(Đồ án HCMUTE) tinh sạch và đánh giá các tính chất hóa lý, đặc tính chức năng của protein concentrate từ đậu ngự (phaseolus lunatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC TÍNH CHẤT HĨA LÝ, ĐẶC TÍNH CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN CONCENTRATE TỪ ĐẬU NGỰ (Phaseolus lunatus) GVHD: PHẠM THỊ HOÀN SVTH: NGUYỄN DƯƠNG HOÀNG HUY TRẦN VŨ HỒN THÀNH SKL008893 Tp Hồ Chí Minh, tháng 08/2022 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAO NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022–18116068 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC TÍNH CHẤT HĨA LÝ, ĐẶC TÍNH CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN CONCENTRATE TỪ ĐẬU NGỰ (Phaseolus lunatus) SVTH: NGUYỄN DƯƠNG HOÀNG HUY – 18116068 TRẦN VŨ HOÀNG THÀNH GVHD: TS PHẠM THỊ HOÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 i – 18116110 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAO NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022–18116068 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC TÍNH CHẤT HĨA LÝ, ĐẶC TÍNH CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN CONCENTRATE TỪ ĐẬU NGỰ (Phaseolus lunatus) SVTH: NGUYỄN DƯƠNG HOÀNG HUY – 18116068 TRẦN VŨ HOÀNG THÀNH – 18116110 GVHD: TS PHẠM THỊ HOÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH i i ii i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới tất quý thầy cô, công nhân viên chức trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật nói chung quý thầy Khoa Cơng nghệ Hóa học Thực phẩm nói riêng tạo mơi trường học tập tốt, đầy động, sáng tạo chương trình học gần gũi, thiết thực Trong suốt năm học tập trường, truyền đạt kiến thức kỹ vô quý báu ngành Công nghệ thực phẩm Đặc biệt, xin cảm ơn T.S Phạm Thị Hoàn – Trưởng ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Đào tạo Chất lượng cao, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM Cô hỗ trợ dạy tận tình, hướng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho chúng tơi từ hình thành ý tưởng đến hồn thành khóa luận tốt nghiệp Chúng tơi thật biết ơn điều xin ghi nhớ lời dạy cô Bên cạnh đó, chúng tơi xin gửi lời cảm ơn đến cô Hồ Thị Thu Trang – chuyên viên phụ trách phịng thí nghiệm xưởng thực hành Bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm, khoa Cơng nghệ Hóa Học Thực phẩm hỗ trợ tận tình mặt dụng cụ, máy móc, thiết bị phục vụ cho việc thực nghiệm Chúng xin cảm ơn quý thầy phụ trách xưởng cơng nghệ phịng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi không gian thực nghiệm Sau cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm, giúp đỡ, ln kề vai sát cánh tạo điều kiện tốt để chúng tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Trong trình thực đề tài, khó tránh khỏi sai sót nên chúng tơi mong nhận góp ý q thầy để luận văn chúng tơi hồn thiện Một lần xin chân thành cảm ơn kính chúc sức khỏe! iii i iv i v i vi i vii i viii i Bảng 4.10 Kết độ nhớt ban đầu kết thúc protein concentrate Chu kỳ Chu kỳ Độ nhớt ban Độ nhớt kết Độ nhớt ban Độ nhớt kết đầu (Pa.s) thúc (Pa.s) đầu (Pa.s) thúc (Pa.s) P3% 33,21 3,804 3,387 30,8 G95 168,04 4,047 4,042 173,1 Mẫu Hình 4.10 Sự thay đổi độ nhớt protein concentrate theo tốc độ cắt chu kỳ [A] chu kỳ [B] B 180 180 150 150 120 120 Độ nhớt (mPas) Độ nhớt (mPas) A 90 60 90 60 30 30 0 100 G95 200 ɣ̇ in 1/s 300 400 100 200 ̇ɣ in 1/s 300 400 P3% Kết phân tích độ nhớt thể bảng 4.11 cho thấy độ nhớt mẫu protein trải qua q trình biến tính nhiệt độ 95oC vào 25 phút có giá trị cao so với mẫu protein nhiệt độ 25oC Trong chu kỳ thấy rõ khác biệt độ nhớt mẫu G95 168,04 (Pa.s) cao nhiều so với mẫu P3% 33,21 (Pa.s) Ngun nhân q trình biến tính protein nhiệt độ cao làm cho cấu trúc bậc cao protein dễ bị phá huỷ, liên kết phân tử bị đứt lượng lớn nhóm chức kỵ nước đưa ngồi có lợi cho tương tác protein – protein [69] Các mạch polypeptit duỗi ra, gần nhau, tiếp xúc với thông qua mạng lưới khơng gian ba chiều mà vị trí tiếp xúc mạch nút Các phần lại hình thành mạng lưới khơng gian vơ định hình, rắn, có chứa đầy pha phân tán nước Các nút mạng tạo liên kết hydro nhóm peptit với tăng độ nhớt protein [69] 43 i Đồ thị liên hệ độ nhớt tốc độ cắt mẫu P3% G95 hình ( 4.10) cho thấy độ nhớt khoảng tốc độ cắt từ - 50 1/S giảm mạnh, sau có xu hướng ổn định kết thúc Điều lý giải tốc độ cắt tăng lên, làm thay đổi hướng hạt vật liệu cắt gây giảm ma sát bên hạt vật liệu [70] 44 i CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Nghiên cứu rút kết luận sau: Sử dụng phương pháp kết tủa đẳng điện nhiệt độ thấp kết hợp xử lí enzyme nâng cao hàm lượng protein lên khoảng 81% Hiệu suất thu hồi protein đạt 71.3% hiệu suất trích ly tương đối cao Thành phần dinh dưỡng protein concentrate từ đậu ngự gồm: Kết nghiên cứu cho thấy quy trình thu nhận protein concentrate phương pháp kết tủa đẳng điện pH 4,5 nhiệt độ 4°C cho hiệu suất thu hồi đạt 71.3% Hàm lượng protein chế phẩm cải thiện lên 81% chất béo, tro carbohydrate 0,2%, 4,03%, 7,3% Hàm lượng amino acid protein concentrate từ đậu ngự tương đương với chế phẩm protein isolate từ đậu ngự nghiên cứu trước Khối lượng phân tử cấu trúc bậc hai protein concentrate từ đậu ngự thể cấu trúc protein hoàn chỉnh với phân đoạn protein đặc trưng nhóm protein họ đậu Protein concentrate từ đậu ngự nguồn protein thực vật dùng để thay protein từ động vật protein từ trứng, thịt, sữa, lợi ích sức khỏe mà chúng mang lại Ngồi chúng cịn tăng giá trị dinh dưỡng cải thiện mùi vị, kết cấu sản phẩm nguồn thực phẩm bổ sung protein cho người có chế độ ăn chay trường 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu hoàn thiện tối ưu quy trình thu nhận protein concentrate, nâng cao chất lượng chế phẩm Do đó, nghiên cứu sau chúng tơi mong tiến hành nghiên cứu vấn đề sau đây: Khảo sát ảnh hưởng chế phẩm enzyme đến đặc tính hóa lý, chức protein concentrate isolate từ đậu ngự Kết hợp nhiều loại enzyme để cải thiện độ tinh protein Sử dụng phương pháp đại phương pháp siêu âm, siêu lọc, lọc membrane để thu hồi protein concentrate so sánh hiệu suất thu hồi, tính cơng nghệ với chế phẩm phương pháp kết tủa đẳng điện 45 i TÀI LIỆU THAM KHẢO Tharanathan, R., S.J.T.i.F.S Mahadevamma, and Technology, Grain legumes—a boon to human nutrition 2003 14(12): p 507-518 Geil, P.B and J.W.J.J.o.t.A.C.o.N Anderson, Nutrition and health implications of dry beans: a review 1994 13(6): p 549-558 Doyle, J.J.J.A.R.o.E and Systematics, Phylogeny of the legume family: an approach to understanding the origins of nodulation 1994: p 325-349 Ogunwolu, S., et al., Production of protein concentrate and isolate from cashew (Anacardium occidentale L.) nut 2010 10(5) Brink, M., G Belay, and J De Wet, Plant resources of tropical Africa 1: Cereals and pulses 2006: PROTA Foundation Wageningen, The Netherlands Maphosa, Y and V.A.J.F.f.-i.h.t.a.f Jideani, The role of legumes in human nutrition 2017 1: p 13 Staniak, M., J Księżak, and J.J.O.a.t.s Bojarszczuk, Mixtures of legumes with cereals as a source of feed for animals 2014(6): p 123-145 Luis, C.-G., et al., Lima bean (Phaseolus lunatus) protein hydrolysates with ACE-I inhibitory activity 2012 2012 Chel-Guerrero, L., et al., Functional properties of flours and protein isolates from Phaseolus lunatus and Canavalia ensiformis seeds 2002 50(3): p 584-591 10 Hamad, A.M and M.L.J.J.o.F.S FIELDS, Evaluation of the protein quality and available lysine of germinated and fermented cereals 1979 44(2): p 456-459 11 Betancur, D.A., et al., Physicochemical and functional characterization of baby lima bean (Phaseolus lunatus) starch 2001 53(5): p 219-226 12 Meredith, F., et al., Soluble carbohydrates oligosaccharides and starch in lima bean seeds 1988 53(3): p 768-771 13 EKANAYAKE, A and P.E.J.J.o.f.s NELSON, Effect of Thermal Processing on Lima Bean Vitamin B‐6 Availability 1990 55(1): p 154-157 14 Suresh, C.J.A.j.o.a.r., Assessment of functional properties of different flours 2013 8(38): p 4849-4852 15 DU CODEX, R.D.C., codex aLimentarius commission 1989 16 Lusas, E.W and M.N.J.T.J.o.n Riaz, Soy protein products: processing and use 1995 125(suppl_3): p 573S-580S 46 i 17 Shurtleff, W and A Aoyagi, History of modern soy protein ingredients-isolates, concentrates, and textured soy protein products (1911-2016): Extensively annotated bibliography and sourcebook 2016: Soyinfo Center 18 Sullivan, G and L.J.N.c Davenport, Dry edible beans: a New crop opportunity for the east north central region 1993: p 585-588 19 Osborne, T.B., The vegetable proteins 1924: Longmans, Green and Company 20 Russin, T.A., et al., Alternative techniques for defatting soy: a practical review 2011 4(2): p 200-223 21 Yang, F., et al., A novel lipid extraction method from wet microalga Picochlorum sp at room temperature 2014 12(3): p 1258-1270 22 Coffman, G and V.J.J.o.F.T Garcia, Functional properties and amino acid content of protein isolate 1977 12: p 473 23 Croy, R., et al., The purification and characterization of a third storage protein (convicilin) from the seeds of pea (Pisum sativum L.) 1980 191(2): p 509-516 24 Yu, J., M Ahmedna, and I.J.F.c Goktepe, Peanut protein concentrate: Production and functional properties as affected by processing 2007 103(1): p 121-129 25 Garba, U., S.J.I.j.o.c.r Kaur, and review, Protein isolates: Production, functional properties and application 2014 6(3): p 35 26 Thivend, P., C MERCIER, and A Guilbot, Determination of starch with glucoamylase, in General Carbohydrate Method 1972, Elsevier p 100-105 27 Southall, S.M., et al., The starch‐binding domain from glucoamylase disrupts the structure of starch 1999 447(1): p 58-60 28 Polanco-Lugo, E., et al., Effects of sequential enzymatic hydrolysis on structural, bioactive and functional properties of Phaseolus lunatus protein isolate 2014 34: p 441-448 29 Preece, K., et al., Whole soybean protein extraction processes: A review 2017 43: p 163-172 30 Walker, J.M., SDS polyacrylamide gel electrophoresis of proteins, in The protein protocols handbook 2002, Springer p 61-67 31 Gallagher, S.R.J.C.p.e.l.t., SDS‐polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE) 2008(1): p 7.3 1-7.3 25 32 Laemmli, U.K.J.n., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 1970 227(5259): p 680-685 47 i 33 Marimuthu, M., P.J.A.J.o.P Gurumoorthi, and C Research, Phytochemical screening and FT-IR studies on wild and common south indian legumes 2013 6(2): p 141-144 34 Hesse, M., H Meier, and B Zeeh, Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie Georg Thieme Verlag pp 456 2005 35 Krimm, S and J.J.A.i.p.c Bandekar, Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins 1986 38: p 181-364 36 Kumar, T.S., Physical and chemical characterization of biomaterials, in Characterization of Biomaterials 2013, Elsevier p 11-47 37 Julianti, E., H Herla Rusmarilin, and Y.J.J.o.t.S.S.o.A.S Ridwansyah, E., 2017, Functional and rheological properties of composite flour from sweet potato, maize, soybean and xanthan gum p 171-177 38 Khôi, N.V., et al., ẢNH HƯỞNG CỦA POLYME SIÊU HẤP THỤ NƯỚC ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA CÁC LOÀI CÂY HỌ ĐẬU TRỒNG TRÊN BÃI THẢI KHAI THÁC THAN–MỎ THAN NÚI HỒNG-TỈNH THÁI NGUYÊN 2011 49(3) 39 Freitas, M.L.F., K.M Albano, and V.R.N.J.P Telis, Characterization of biopolymers and soy protein isolate-high-methoxyl pectin complex 2017 27: p 62-67 40 Gumus, C.E., E.A Decker, and D.J.J.F.B McClements, Formation and stability of ω3 oil emulsion-based delivery systems using plant proteins as emulsifiers: Lentil, pea, and faba bean proteins 2017 12(2): p 186-197 41 Jenkins, J.A., et al., Evolutionary distance from human homologs reflects allergenicity of animal food proteins 2007 120(6): p 1399-1405 42 Koyoro, H and J.J.C.C Powers, Functional properties of pea globulin fractions 1987 64(2): p 97-101 43 Keivaninahr, F., et al., Prediction of emulsification behaviour of pea and faba bean protein concentrates and isolates from structure–functionality analysis 2021 11(20): p 12117-12135 44 Barbour, M.E., et al., Inhibition of hydroxyapatite dissolution by whole casein: the effects of pH, protein concentration, calcium, and ionic strength 2008 116(5): p 473478 45 Aremo, M and O Olaofe, Functional properties of some Nigerian varieties of legume seed flours and flour concentration effect on foaming and gelation properties 2007 46 Ahmadifard, N., et al., Comparison the effect of three commercial enzymes for enzymatic hydrolysis of two substrates (rice bran protein concentrate and soy-been protein) with SDS-PAGE 2016 53(2): p 1279-1284 48 i 47 Bilgi, B., S.J.E.F.R Çelik, and Technology, Solubility and emulsifying properties of barley protein concentrate 2004 218(5): p 437-441 48 Brinegar, C., et al., High-cysteine 2S seed storage proteins from quinoa (Chenopodium quinoa) 1996 44(7): p 1621-1623 49 Alasmre, F.A and H.A.J.C Alotaibi, Plant-based diet: a potential intervention for heart failure 2020 12(5) 50 Idouraine, A., et al., Composition of tepary bean (Phaseolus acutifolius) of the southwestern US and northern Mexico 1995 33(3): p 139-147 51 López-Ibarra, C., et al., Protein Concentrates on Tepary Bean (Phaseolus acutifolius Gray) as a Functional Ingredient: In silico Docking of Tepary Bean Lectin to Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma 2021 8: p 661463 52 Saguer, E., P Alvarez, and A.J.F.h Ismail, Heat-induced denaturation/aggregation of porcine plasma and its fractions studied by FTIR spectroscopy 2012 27(1): p 208219 53 Lin, M., et al., Infrared (IR) spectroscopy—near-infrared spectroscopy and midinfrared spectroscopy 2009: p 119-143 54 Kong, J and S.J.A.b.e.b.S Yu, Fourier transform infrared spectroscopic analysis of protein secondary structures 2007 39(8): p 549-559 55 Gallagher, W.J.C.m.C., FTIR analysis of protein structure 2009 455 56 Jackson, M., H.H.J.C.r.i.b Mantsch, and m biology, The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure 1995 30(2): p 95-120 57 Rosenberg, M., I.J Kopelman, and Y.J.J.o.F.S TALMON, A scanning electron microscopy study of microencapsulation 1985 50(1): p 139-144 58 Panah, N.G., R Atkin, and T Sercombe The effect of drying method on the surface structure of mesoporous sol-gel derived bioactive glass-ceramic in IOP Conference Series: Materials Science and Engineering 2020 IOP Publishing 59 Xu, L and L.J.F.R.I Diosady, Interactions between canola proteins and phenolic compounds in aqueous media 2000 33(9): p 725-731 60 Foh, M.B.K., et al., Influence of pH shift on functional properties of protein isolated of tilapia (Oreochromis niloticus) muscles and of soy protein isolate 2012 5(6): p 21922200 61 Branch, S and S.J.I.F.R.J Maria, Evaluation of the functional properties of mung bean protein isolate for development of textured vegetable protein 2017 24(4): p 15951605 49 i 62 Zayas, J.F., Functionality of proteins in food 1997: Springer science & business media 63 Aryee, A.N., J.I.J.J.o.f.p Boye, and preservation, Comparative study of the effects of processing on the nutritional, physicochemical and functional properties of lentil 2017 41(1): p e12824 64 Shoaib, A., et al., Use of pea and rice protein isolates as source of meat extenders in the development of chicken nuggets 2018 42(9): p e13763 65 Price, K., et al., The chemistry and biological significance of saponins in foods and feedingstuffs 1987 26(1): p 27-135 66 Kinsella, J.E.J.J.o.t.A.O.C.S., Functional properties of soy proteins 1979 56(3Part1): p 242-258 67 Sathe, S., S Deshpande, and D.J.J.o.F.S Salunkhe, Functional properties of winged bean [Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC] proteins 1982 47(2): p 503-509 68 Kaur, M and N.J.F.C Singh, Characterization of protein isolates from different Indian chickpea (Cicer arietinum L.) cultivars 2007 102(1): p 366-374 69 Joshi, M., et al., Physicochemical and functional properties of lentil protein isolates prepared by different drying methods 2011 129(4): p 1513-1522 70 Behnia, A., et al., Rheological properties of low fat yogurt containing cress seed gum 2013 4(9B): p 29 50 i PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp xác định hàm lượng ẩm Phương pháp sử dụng: AOAC 925.09 Cách tiến hành: Rửa đĩa cho làm khô cách sấy nhiệt độ 105 – 110oC, đem cân đến khối lượng không đổi Cân xác khoảng gam mẫu đĩa làm khơ làm nhỏ kích thước trước sấy Sau – thời gian nên tính từ thời điểm lò đạt 105°C sau đặt đĩa vào, lấy để nguội bình hút ẩm cân Đĩa phải đặt trở lại lò khoảng thời gian nửa đạt khối lượng khơng đổi Thơng số kỹ thuật kích thước đĩa cần xác định Cách tính: Độ ẩ𝑚 (%) = Trong đó: 𝑤1 − 𝑊2 × 100 𝑊1 − 𝑊 W1: (g) khối lượng đĩa vật liệu trước sấy W2: (g) khối lượng đĩa vật liệu sau sấy W: (g) khối lượng đĩa Phụ lục 2: Phương pháp xác định hàm lượng protein Phương pháp sử dụng: Kjeldahl AOAC 979.09 Lượng protein xác định từ hàm lượng nitrogen hữu phương pháp Kjeldahl Các hợp chất nitrogen khác chuyển thành ammonium sulphate cách cho chúng phản ứng với acid sulphuric đậm đặc Ammonium sulphate hình hành thủy phần với dung dịch kiềm, điển hình NaOH Lượng ammonia giải phóng hấp thụ 1ượng dư dung dịch acid chuẩn, sau chuẩn độ lại với dung dịch kiềm chuẩn Hóa chất: Sulfuric acid đậm đặc – trọng lượng riêng 1,84; 30% NaOH – hòa tan 300 mg NaOH vào 1000 mL nước; Dung dịch Hydrochloric acid chuẩn – 0,1 N; Dung dịch NaOH 10%; Chất thị Phenolphtalein (C20H14O4), Kali sunfat (K2SO4), Boric Acid (H3BO3), Chất thị Methyl Red– hòa tan 0,5 mg methyl red 100 mL cồn, Chất thị Bromocresol Green (C21H14Br4O5S), Sulfat pentahydrat (CuSO4.5H2O) Cách tiến hành: Vơ hóa mẫu: cân 0,5g mẫu bỏ vào ống Kjeldahl Sau cho 0,075 g chất xúc tác CuSO4, 2.5g chất trợ sôi K2SO4, 10 mL H2SO4 đậm đặc vào ống Kjeldahl Chuyển ống Kjeldahl vào thiết bị gia nhiệt, đậy kín thiết bị hút khí độc Gia nhiệt, phân hủy mẫu trở nên suốt Chưng cất: Mẫu sau vơ hóa chuyển qua thiết bị chưng cất Đặt bình erlen đầu thiết bị chứa 10 mL dung dịch (Boric Acid (H3BO3) + Methyl Red + 51 i Bromocresol Green) Cài đặt chương trình cho máy cho máy chạy Kết thúc trình lấy bình erlen đưa chuẩn độ Chuẩn độ: Lấy erlen khỏi hệ thống; sau chuẩn độ HCl 0,1N Khi dung chuyển màu hồng nhạt, đọc buret xác đến 0,05 mL Tính tồn Hàm lượng phần trăm nitơ mẫu: (𝑎 − 𝑏) × 0.0014 × 100 𝑚 Wn: hàm lượng nitơ phần trăm khối lượng 𝑊𝑛 = Trong đó: a: (mL) thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu b: (mL) thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng m: (g) khối lượng mẫu đem vơ hóa Thành phần phần trăm hàm lượng protein mẫu xác định theo công thức: 𝑊𝑝 = 𝑊𝑛 × 6.25 Trong đó: Wp: hàm lượng protein thô Wn: hàm lượng nitơ phần trăm khối lượng 6,25: hệ số chuyển đổi hàm lượng nitơ thành hàm lượng protein thô Phụ lục 3: Phương pháp xác định hàm lượng chất béo Phương pháp sử dụng: Sử dụng phương pháp Soxhlet 4.5.01 có số thay đổi Hóa chất: Dimethyl ether petroleum ether Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu đậu sấy khơ hồn tồn sau nghiền mịn Cho khoảng 2g mẫu đậu nghiền mịn vào túi giấy chuyên dùng cho Soxhlet xác định khối lượng giấy gói Chuyển mẫu vào trụ chiết Sau đó, đổ dung mơi bao gồm dimethyl ether petroleum ether theo tỷ lệ 1:1 từ phía ống sinh hàn chảy qua trụ chiết cuối chảy xuống bình đựng dung mơi Mở nguồn nước làm lạnh ống sinh hàn bật nguồn nhiệt để làm bay dung môi Dung môi bay làm lạnh hệ thống ống sinh hàn ngưng tụ, chảy xuống trụ chiết thực q trình trích ly chảy xuống bình đựng dung mơi Q trình trích ly hồn tồn lipid kéo dài khoảng – 12 tiếng Kiểm tra mẫu trích ly hồn tồn cách lấy dung mơi từ trụ chiết nhỏ lên giấy lọc Dung môi bay hồn tồn khơng để vết loang dầu kết thúc Tính thành phần phần trăm khối lượng lipid thu Tính tốn: Hàm lượng chất béo mẫu tính % theo công thức: 𝑚1 − 𝑚2 % 𝐶ℎấ𝑡 𝑏é𝑜 = × 100 𝐺 52 i Trong đó: m1: (g) khối lượng giấy m2: (g) khối lượng giấy khối lượng chất béo sau sấy G: (g) khối lượng mẫu Phụ lục 4: Phương pháp xác định hàm lượng tro Phương pháp sử dụng: AOAC 923.03 Cách tiến hành: Nung chén sứ chén kim loại rửa lò nung tới 550–600℃ đến trọng lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001g Cho vào chén khoảng 2g mẫu, cân tất cân phân tích với độ xác Cho tất vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ 550–600℃ Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thời gian nung thường khoảng 6–7 Trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm cân với độ xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân trọng lượng không đổi Kết gữa lần nung cân liên tiếp không cách 0,0005g cho 1g mẫu thử Cách tính: Tro tổng (%) = Trong đó: W2 − W × 100 W1 − W W1: (g) khối lượng chén nung vật liệu sấy khô W2: (g) khối lượng chén nung tro W: (g) khối lượng chén nung Phụ lục 2: Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate Phương pháp sử dụng: Sử dụng phương pháp Phenol – sulfuric axit AOAC 988.12 Hóa chất: Dung dịch glucose chuẩn 100 mg/L; Phenol 80% (w/w) nước: pha cách thêm 20 g nước cất vào 80 g tinh thể phenol tinh khiết; Axit sulfuric đậm đặc Cách tiến hành: Phản ứng với H2SO4 phenol: lấy ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm dung dịch với thể tích bảng bên Các ống 1–6 để dựng đường chuẩn, ống 7–9 mẫu protein lặp lần Các phản ứng ống xảy phần nhờ nhiệt tỏa thêm H2SO4 vào dung dịch, H2SO4 cần cho rơi thẳng xuống bề mặt dung dịch ống nghiệm để chảy dọc theo thành ống nghiệm Sau lần thêm chất lỏng vào ống nghiệm lắc kỹ tay máy lắc vortex Để yên 53 i ống nghiệm 10 phút, sau để bể điều nhiệt để làm nguội đến nhiệt độ phòng trước đo độ hấp thụ Số thứ tự 7–9 Dung dịch glucose gốc (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nước cất (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Mẫu pha loãng (mL) 0 0 0 0,5 Phenol 5% (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 H2SO4 đặc (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Đo độ hấp thụ: đeo găng tay rót mẫu vào cuvet Để mẫu chuẩn với µg glucose làm mẫu trắng (blank) đo độ hấp thụ 490 nm mẫu từ đến so với mẫu trắng Trước cho cuvet vào đo cần kiểm tra bề mặt mà ánh sáng qua có bị ướt hay có vết bẩn hay khơng, có phải lau miếng vải mềm Phụ lục 6: Kết thành phần acid amin protein concentrate 54 i 55 i 56 i S i K L 0