xác định phần mềm IQ-TREE v1.5.5 (Nguyen cs, 2014) Phân tích thị phân tử SNP phần mềm BWA (Li Durbin, 2009) phát SNP SAMtools (Li, 2009) Các SNP gióng hàng contig sai khác nucleotide phát bốn trình tự đọc (Read) (Gao cs, 2012) Xử lý số liệu theo quy trình Stacks (Catchen cs, 2011), (Rochette cs, 2019) Xác định SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài (L rhynchaena): Bộ liệu trình tự nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm tiền xử lý phần mềm Trimmoatic, đoạn trình tự có chất lượng thấp (Q< 10) loại bỏ (Bolger cs, 2014) Quá trình xử lý số liệu thực theo quy trình dDocent v2.24 (http://dDocent.com) Các bước tuyển chọn SNPs thực bao gồm: Lắp ráp hệ gen tham chiếu (de novo reference asembly), dóng hàng (Maping) phần mềm Stacks (Rochette cs, 2019), phát lọc thị SNPs phần mềm vcftools v.0.1.13 (Danecek cs, 2011) Outlier loci vị trí loci có giá trị khác biệt so với phần lại 12 gene (Neutral loci) sử dụng phương pháp linkage disequibrium (LD) để phát outlier loci phần mềm R (Gregor cs, 2019) Sàng lọc phát SNP thực dựa tiêu chí sàng lọc tích hợp chạy chương trình VariantFiltration thuộc GATK giúp đánh dấu điểm biến dị có: giá trị Fisher Strand: FS > 30.0; giá trị Qual by Depth: QD < 2.0; xuất SNP trở lên khung cửa sổ 35bp (SnpCluster); SNP nằm cách đầu trình tự đọc 20-25bp Sàng lọc riêng biệt: File vcf kết sau chạy GATK đưa vào công cụ vcfisec để lọc vị trí transcript mà phát biến dị nhóm tu hài sinh trưởng nhanh chậm Thiết kế cặp mồi cho SNP tương ứng hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm dựa file fasta trích xuất dựa vào phần mềm thiết kế mồi với tham số đặt sẵn: độ dài primer, vị trí gắn mồi, nhiệt độ gắn mồi (Tm) CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên huyện Vân Đồn, trạng tiềm phát triển nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh 3.1.1 Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên huyện Vân Đồn Kết khảo sát thành phần loài tu hài L rhynchaena xã, thị trấn thuộc huyện Vân Đồn với 40 địa điểm thu 66 mẫu tu hài Dựa khóa phân loại mơ tả hình thái nhuyễn thể hai mảnh vỏ để xác định loài tu hài Kết xác định huyện Vân Đồn có hai lồi tu hài phân bố, thành phần lồi tu hài khảo sát mơ tả Bảng 3.1 Thành phần loài tu hài ghi nhận phân bố tự nhiên 8/8 xã, thị trấn chủ yếu lồi tu hài vịi trắng L rhynchaena, lồi tu hài vòi đỏ L arcuata phát xã Đơng Xá Bảng 3.1 Thành phần lồi tu hài phân bố tự nhiên huyện Vân Đồn Thành phần loài tu hài Chỉ tiêu Số mẫu thu (con) Khối lượng mẫu thu (kg) Lutraria rhynchaena, Lutraria arcuata Jonas 1844 Deshayes in Reeve,1854 61 3,317 0,112 13 Mật độ (con/m2) 0,15 ± 0,03 0,1 ± 0,02 3.1.2 Đánh giá trạng tiềm phát triển nghề nuôi tu hài huyện Vân Đồn Qua kết điều tra 400/1250 hộ nuôi trồng thủy sản Vân Đồn năm 2019 cho thấy, tổng số hộ nuôi tu hài 152 hộ, đối tượng nuôi lồi Lutraria rhychaena, Jonas 1884 Với tổng diện tích ước đạt 209 ha, quy mơ diện tích trung bình ni thủy sản đạt 1,38 ha/hộ, quy mô nuôi tu hài trung bình đạt 0,18 ha/hộ Diện tích ni tu hài lớn đạt 9,25 xã Bản Sen, diện tích nhỏ ni tu hài đạt 1,5 xã Ngọc Vừng Quy mơ trung bình ni tu hài dao động từ 0,08-0,3 ha/hộ Độ mặn môi trường nước biển Vân Đồn ổn định, dao động từ 28,2 - 29,3‰, nằm ngưỡng phát triển tu hài (Hà Đức Thắng, 2010) Khảo sát cho thấy, mùa hè, lượng mưa lớn, độ mặn có giảm dao động khoảng 25,65 - 28,75‰; Mùa thu, đơng có lượng mưa thấp, độ mặn khơng có chênh lệch, dao động khoảng 28,5 29,5‰ Kết đánh giá ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng tỷ lệ sống tu hài trình bày cho thấy, độ mặn nước biển Vân Đồn hoàn toàn phù hợp để tu hài sinh trưởng phát triển Thêm vào đó, hộ dân ni tu hài có kinh nghiệm ni trung bình 12,68 ± 15,54 năm, tích lũy qua thực tiễn nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nhiều năm, trao đổi thông tin chia sẻ kinh nghiệm người tham gia nuôi tu hài địa phương Giá tu hài thương phẩm ổn định khoảng 100.000 – 120.000 nghìn đồng/ kg, cao loại nhuyễn thể khác, nhu cầu tiêu thụ lớn 3.2 Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L rhynchaena 3.2.1 Khảo sát liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gene 16S rRNA, COI lồi thuộc giống Lutraria cơng bố GenBank Để phát triển thị phân tử DNA nhằm nhận dạng phân biệt loài tu hài Việt Nam với loài thuộc giống Lutraria, tập hợp sở liệu riêng cho giống Lutraria xây dựng dựa kết sàng lọc trình tự liên quan đến lồi thuộc giống Lutraria có mặt GenBank Ngồi ra, trình tự vùng gene 16S rRNA COI loài Spisula solida (MG934910.1) khai thác để đối chứng xây dựng phân loại 14 So sánh trình tự DNA vùng gene 16S rRNA lồi thuộc giống Lutraria Từ kết so sánh trình tự DNA vùng gene 16S rRNA tu hài L rhynchaena so với trình tự DNA lồi tu hài cơng bố GenBank cho thấy, tu hài Việt Nam có mức tương đồng (ident) cao với loài L australia, mức độ tương đồng đạt 100%, so với lồi cịn lại mức độ tương đồng dao động từ 92,24-92,43% So sánh trình tự DNA vùng gene COI loài thuộc giống Lutraria Kết so sánh trình tự DNA vùng gene COI tu hài Việt Nam L rhynchaena so với trình tự DNA lồi tu hài công bố GenBank cho thấy, tu hài Việt Nam có mức độ tương đồng cao so với lồi L australia, mức tương đồng đạt 99,84 %, lại thấp so với loài L maxima, L arcuata, mức tương đồng đạt từ 86,73-87,18 % Nếu so sánh trình tự DNA có số giống lớn 97 % coi loài ngược lại số phân tích nhỏ 97 % coi khác loài (Stackebrandt Ebers, 2006) Điều khẳng định tu hài Việt Nam (L rhynchaena) loài tu hài L australis loài có tên đồng danh L philippinarum 3.2.2 Xây dựng phát sinh chủng loại vùng gene 16S rRNA, COI cho lồi tu hài Cây tiến hóa xây dựng từ trình tự gene 16S rRNA thuật tốn ML (Hình 3.1A), BI (Hình 3.1B) Từ sơ đồ phát sinh lồi hình 3.1A, B cho thấy, gồm có nhánh, nhánh giống Spisula, nhánh gồm lồi Lutraria, lồi L maxima lồi L arcuate, có quan hệ gần gũi với lồi L arcuate xếp vào phân nhánh, phân nhánh cịn lại gồm hai lồi L rhynchaena L australis có quan hệ gần gũi với Hình 3.1 Mối quan hệ tiến hóa lồi Lutraria dựa vào phân tích 15 trình tự gen 16S rRNA thuật tốn ML chương trình MEGA X (A) thuật tốn BI chương trình BEAST (B) Do đó, trình tự gene 16S rRNA sử dụng làm mã vạch để nhận dạng loài tu hài L rhynchaena với lồi khác Kết xây dựng tiến hóa từ trình tự vùng gen COI thuật tốn ML (Hình 3.2A) BI (Hình 3.2A) cho thấy, lồi thuộc giống Lutraria nằm nhóm lớn phát sinh lồi, nhánh cịn lại lồi đối chứng S solida Nhánh thứ phát sinh gồm hai phân nhóm, phân nhóm gồm hai nhóm nhỏ, nhóm thứ gồm lồi L rhynchaena L australis, nhóm thứ hai gồm L arcuate L maxima, hai nhóm có mối quan hệ gần gũi với nhau, phân nhánh lại L lutraria Kết nghiên cứu cho thấy, trình tự gene COI sử dụng làm mã vạch để nhận dạng loài tu hài L rhynchaena với lồi khác Hình 3.2 Mối quan hệ tiến hóa lồi Lutraria dựa vào phân tích trình tự gen COI sử dụng thuật tốn ML chương trình MegaX (A) thuật tốn BI chương trình BEAST (B) Như vậy, trình tự gene COI sử dụng chương trình MEGA X BEAST cho kết tương tự nhau, lồi L rhynchaena L australis nằm nhóm có quan hệ gần gũi với nhau, phân nhóm cịn lại gồm L maxima, Lutraria cịn lại Kết nghiên cứu cho thấy, trình tự COI sử dụng làm thị để nhận dạng loài L rhynchaena với loài khác giống Lutraria 3.2.3 Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài (L rhynchaena) Kết phân tích trình tự vùng gene 16S rRNA với chiều dài chung 438 nucleotide lồi Lutraria để đưa vùng trình tự đặc trưng cho loài L rhychaena dựa vào xuất nucleotide tiêng biệt trình tự, 16 phân tích tồn chuỗi, có 35 vị trí sai khác nucleotid lồi L rhynchaena với lồi cịn lại (L australis A1, L maxima, L arcuata G1 L arcuata G3) Trong đó, lồi tu hài Việt Nam L rhynchaena với lồi L australis A1 có điểm sai khác nucleotid số 66 67 Kết phân tích trình tự vùng gene COI lồi Lutraria sau dóng hàng chỉnh có chiều dài 615 nucleotide, xác định 143 vị trí sai khác giống Lutraria Giữa loài L rhynchana với loài L australis xác định vị trí sai khác nucleotide vị trí số 265, với lồi L maxima L arcuata, xác định 78 79 vị trí sai khác Giữa loài L rhynchana với loài L lutraria xác định 117 vị trí nucleotide sai khác Kết cho thấy khác biệt đáng kể vùng gene 16S COI Do đó, gene 16S COI sử dụng làm mã vạch DNA để nhận diện loài L rhynchaena với loài khác giống Lutraria 3.3 Giải trình tự hệ gene, hệ gene phiên mã tu hài (L rhychaena) 3.3.1 Thiết lập thư viện giải trình tự hệ gene tu hài Hai thư viện giải trình phát triển theo hướng dẫn nhà sản xuất, đảm bảo đủ điều kiện để tiến hành giải trình tự hệ gen Kết giải trình tự phân tích liệu gene tu hài tạo thành từ 122 Gbp (55,16 Gbp + 66,77 Gbp) lần đọc ngắn với độ dài ghép nối (150 bp) 14 Gbp lần đọc dài Độ dài trung bình 4.960 bp, đoạn dài 58.804 bp, đoạn ngắn 200 bp Ngoài ra, 34 Gbp đọc phiên mã tạo phục vụ cho việc dự đoán hệ gene 3.3.2 Thiết lập thư viện giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài Thư viện tao thành kiểm tra đảm bảo chất lượng đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu Illumina để sử dụng để giải trình tự Kết giải trình tự phân tích liệu hệ gene phiêm mã tu hài tạo thành với độ dài đoạn đọc 150bp Ngoài ra, 34 Gbp đọc phiên mã tạo phục vụ cho việc dự đốn hệ gene 3.3.3 Ước lượng kích thước gene Phân tích kmer liệu xác định kích thước gene tu hài ước tính nằm khoảng từ 545 đến 547 Mbp Dựa kết phân tích từ trình tự đọc ngắn trình tự đọc dài với độ bao phủ giải trình tự 200X 25X 17 3.3.4 Lắp ráp gene tu hài Lắp ráp hệ gene tu hài bao gồm 1.502 ba, chiều dài vùng gene N50 tương ứng 1,84 Mbp kích thước lắp ráp 586,5 Mbp Mức độ hồn chỉnh q trình lắp ráp đạt 95,9% Kết tạo tổ hợp hệ gene có dung lượng 544 Mbp chứa 622 ba với kích thước chiều dài vùng gene N50: 2,14 Mbp, chứa 95,6% trình tự đọc ngắn (Illumina) Độ xác đạt 95,8%, có 1,5% BUSCO phát Kết giải trình tự hệ gene tu hài gửi công bố GenBank 3.3.5 Lắp ráp hệ gene phiên mã, dự đoán thích hệ gene tu hài Kết tạo đoạn đọc RNA đặc hiệu dạng sợi ngắn, với chiều dài 34,6 Gbp, hệ gene phiên mã có độ dài 295.234 ba, độ hồn chỉnh đạt 83,9% Tổng cộng 96,4% số lần đọc RNA đối chiếu với lắp ráp có 79% chỉnh sửa gene theo nhận biết đoạn nối Kết thích hệ gene tu hài xác định 26.380 gene mã hóa protein (AED ≤ 0,5), 89,8% số thích mặt chức 3.3.6 Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại tìm kiếm đa hình Kết gióng hàng trình tự contig sàng lọc phát tổng số 4.903.576 điểm đa hình nucleotide đơn (SNP) với ước tính tỷ lệ dị hợp tử đạt 0,90%, sử dụng phần mềm GenomeScope dựa giá trị kmer xác định tỷ lệ dị hợp tử đạt 1,60% Như tỷ lệ dị hợp tử nằm giới hạn cho phép loài hai mảnh vỏ nghiên cứu công bố trước (Giá trị dao động từ 0,51 đến 2,02%) 3.3.6 Lắp ráp hệ gene phiên mã Kết tập hợp hệ gene phiên mã có độ dài 295.234 ba, chiều dài 34,6 Gbp BUSCO xử lý với độ hoàn chỉnh đạt 83,9% Tổng cộng 96,4% số lần đọc RNA đối chiếu với lắp ráp có 79% chỉnh sửa hệ gene theo nhận biết đoạn nối Cả hai tỷ lệ liên kết chất lượng gene phiên mã đủ đảm bảo để thực việc dự đoán gene 3.3.7 Dự đốn thích hệ gene tu hài Dựa kết lắp ráp cho xác định 26.380 gene mã hóa protein (AED ≤ 0,5), 89,8% số thích mặt chức năng, 18 protein có thích chức liên kết 3.3.8 So sánh đặc điểm hệ gene L rhynchaena với loài hai mảnh vỏ Hiện có 13 gene loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ giải trình tự cơng bố Dựa (http://www.genomesize.com) sở liệu kích thước gen động vật, kích thước gen cuả loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thay đổi nhiều, nhóm Chúng nằm khoảng từ 0,54 Mb đến 1,8 Gb (trung bình 1,6 Gb) thấp so với gen lồi chân đầu (trung bình 3,8 Gb) chân bụng (trung bình 2,2 Gb), kích thước phản ánh phần số lượng trình tự lặp lại gene Kích thước gen lớn loài thân mềm hai mảnh vỏ giải mã M philippinarum (2,38 Gb), tiếp đến Venustaconcha ellipsiformis (1,8 Gb), lồi L rhychaena 0,55 Mb Tỷ lệ yếu tố lặp lại loài hai mảnh vỏ nằm khoảng từ 25% (P yessoensis) đến 60% (V ellipsiformis), với loài L rhychaena đạt 29% 3.4 Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tu hài Kết lựa chọn 30 cá thể thuộc 63 gia đình có giá trị EBV cao 30 cá thể thuộc 42 gia đình có giá trị EBV thấp, giá trị chọn giống mô tả Bảng 3.2 Bảng 3.2 Giá trị chọn giống ước tính cho tính trạng tăng trưởng hai nhóm tu hài Nhóm tăng trưởng nhanh Nhóm tăng trưởng chậm Số lượng mẫu (con) 30 30 Số lượng gia đình 63 43 Khối lượng trung bình (g) 56,4 ± 0,20 38,5 ± 0,18 EBV trung bình 32,6 ± 28,3 -21,7 ± 0,27 Giá trị Ghi chú: Số liệu biểu diễn dạng trung bình ± độ lệch chuẩn 3.4.1 Xây dựng thư viện giải trình tự ezRAD Kết phát triển tổng số 02 thư viện gene, gồm 01 thư viện gene (DNA library) cho tu hài tăng trưởng nhanh 01 thư viện gene cho nhóm tu hài tăng trưởng chậm Giải trình tự thư viện phân tích Stacks