Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỢI LÊ THỊ HOÀNG MỸ Nghiªn cứu tần suất, đặc điểm thalassemia bệnh hemoglobin cộng đồng dân tộc Khmer đồng sông Cưu Long LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỢI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỢI LÊ THỊ HOÀNG MỸ Nghiªn cứu tần suất, đặc điểm thalassemia bệnh hemoglobin cộng đồng dân tộc Khmer đồng sông Cöu Long Chuyên ngành : Huyết học và Truyền máu Mã số : 62720151 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Quang Vinh PGS TS Huỳnh Nghĩa HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn và lời cảm ơn chân thành tới: - Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học và Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ hoàn thành luận án Tiến sĩ - Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện tớt cho tơi quá trình học tập và thực đề tài nghiên cứu Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lịng biết ơn tới: - GS.TS Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội; - PGS.TS Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ mơn Hút học, Đại học Y Dược Thành phớ Hồ Chí Minh; - TS Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Nhi Trung Ương; - Prof Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; - người Thầy đã dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá; động viên và tạo điều kiện tốt cho suốt quá trình thực luận án Xin cho tơi gửi lời tri ân đến Thầy – Cố PGS.TS Bùi Văn Viên, người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, động viên tơi quá trình thực luận án…, Thầy nằm giường bệnh Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Medic, thành phớ Hồ Chí Minh; tập thể Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện nghiên cứu Sinh học Phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; đơn vị dịch vụ Thalassemia, Trường Đại học Khon Khaen, Thái Lan; Sở Khoa học và cơng nghệ tỉnh Sóc Trăng, Sở Y tế, trung tâm Y tế, các trạm y tế xã, phường các tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Hậu Giang… đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi quá trình thu thập sớ liệu và thực nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em đồng nghiệp tại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, và bạn bè đã ln dành cho tơi tình cảm q mến, lời động viên, chia sẻ, giúp tơi có thêm động lực để hoàn thành luận án này Hà Nội, ngày tháng Lê Thị Hoàng Mỹ năm LỜI CAM ĐOAN Tôi là Lê Thị Hoàng Mỹ, nghiên cứu sinh khóa 29 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan: Đây là luận án thân trực tiếp thực dưới hướng dẫn GS.TS Phạm Quang Vinh và PGS.TS Huỳnh Nghĩa Cơng trình này khơng trùng lặp với nghiên cứu nào khác đã công bố tại Việt Nam Các số liệu và thơng tin nghiên cứu là hoàn toàn xác, trung thực và khách quan, đã xác nhận và chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về cam kết này Hà Nội, ngày tháng Người viết Lê Thị Hoàng Mỹ Lê Thị Hoàng Mỹ năm CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Viết tắt Ý nghĩa -α3.7 đột biến xóa đoạn 3,7 kb α+-thalassemia -α4.2 đột biến xóa đoạn 4,2 kb α+-thalassemia SEA đột biến xóa đoạn α0-thalassemia South East Asia THAI đột biến xóa đoạn α0-thalassemia Thailand /α α0-thalassemia -/ α+-thalassemia αCSα đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Constant Spring αQSα đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Quong Sze αTα đột biến điểm gen globin α2 ααT đột biến điểm gen globin α1 α+-thal α-thal các đột biến gây gen globin-α α0-thal α-thal các đột biến gây gen globin-α AEBart’s Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử kết hợp đột biến gây tổn thương gen globin α xóa đoạn khơng xóa đoạn ARMS amplification refractory mutation system: hệ thớng kh́ch đại đột biến có tính chất trơ ASO Allele specific oligonucleotide, mẫu dò đặc hiệu alen β gen globin-β, alen gen globin-β bình thường β0 đột biến gen β0-thalassemia khơng tổng hợp chuỗi globin-β β+ đột biến gen β+-thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin-β βE đột biến gen globin-β tạo HbE (codon 26 GAG>AAG) β/βE, βE/βE Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử, hemoglobin E đồng hợp tử βthal đột biến β-thalassemia giảm không tổng hợp chuỗi globin β, không bao gồm đột biến βE (δβ)thal đột biến đoạn DNA chứa gen β và δ CE Capillary Electrophoresis, điện di mao quản ĐB đột biến ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DCIP Dichlorophenolindophenol ddNTP dioxynucleotide triphosphat DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis, Điện di gradient biến tính DHT Dị hợp tử ĐHT Đồng hợp tử ĐLC Độ lệch chuẩn DNA Deoxynucleotide acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate GTLN Giá trị lớn GTNN Giá trị nhỏ Hb Hemoglobin: huyết sắc tố HbCS Hemoglobin Constant Spring HC Hồng cầu HCT Hematocrit, thể tích khới hồng cầu HGB Nồng độ hemoglobin HPFH Heriditary persistence of fetal hemoglobin, tồn lưu hemoglobin bào thai HPLC High Performance Liquid Chromatography, Sắc ký lỏng hiệu cao HRM High resolution melting, đường cong nóng chảy có độ phân giải cao HS Hypersensitive site: vị trí nhạy cảm IVS Intervening sequence: trình tự đoạn chèn hay intron KKU Khon Khaen University, Đại học Khon Khaen Thái Lan MAS-PCR Multiplex allele specific Polymerase chain reaction MCH Mean Corpuscular Hemoglobin, lượng hemoglobin trung bình hồng cầu MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu MCV Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification, khuếch đại đa đoạn dị phụ thuộc phản ứng nới NST Nhiễm sắc thể OF test osmotic fragility: xét nghiệm sức bền thẩm thấu PCR polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp RDB Reverse dot blot: kỹ thuật lai điểm ngược RDW Red cell distribution width, Độ rộng dải phân bớ kích thước hồng cầu RE Ristriction enzyme, enzyme giới hạn rpm round per minute RT-PCR Realtime – PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực SLHC Red Blood cell count - số lượng hồng cầu TB Giá trị trung bình TPTTBMN Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi V WHO World Health Organisation, Tổ Chức Y Tế Thế giới γ, ζ, ε gen globin gamma, zeta, epsilon δ gen globin-delta δβ alen gen globin-delta beta bình thường PHỤ LỤC QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA PHƯƠNG PHÁP TỦA BẰNG ΜUỐI (SALTING – OUT) Dụng cụ, trang thiết bị - Týp 1,5 mL (Eppendorf®) đã khử khuẩn - Micropipette (Gilson®) loại 100 – 1000 L, 20 – 200 L - Đầu tip 1000 L, 200 L (Axygen Scientific®) - Máy ly tâm týp (Hettich Mikro® 200) - Máy vortex (Genie® 2) Hóa chất, thuốc thử - Dung dịch ly giải hồng cầu - Dung dịch ly giải tế bào (Cell lysis solution - Qiagen®) - Dung dịch kết tủa protein (Protein precipitate solution - Qiagen®) - Dung dịch isopropanol (Merck®) - Ethanol 70% pha từ cồn tuyệt đới (Merck®) - Đệm TE (Promega®) Các bước tiến hành (1) Chuẩn bị týp 1,5 mL cho mẫu, ghi mã số mẫu và ngày tách lên týp (2) Lấy mẫu máu khỏi tủ trữ đơng, để nhiệt độ phịng 15 phút (3) Trộn đều cách dốc ngược nhiều lần, hút 400 L máu vào týp (4) Thêm 1000 L dung dịch ly giải hồng cầu cho vào týp (5) Trộn đều cách dốc ngược nhẹ nhàng nhiều lần, ủ 10 phút nhiệt độ phòng (6) Quay ly tâm 12.000 rpm phút (7) Nhẹ nhàng đổ bỏ dịch màu hồng, để lại cặn lắng bên dưới (8) Làm rã khối cặn lắng cách lướt nhẹ đáy týp giá đựng ống nghiệm đến khối cặn rã hoàn toàn (9) Lặp lại các bước (4) – (8) Thực bước này đến nhìn thấy khối cặn lắng màu trắng đục (lớp bạch cầu) đáy týp (thường lặp lại lần) (10) Thêm 300 L dung dịch ly giải tế bào vào týp (11) Vortex khoảng 20 giây (12) Tiếp tục thêm 100 L dung dịch kết tủa protein (13) Vortex khoảng phút (14) Quay ly tâm 12.000 rpm phút (15) Chuyển dịch suốt (chứa DNA) sang týp đã ghi mã số và ngày tách chiết, bỏ týp (16) Thêm 300 L dung dịch isopropanol týp (17) Dốc ngược lên – xuống nhẹ nhàng khoảng 50 lần đến thấy có cuộn DNA màu trắng đục (18) Quay ly tâm 12.000 rpm phút (19) Nhẹ nhàng đổ bỏ lớp dịch nổi, tránh đổ phần DNA lắng dưới đáy týp (20) Dùng tay búng nhẹ đáy týp để tách DNA khỏi thành týp (21) Thêm 300 L ethanol 70% vào týp, trộn đều (22) Quay ly tâm 12.000 rpm phút (23) Đổ bỏ lớp dịch nổi, tránh đổ bỏ DNA bên dưới (24) Gạn thật sạch ethanol giấy thấm (25) Để khơ týp khơng khí nhiệt độ phịng > 15 phút (26) Thêm 30 – 50 L dung dịch đệm TE (27) Để týp nhiệt độ phòng khoảng 24 giờ (28) Sau 24 giờ, trữ DNA 40C -200C đến sử dụng Hình 1.1 Máy quay ly tâm Hettich Mikro 200 máy vortex PHỤ LỤC QUY TRÌNH ĐO NỒNG ĐỢ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ Nguyên lý hoạt động Sức căng bề mặt sử dụng để giữ cột mẫu vị trí để ánh sáng truyền qua thuận tiện cho phép đo Người sử dụng cần dùng pipette nhả trực tiếp thể tích nhỏ (0,5 – L) mẫu vào vị trí đo, có tay cầm nơi có sợi cáp quang ấn x́ng vị trí đặt mẫu, sau thả nhẹ để tạo khoảng cách nhỏ dưới tác dụng sức căng bề mặt, cột chất lỏng mẫu kéo lên Lúc này thực phép đo với thời gian < 10 giây Biểu đồ quang phổ và các kết phân tích lên màn hình máy tính kèm Dụng cụ, trang thiết bị - Micropipette 0,2 – L - Nước cất - Đầu típ 10 L - Giấy lau - Máy đo quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Specific ®) và phần mềm cài đặt máy tính Các bước thực (1) Mở phần mềm: nhấp chuột lần vào biểu tượng NanoDrop 2000 máy tính (2) Chọn chương trình đo: chọn Nucleic Acid (3) Xác minh bước sóng thường quy: dùng giấy lau sạch bệ đo (pedestal) bên dưới và cánh tay NanoDrop, hạ cánh tay xuống và click OK, máy chạy vài giây để kiểm tra (4) Blank trước sử dụng: tải L nước cất trực tiếp lên bệ đo NanoDrop, hạ cánh tay máy xuống, nhấp chuột vào nút Blank màn hình Máy tiếp tục chạy vài giây để blanking Sau blank xong, nút Measure rõ màn hình (5) Tiến hành đo mẫu: nhập mã số mẫu vào ô ID, nâng cánh tay lên, lau sạch bệ đo bên dưới và cánh tay giấy thấm, nhỏ L sản phẩm DNA lên vị trí đo, hạ cánh tay máy x́ng, nhấp chọn nút Measure Sau chương trình đo hoàn thành, máy hiển thị cửa sổ cho phép lưu các số liệu vừa đo, tạo folder để lưu kết Kết đo hiển thị lên màn hình, với nồng độ ng/ L Đới với DNA, cần quan tâm đến tỉ số hấp thụ quang phổ bước sóng 260 nm và 280 nm (A260/A280) Tỉ sớ này nằm khoảng từ 1,8 – 2,0 cho biết sản phẩm DNA tinh sạch, nếu A260/A280