Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (curcuma zedoaria roscoe

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa công bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tác giả luận án Trương Thị Phương Lan ii BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurine CoA coezyme A cs cộng CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide CzDCS Curcuma zedoaria DCS CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1 CzCURS2 Curcuma zedoaria CURS2 CzCURS3 Curcuma zedoaria CURS3 ĐC đối chứng DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl dw dry weight (khối lượng khô) FRAP ferric reducing antioxidant power fw fresh weight (khối lượng tươi) HPLC high-performance liquid chromatography IBA 3-indolebutyric acid KIN kinetin MAPK mitogen-activated protein kinase MeJA methyl jasmonate MS Murashige and Skoog (1962) NAA naphthaleneacetic acid NO nitric oxide PAA phenyl acetic acid ROS reactive oxygen species SA salicylic acid SNP sodium nitroprusside YE yeast extract (dịch chiết nấm men) iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGHỆ ĐEN 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học củ nghệ đen 1.1.3.1 Tinh dầu 1.1.3.2 Curcuminoid 1.1.4 Công dụng nghệ đen 1.1.4.1 Hoạt tính giảm đau 1.1.4.2 Hoạt tính kháng ung thư 1.1.4.3 Hoạt tính bảo vệ gan 1.1.4.4 Hoạt tính kháng viêm chống loét 1.1.4.5 Hoạt tính chống oxy hóa 10 1.1.4.6 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 10 1.1.4.7 Các hoạt tính khác 11 1.3 ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG 15 iv 1.3.1 Elicitor 15 1.3.1.1 Khái niệm 15 1.3.1.2 Phân loại 15 1.3.1.3 Cơ chế kích kháng 16 1.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kích kháng 18 1.3.2 Ứng dụng elicitor 20 1.3.2.1 Elicitor sinh học 20 1.3.2.2 Elicitor phi sinh học 26 1.4 CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID 27 1.4.1 Các đường sinh tổng hợp curcuminoid 27 1.4.2 Vai trò gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid 31 1.4.2.1 Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS) 31 1.4.2.2 Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS) 31 1.4.2.3 Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase 32 1.4.2.4 Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase 33 1.4.2.5 Các gen khác 34 1.4.3 Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp 35 1.4.4 Cải thiện biểu gen xử lý elicitor 37 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Nuôi cấy in vitro nghệ đen 40 2.2.1.1 Khử trùng mẫu vật 40 2.2.1.2 Tái sinh chồi tạo rễ in vitro 41 2.2.1.3 Nuôi cấy callus 41 2.2.1.4 Nuôi cấy tế bào 41 2.2.2 Phân lập gen tổng hợp curcuminoid 42 2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 42 v 2.2.2.2 Khuếch đại PCR 43 2.2.2.3 Tạo dòng giải gen 43 2.2.2.4 Xây dựng phả hệ 45 2.2.3 Xác định biểu gen tổng hợp curcuminoid 46 2.2.3.1 Xử lý elicitor 46 2.2.3.2 Phân tích RT-PCR 46 2.2.3.3 Phân tích HPLC 48 2.2.4 Xử lý thống kê 49 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO 50 3.1.1 Nhân giống nghệ đen in vitro 50 3.1.1.1 Tái sinh chồi 50 3.1.1.2 Tạo rễ in vitro 52 3.1.2 Nuôi cấy callus 54 3.1.2.1 Ảnh hưởng 2,4-D KIN 54 3.1.2.2 Ảnh hưởng 2,4-D NAA 55 3.1.2.3 Ảnh hưởng 2,4-D AgNO3 55 3.1.3 Nuôi cấy tế bào nghệ đen 57 3.2 NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 59 3.2.1 Phân lập gen 59 3.2.2 Phân tích biểu gen tổng hợp curcuminoid 68 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID 72 3.3.1 Thăm dò ảnh hưởng elicitor lên biểu gen tổng hợp curcuminoid 72 3.3.2 Biểu gen tổng hợp curcuminoid 74 3.3.3 Tích lũy curcumin 76 Chương BÀN LUẬN 79 vi 4.1 THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO 79 4.1.1 Nhân giống nghệ đen in vitro 79 4.1.2 Nuôi cấy callus tế bào nghệ đen 81 4.2 PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 83 4.2.1 Phân lập gen tổng hợp curcuminoid 83 4.2.2 Sự biểu gen tổng hợp curcuminoid 85 4.3 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 85 4.3.1 Đặc điểm elicitor sử dụng nghiên cứu 85 4.3.1.1 Dịch chiết nấm men 85 4.3.1.2 Salicylic acid 87 4.3.2 Ảnh hưởng elicitor lên sinh trưởng tế bào 89 4.3.3 Ảnh hưởng elicitor lên mức độ biểu gen 90 4.3.4 Ảnh hưởng elicitor lên khả sản xuất curcumin 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95 KẾT LUẬN 95 KIẾN NGHỊ 95 DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại elicitor khác 17 Bảng 1.2 Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả tích lũy hợp chất thứ cấp nuôi cấy in vitro 21 Bảng 2.1 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng CDS gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 45 Bảng 2.2 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng thị gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 47 Bảng 3.1 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tái sinh chồi chồi in vitro nguyên vẹn 51 Bảng 3.2 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tái sinh chồi chồi in vitro chẻ đôi 52 Bảng 3.3 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tạo rễ chồi in vitro 53 Bảng 3.4 Ảnh hưởng KIN từ 0,5-2 mg/L 2,4-D mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA từ 0,5-2 mg/L 2,4-D mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 56 Bảng 3.6 Ảnh hưởng 2,4-D mg/L AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 56 Bảng 3.7 Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 loại mô khác nghệ đen 70 Bảng 3.8 Mật độ băng DNA vùng đặc hiệu ở gen tổng hợp curcuminoid 76 Bảng 3.9 Ảnh hưởng elicitor lên sinh trưởng tích lũy curcumin tế bào nghệ đen 77 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học curcumin Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp curcuminoid nghệ vàng 30 Hình 1.3 Vai trò gen DCS CURS tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng 32 Hình 2.1 Cây nghệ đen 39 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 40 Hình 2.3 Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ) 44 Hình 2.4 Vị trí primer xi ngược gen CzCURS1 48 Hình 3.1 Cây nghệ đen in vitro tháng tuổi 53 Hình 3.2 Callus nghệ đen tuần tuổi sinh trưởng mơi trường có 2,4-D mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) đối chứng sinh trưởng mơi trường có 2,4-D mg/L kết hợp với BAP mg/L (B) 57 Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng tế bào nghệ đen 58 Hình 3.4 Tế bào nghệ đen ni bình tam giác chứa môi trường MS bổ sung 2,4-D mg/L BAP mg/L 59 Hình 3.5 Sinh khối tươi (A) khơ (B) tế bào nghệ đen 59 Hình 3.6 Sản phẩm PCR gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số nghệ đen 61 Hình 3.7 Sơ đồ xếp intron/exon gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 61 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzDCS (MF663785) ở nghệ đen DCS ở nghệ vàng (AB495006.1) 62 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS1 (MF402846) ở nghệ đen CURS1 ở nghệ vàng (AB495007.1) 63 Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS2 (MF402846) ở nghệ đen CURS2 ở nghệ vàng (AB506762.1) 64 ix Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS3 (NCBI: MF987835) ở nghệ đen CURS3 ở nghệ vàng (NCBI: AB506763.1) 65 Hình 3.12 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzDCS DCS (C0SVZ5.1) 66 Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzCURS1 CURS1 (AJF45913.1) 66 Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzCURS2 CURS2 (BAW81545.1) 67 Hình 3.15 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzCURS3 CURS3 (AJF45914.1) 67 Hình 3.16 Cây phả hệ gen sinh tổng hợp curcuminoid 68 Hình 3.17 Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 loại mô khác nghệ đen 70 Hình 3.18 Phổ HPLC curcumin chuẩn 71 Hình 3.19 Phổ HPLC dịch chiết củ nghệ đen 71 Hình 3.20 Phổ HPLC dịch chiết callus nghệ đen 72 Hình 3.21 RNA tổng số mẫu tế bào sau xử lý elicitor 73 Hình 3.22 Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzCURS1 (A) CzCURS3 (B) sau xử lý elicitor 74 Hình 3.23 Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 75 Hình 3.24 Phổ HPLC curcumin chuẩn 78 Hình 3.25 Phổ HPLC dịch chiết tế bào xử lý với YE g/L sau ngày nuôi cấy 78 Hình 3.26 Phổ HPLC dịch chiết tế bào xử lý với SA 100 µM sau ngày nuôi cấy 79 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) gọi nga truật, tam nại hay ngải tím lồi thảo dược địa ở Ấn Độ Indonesia, trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Brazil, Nepal, Thái Lan [78] Việt Nam [7] Nghệ đen từ lâu sử dụng y học cổ truyền nhiều nước để điều trị chứng viêm, đau nhức, bệnh da vết thương vết lở loét, bất thường chu kỳ kinh nguyệt [157] Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin dẫn xuất demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin nhóm hợp chất tạo nên hoạt tính sinh học quan trọng củ nghệ [76] Các nghiên cứu gần cho thấy curcuminoid, đặc biệt curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid) [14], [58], [116] Curcuminoid chiết xuất từ củ (thân rễ) loài nghệ khác nhau, chẳng hạn C caesia [24], C amada [50], C longa [67], C aromatica [74] C zedoaria [78] Curcuminoid sử dụng dược chất nghiên cứu lâm sàng cho bệnh nhân ung thư phổi, ung thư trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35] Nhiều nghiên cứu cho thấy curcuminoid có độ an tồn cao, dung nạp tốt với thể, khơng độc đến liều g/kg thể trọng [46] Hiện nay, gen tham gia trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng (C longa) xác định phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase diketide-CoA synthase (DCS) curcumin synthase (CURS1, CURS2 CURS3) [66], [67] Trước đó, Brand cs (2006) mơ tả gen mã hóa enzyme 116 155 Tohda C., Nakayama N., Hatanaka F., Komatsu K (2006), Comparison of antiinflammatory activities of six curcuma rhizomes: a possible curcuminoid indepent pathway mediated by curcuma phaeocaulis extract, Evid Based Complement Alternat Med, 3, pp 255-260 156 Tuan V.C., Hoang V.D., Loc N.H (2011), Cell suspension culture of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe), VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27, pp 64-70 157 Ullah H.M.A., Zaman S., Juhara F., Akter L., Tareq S.M., Masum E.H., Bhattacharjee R (2014), Evaluation of antinociceptive, in-vivo & in-vitro antiinflammatory activity of ethanolic extract of Curcuma zedoaria rhizome, BMC Complementary and Alternative Medicine, 14(1), pp 346 158 Walker T.S., Pal Bais H., Vivanco J.M (2002), Jasmonic acid-induced hypericin production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L (St John's wort), Phytochemistry, 60(3), pp 289-293 159 Wang J., Qian J., Yao L., Lu Y (2015), Enhanced production of flavonoids by methyl jasmonate elicitation in cell suspension culture of Hypericum perforatum, Bioresources and Bioprocessing, 2(1), pp 160 Wang S., Zhang S., Xiao A., Rasmussen M., Skidmore C., Zhan J (2015), Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of various phenylpropanoid derivatives, Metabolic Engineering, 29, pp 153-159 161 Watanabe K., Shibata M., Yano S., Cai Y., Shibuya H., Kitagawa I (1986), Antiulcer activity of extracts and isolated compound from zedoary (Gajustsu) cultivated in Yakushima (Japan), Yakugaku Zasshi, 106(12), pp 1137-1142 162 Wilson B., Abraham G., Manju V.S., Mathew M., Vimala B., Sundaresan S., Nambisan B (2005), Antibacterial activity of Curcuma zedoaria and Curcuma malabarica tubers, Journal of Ethnopharmacology, 99, pp 147-151 117 163 Xie Z., Ma X., Gang D.R (2009), Modules of co-regulated metabolites in turmeric (Curcuma longa) rhizome suggest the existence of biosynthetic modules in plant specialized metabolism, Journal of Experimental Botany, 60(1), pp 87-97 164 Xing Y (1999), The chemical constituents of the essential oil from Curcuma zedoaria (Christm) Rosc., Journal of essential oil-bearing plants JEOP, 19(1), pp 95-96 165 Yeoman M.M., Meidzybrodzka M.B., Lindsey K., McLauchlan W.R (1980), The synthetic potential of cultured plant cells Plant cell cultures: results and perspectives Amsterdam, Elsevier: 327-343 166 Yu L.J., Lan W.Z., Qin W.M., Xu H.B (2001), Effects of salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and taxol production in cell suspension cultures of Taxus chinensis, Process Biochemistry, 37(5), pp 477-482 167 Yu Z.Z., Fu C.X., Han Y.S., Li Y.X., Zhao D.X (2005), Salicylic acid enhances jaceosidin and siringin production in cell cultures of Saussurea medusa, Biotechnology Letters, 28(13), pp 1027-1031 168 Zhang S., Liu N., Sheng A., Ma G., Wu G (2011), In vitro plant regeneration from organogenic callus of Curcuma kwangsiensis Lindl (Zingiberaceae), Plant Growth Regulation, 64(2), pp 141-145 169 Zhao J.L., Zhou L.G., Wu J.Y (2010), Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(1), pp 137-144 a PHỤ LỤC Phụ lục : Trình tự gen ngân hàng gen LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF663785 1382 bp DNA linear PLN 22-JUL-2018 Curcuma zedoaria diketide-CoA synthase (DCS) gene, complete cds MF663785 MF663785.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1382) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1382) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (12-AUG-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1382 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1382 /gene="DCS" /note="CzDCS" mRNA join(1382) /gene="DCS" /product="diketide-CoA synthase" CDS join(1 175,303 856,942 1382) /gene="DCS" /codon_start=1 /product="diketide-CoA synthase" /protein_id="AXC59785.1" /translation="MEANGYRITHSADGPATILAIGTANPTNVVDQNAYPDFYFRVTN SEHLQELKAKFRRICEKAAIRKRHLYLTEEILRENPSLLAPMAPSFDARQAIVVEAVP KLAKEAAEKAIKEWGRPKSDITHLVFCSASGIDMPGSDLQLLKLLGLPPSVNRVMLYN VGCHAGGTALRVAKDLAENNRGARVLAVCSEVTVLSYRGPHPAHIESLFVQALFGDGA AALVVGSDPVDGVERPIFEIASASQVMLPESEEAVGGHLREIGLTFHLKSQLPSIIAS NIEQSLTTACSPLGLSDWNQLFWAVHPGGRAILDQVEARLGLEKDRLAATRHVLSEYG NMQSATVLFILDEMRNRSAAEGHATTGEGLDWGVLLGFGPGLSIETVVLHSCRLN" ORIGIN atggaagcga acggctaccg cataactcac agcgccgacg ggccggcgac gatcttggcc 61 atcggcaccg ccaaccccac caacgtcgtc gaccagaacg cttatcccga cttctatttc 121 cgggtcacca actccgagca tctgcaggaa ctcaaagcca agtttaggcg catctgtaag b 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 // atttatgtag taggaattgg aggtgagaaa gaatcctagc ggaggcggtg ccccaaatcg ctccgacctg ctacaacgtc gaacaaccgc cggcccccac tgccgcgctc cgcctcggca atatcgaacg aagaggcggt ttccgtcgat ggctgtcgga accaggtgga tcagcgagta accgctcggc tgggcttcgg ag tttgattgaa tggtttggtg gcggcgatca ttgctggctc ccgaagctag gacatcacgc cagcttctca gggtgccacg ggcgcgcggg cccgcccaca gtggtcgggt tcccaagtaa aactttaaaa aggcggccac catcgcgagc ctggaaccag ggcgcggctc cggcaacatg tgcggagggc cccgggactc tgatgggtcg gatttatgtg ggaagaggca ccatggcgcc cgaaggaggc acctcgtctt agctgctcgg ccggtggcac tgctcgccgt tcgagagcct ccgaccccgt tcgctgctcc atcaaatctt ctccgcgaaa aacatcgagc ctgttctggg ggactggaga cagagcgcca cacgccacca tccatcgaga taattcaaac ggtgcgtgtg cttgtacttg gtcgttcgac ggcggagaag ctgctccgcg gctcccgccg cgccctccgc ctgctccgag cttcgtccaa cgatggcgtc agtcgaaatt tggcaccgca ttgggctgac agagcctgac cggttcaccc aggaccggct cggtgctgtt ccggcgaggg ccgtcgtcct agaatgatcg acctgttcga actgaggaga gcgcggcagg gcgatcaagg agcggaatcg agcgtcaatc gtcgccaagg gtcaccgtgc gctctgtttg gagcgcccca aaccaaaatt ggtgatgctt cttccacctc gactgcgtgc cggcggccga cgccgcgacg catcctggac gctcgactgg ccatagttgc atgatcatgt ttacatgtgt ttttgcggga cgatcgtggt agtggggtcg acatgcccgg gcgtcatgct acctcgcgga tctcctaccg gcgacggcgc tcttcgaaat cgatcttttg ccggagagcg aagagccagc tcgccgctgg gcgatcctgg cggcacgtac gagatgcgga ggcgtgcttt agactgaact c LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF402846 1240 bp DNA linear PLN 23-MAY-2018 Curcuma zedoaria curcuminoid synthase (CURS1) gene, complete cds MF402846 MF402846.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1240) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria Roscoe JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1240) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (26-JUN-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1240 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1240 /gene="CURS1" mRNA join(1240) /gene="CURS1" /product="curcuminoid synthase 1" CDS join(1 178,249 1240) /gene="CURS1" /EC_number="2.3.1.217" /codon_start=1 /product="curcuminoid synthase 1" /protein_id="AWK77185.1" /translation="MANLHALRREQRAQGPATIMAIGTATPPNLYEQSTFPDFYFRVT NSDDKQELKKKFRRMCDKTMVKKRYLHLTEEILKERPKLCSYKEASFDDRQDIVVEEI PRLAKEAAEKAIKEWGRPKSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLTVNRLMIY SQACHMGAAMLRIAKDLAENNRGARVLVVACEITVLSFRGPNEGDFEALAGQAGFGDG AGAVVVGADPLEGIEKPIYEIAAAMQETVAESQGAVGGHLRAFGWTFYFLNQLPAIIA DNLGRSLERALAPLGVTEWNDVFWVAHPGNWAIMDAIEAKLQLSPDKLSTARHVFTEY GNMQSATVYFVMDELRKRSAVEGRSTTGDGLQWGVLLGFGPGLSIETVVLRSMPL" ORIGIN atggccaacc tccacgcgtt gcgcagggag cagagggctc aaggtcccgc caccatcatg 61 gccatcggga cggccacccc ccccaacctc tacgagcaga gcaccttccc ggacttctac 121 ttccgcgtca ccaactccga cgacaagcag gagctcaaga aaaagttccg ccgcatgtgt 181 aagtaatcga tcgatgatcc gttcagttga tgtaattcga tcggtgattg atttggagaa 241 gtaaataggc gataagacga tggtgaagaa gcggtacctg cacttgaccg aggagatcct 301 gaaggagagg cccaagctct gctcctacaa ggaggcgtcg ttcgacgacc ggcaggacat 361 cgtggtggag gagataccga gattggctaa agaagcggcg gagaaggcca tcaaggagtg 421 ggggcggccc aaatcggaga tcacccacct ggtcttctgt tccatcagcg ggatcgacat 481 gcccggcgcc gactaccgcc tcgccacgct cctcggcctc cctctcaccg tcaaccgcct 541 catgatctac agccaggcct gccacatggg cgccgccatg ctccgcatcg ccaaggacct 601 cgccgagaac aacaggggcg cgcgcgtgct ggtggtcgcc tgcgagatca ccgtgctcag 661 cttccgcggc ccgaacgagg gcgacttcga ggcgctcgcg gggcaggccg gcttcggcga d 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 // cggcgcgggg cgagatcgcg cctgcgggcg caacctcggg cgtcttctgg gcagctgagc gcagagcgcc gcggagcacc cagcatcgag gccgtcgtcg gcggcgatgc ttcggctgga aggagcctgg gtggcgcacc ccggacaagc accgtgtact accggagacg accgttgtac tcggggccga aggagacggt cgttctactt agcgggcgtt cgggcaactg tcagcaccgc tcgtgatgga gcttgcagtg tgcgcagtat cccgctggaa ggcggagagc cctgaaccag ggcgccgctg ggccatcatg ccgccacgtc tgagctgagg gggagttctc gccactgtag ggaattgaaa cagggggcgg ctgccggcga ggggtgacgg gacgccatcg ttcacagagt aagcggtcgg ctcggttttg aacccatcta tgggcggcca tcatcgccga agtggaacga aagccaagct acggcaacat cggtggaggg ggccgggcct e LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF402847 1288 bp DNA linear PLN 23-MAY-2018 Curcuma zedoaria curcuminoid synthase (CURS2) gene, complete cds MF402847 MF402847.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1288) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria Roscoe JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1288) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (26-JUN-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1288 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1288 /gene="CURS2" mRNA join(1288) /gene="CURS2" /product="curcuminoid synthase 2" CDS join(1 184,297 1288) /gene="CURS2" /EC_number="2.3.1.217" /codon_start=1 /product="curcuminoid synthase 2" /protein_id="AWK77186.1" /translation="MAMISLQAMRKAQRAQGPATILAVGTANPPNLYEQDTYPDYYFR VTNSEHRQELKNKFRRMCEKTMVKRRYLYLTPEILKERPKLCSYMEPSFDDRQDIVVE EVPKLAAEAAEKAIKEWGGEKSAITHLVFCSISGIDMPGADYRLAKLLGLPLAVNRLM LYSQACHMGAAMLRIAKDIAENNRSARVLVVACEITVLSFRGPDERDFQALAGQAGFG DGAGAMIVGADPVLGVERPLYHIMSATQTTVPESEKAVGGHLREVGLTFHFFNQLPAI IADNVGNSLAEAFEPIGIKDWNNIFWVAHPGNWAIMDAIETKLGLEQSKLATARHVFS EFGNMQSATVYFVMDELRKRSAAENRATTGDGLRWGVLFGFGPGISIETVVLQSVPL" ORIGIN atggcgatga tcagcttgca ggcgatgcgc aaggcgcaga gagctcaagg tccggccacc 61 atcttggccg tcggcaccgc caacccgccc aatctctacg agcaggacac gtatcccgac 121 tactacttcc gcgtcaccaa ctccgagcac aggcaggagc tcaagaacaa gttccgccgc 181 atgtgtaagt tcttcgatcg atcctttttt ggttttcgaa aaaagtgagt ttttaatggg 241 aaaagcagag gatcgaggtg gaacgggagg attgatttgg tttaatttga ttgcaggcga 301 gaagacgatg gtgaagaggc ggtatcttta cctgacgccg gagatcctga aggagcggcc 361 gaagctgtgc tcgtacatgg agccgtcgtt cgacgaccgg caggacatcg tggtggagga 421 ggtgccgaag ctggccgcgg aggcagcgga gaaggccatc aaggagtggg gcggcgagaa 481 gtcggccatc acccacctgg tcttctgctc catcagcggc atcgacatgc ccggagctga f 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 // ctaccgcctc ccaggcctgc ccgctccgct ggacgagcgc gatgatcgtc ggcgactcag ggggctgacc cagcctggcg ggcgcacccg gagcaagctg cgtctacttc cggcgacggg cgtcgtgctc gccaagctcc cacatgggcg cgcgtcctcg gacttccagg ggggccgacc acgacggtgc ttccacttct gaggcgttcg ggcaactggg gccaccgcac gtgatggacg ctccggtggg caaagcgtgc tcgggctccc ccgccatgct tcgtcgcctg cgctggccgg ccgtcctcgg cggagagcga tcaaccagct aaccgatcgg ccatcatgga gccacgtctt agctcaggaa gcgtgctctt cgctttag gctcgccgtc gcgcatagcc cgagatcacc ccaggccggc cgtcgagcgg gaaggcggtg gccggcgatc gatcaaggac cgccatcgag ctccgagttc acggtcggcg cggcttcggc aaccgcctga aaggacatcg gtgctcagct ttcggggacg ccgctctacc gggggccacc atcgccgaca tggaacaaca accaagctgg ggcaacatgc gcggagaacc cccggcatca tgctctacag ccgagaacaa tccgcggccc gcgccggcgc acatcatgtc tccgcgaggt acgtggggaa tcttctgggt gcctggaaca agagcgccac gggcgaccac gcatcgaaac g LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF987835 1265 bp DNA linear PLN 01-SEP-2018 Curcuma zedoaria curcumin synthase (CURS3) gene, complete cds MF987835 MF987835.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1265) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Truong,L.T.P., Luong,N.N., Tan,T.H., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of several genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1265) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Truong,L.T.P., Luong,N.N., Tan,T.H., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-SEP-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1265 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1265 /gene="CURS3" /note="CzCURS3" mRNA join(1265) /gene="CURS3" /product="curcumin synthase 3" CDS join(1 178,271 1265) /gene="CURS3" /EC_number="2.3.1.217" /codon_start=1 /product="curcumin synthase 3" /protein_id="AXQ39866.1" /translation="MGSLQAIRRAQRAQGPATIMAVGTSNPPNLYEQTSYPDFYFRVT NSDHKHELKNKFRVICEKTKVKRRYLHLTEEILKQRPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEI PKLAKEAAEKAIKEWGRPKSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLSVNRLMLY SQACHMGAQMLRIAKDLAENNRGARVLAVSCEITVFSFRGPDAGDFEALACQAGFGDG AAAVVVGADPLPGVERPIYEIAAAMQETVPESERAVGGHLREIGWTFHFFNQLPKLIA ENIEGSLARAFKPLGISEWNDVFWVAHPGNWGIMDAIETKLGLEQGKLATARHVFSEY GNMQSATVYFVMDEVRKRSAAEGRATTGEGLEWGVLFGFGPGLTIETVVLRSVPLP" ORIGIN atgggcagcc tgcaggcgat tcgcagagca cagcgggctc aaggcccggc caccatcatg 61 gctgtcggca cctccaaccc gcctaacctc tacgagcaga cctcctaccc cgacttctat 121 ttccgcgtca ccaactccga ccacaagcac gagctcaaga acaaattccg tgttatctgg 181 aattaattcg cacccatctt ttggttattg atcagttcga tttaaattag ggagttagtt 241 aattaataat attattatta ttctaaatag gtgagaagac gaaggtgaaa agacggtact 301 tgcacttgac ggaggagatc ctgaagcaga ggcccaagct ctgctcctac atggagccct h 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 // ccttcgacga cggaaaaggc gctccatcag tccccctgtc tgctgcgcat cctgcgaaat cgtgtcaggc cgggcgtcga gcgagagggc agctgccgaa tggggatcag tggacgccat tcttcagcga ggaagcggtc tgtttgggtt cgtag ccggcaggac gatcaaggaa cggyatcgac cgtcaaccgc agccaaggac caccgtgttc cggcttcggc gaggcccatc ggtggggggc gctgatcgcg cgagtggaac cgagaccaag gtacggaaac ggcggcggag tggcccaggc atcgtggtgg tggggccgcc atgcccggcg ctcatgctct ctcgcggaga agcttccgcg gacggtgccg tacgagatcg cacctgaggg gaaaacatcg gacgtgttct ctggggctgg atgcagagcg gggcgggcca ctcaccatag aggagatacc ccaagtcgga ccgattaccg acagccaggc acaaccgggg gtcccgacgc ctgccgtcgt cggcggcgat aaatcggctg agggcagcct gggtggcgca aacaggggaa ccaccgtgta ccaccggcga aaactgtcgt gaagctggcg gatcacccac cctcgccacg ctgccacatg cgcgcgcgtc gggcgacttc cgtcggggcc gcaggaaacg gaccttccac ggcgcgggcg cccggggaat gctcgccacg cttcgtgatg aggcctggag gctacgcagt aaggaggcgg ttggtgttct ctcctcggcc ggcgcgcaga ctggccgtct gaggccctcg gaccccctcc gtgccggaga ttcttcaacc ttcaagccgc tggggcatca gcgcgccacg gacgaggtga tggggagtgc gtaccattac Phụ lục Đường chuẩn curcumin Hình Đường chuẩn curcumin dựa kết HPLC Phụ lục Hình ảnh thí nghiệm Hình 2: Tế bào nghệ đen để lắng bình tam giác 250 ml Hình 3: Cây nghệ đen in vitro Hình 4: Tế bào Callus nghệ đen Hình 5: Ni cấy tế bào nghệ đen bình tam giác 250ml đặt máy lắc Hình 6: Sinh khối tươi tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy Hình 7: Cây nghệ đen tự nhiên