Nghiên cứu mNghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.ột số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - HÀ HỮU HẢO NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ THỊ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Y ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÁP Y Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2023 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Chu Hoàng Hà Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Lê Văn Sơn Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 202 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Bắt đầu từ năm 1953 với kiện Watson Crick phát cấu trúc xoắn kép ADN nay, công nghệ sinh học phân tử có bước phát triển vượt bậc trở thành công cụ hữu hiệu cho nhiều ngành khoa học khác y học, nông nghiệp, khảo cổ học, pháp y… Đặc biệt, lĩnh vực giám định pháp y, khoa học hình cơng nghệ ADN đóng vai trị quan trọng để giải vụ việc điều tra xác định danh tính tội phạm, xét nghiệm mối quan hệ huyết thống, tìm người tích Phân tích ADN giúp giải từ vụ việc mang tính dân xác định cha cho con, tranh chấp quyền thừa vụ án hình …ADN chứng có tính pháp lý cao có giá trị định phiên Hơn nữa, vụ thiên tai, thảm hoạ với số lượng người tử vong lớn hay việc nhạn dạng thông thường thực giám định ADN để xác định danh tính nạn nhân trở thành biện pháp khả thi Việc lựa chọn thị phân tử đoạn gen (locus gen) có tính bền vững, đa hình cao, mang đặc trưng cho cá thể điều quan trọng nhằm ứng dụng phân tích ADN khoa học điều tra, pháp y Trong số đó, đoạn lặp lại ngắn - STR (short tandem repeat) - trình tự ADN lặp lại liên tiếp với đơn vị lặp lại gồm - bp nghiên cứu, lựa chọn trở thành thị phân tử phổ biến Các locus STR khảo sát, hệ thống lại tạo thành kit thương phẩm với khả đồng thời nhiều locus STR cách nhanh chóng, xác, có độ nhạy cao Song song với locus STR cặp nhiễm sắc thể (NST) thường, việc nghiên cứu ứng dụng locus STR NST giới tính X Y thu hút quan tâm nhà khoa học Các STR NST giới tính Y (gọi tắt Y-STR) có đặc điểm di truyền theo dịng cha mà khơng có tái tổ hợp qua hệ cá thể nam giới dịng cha có hồ sơ Y-STR giống Khi việc sử dụng STR NST thường đáp ứng yêu cầu giám định, phân tích thêm hồ sơ YSTR giúp giải nhiều trường hợp, đặc biệt giám định ADN mẫu từ nam giới xác định mối quan hệ theo dòng cha (anh - em trai, – cháu…), vụ án hiếp dâm với nghi phạm nam giới, lập phả hệ di truyền theo dòng cha… Hiện phân tích Y-STR chủ yếu thực qua kit thương mại hoá mà phổ biến PowerPlex® Y23 system (hãng Promega) với 23 Y-STR Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (hãng Thermo Fisher Scientific) phân tích 27 Y-STR Hai kit tỏ rõ hữu hiệu với nhiều ứng dụng khác nhau: phân biệt cá thể nam quần thể, xác định quan hệ huyết thống theo dịng cha, giám định hình mẫu có nồng độ ADN thấp, mẫu lẫn từ nhiều nguồn, mẫu vi vết Do cấu trúc di truyền quần thể khác nên việc đánh giá độ đa hình, tính phù hợp STR nói chung Y-STR nói riêng điều cần thiết trước áp dụng quần thể Mỗi phịng thí nghiệm, viện nghiên cứu khuyến cáo nên xây dựng bảng tần suất phân bố alen với quần thể người khác nhằm phục vụ cho việc tính tốn độ tin cậy, xác suất có quan hệ huyết thống Việc sử dụng kit để nghiên cứu ứng dụng thị Y-STR khoa học kỹ thuật, hình sự, giám định huyết thống áp dụng phổ biến giới Tuy Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết để khảo sát tần suất phân bố, độ đa hình, tính phù hợp, khả ứng dụng thị Y-STR quần thể đại diện cho nam giới người Việt Các nghiên cứu dừng lại số thị quy mô mẫu nhỏ Việc khảo sát thêm locus Y-STR nhằm phục vụ cho việc tính tốn độ tin cậy hồ sơ Y-STR, xác suất có quan hệ theo dịng cha, ứng dụng khoa học hình thực cần thiết có ý nghĩa thực tiễn cao Vì chúng tơi tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu số thị nhiễm sắc thể Y để ứng dụng giám định pháp y” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Lựa chọn nghiên cứu đặc điểm liên quan (tần suất phân bố alen, độ đa hình, khả phân biệt cá thể …) 29 thị Y-STR quần thể nam giới Việt Nam dân tộc Kinh - Nghiên cứu số thị có kích thước nhỏ (mini STR) NST Y - Khảo sát tiềm ứng dụng thị Y-STR nhiều loại mẫu khác (mẫu lẫn, mẫu có chất lượng kém, mẫu phân hủy) Các nội dung nghiên cứu luận án Để đạt mục tiêu đề tài, thực nội dung nghiên cứu sau: - Lựa chọn đối tượng nghiên cứu, tiến hành thu thập mẫu tách chiết ADN - Thực quy trình phân tích thị Y-STR từ mẫu nghiên cứu Lập bảng phân bố tần suất alen thị locus Y-STR tính tốn số liên quan: số alen, độ đa hình, độ đa dạng haplotype, khả phân biệt cá thể - Lựa chọn tối ưu điều kiện khuếch đại số mini STR NST Y bước đầu ứng dụng công tác giám định ADN - Khảo sát khả tạo thị Y-STR nhiều loại mẫu giám định khác mẫu lẫn từ nhiều nguồn, mẫu hài cốt lâu năm, mẫu vi vết CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phân tích ADN giám định pháp y 1.2 Các loại thị phân tử (marker) 1.3 Tổng quan thị STR 1.3.1 Đặc điểm gen 1.3.2 Phân loại STR 1.4 STR nhiễm sắc thể giới tính Y 1.5 Các hướng ứng dụng thị STR nhiễm sắc thể giới tính Y 1.5.1 Y-STR nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể (genetic structure) 1.5.2 Ứng dụng Y-STR xác định huyết thống 1.5.3 Ứng dụng Y-STR lĩnh vực khoa học hình 1.6 Phương pháp phân tích thị Y-STR 1.6.1 Phân tích dựa phương pháp điện di mao quản 1.6.2 Phân tích sử dụng kit Y-STR thương mại hóa 1.6.3 Phân tích sử dụng chiến lược mini STR 1.7 Tầm quan trọng việc tính tốn tần suất alen thị STR 1.8 Tình hình nghiên cứu thị Y-STR 1.8.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.8.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Nghiên cứu khảo sát đa hình locus Y-STR thuộc kit PowerPlex® Y23 System Yfiler Plus: 400 mẫu nam giới dân tộc Kinh thu thập miền bắc Việt Nam, quan hệ huyết thống với Mẫu thu bao gồm: mẫu tóc, niêm mạc miệng mẫu máu - Nghiên cứu mẫu bị phân huỷ: 30 mẫu xương hài cốt thu thập từ: Nghĩa trang liệt sĩ Hữu Nghị Việt Lào, huyện Anh Sơn, tỉnh Nghệ An (15 mẫu) Nghĩa trang liệt sĩ huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên (15 mẫu) - Nghiên cứu mẫu lẫn (mixture sample): 50 mẫu dịch âm đạo thu từ nạn nhân nữ vụ án hiếp dâm cung cấp quan công an tỉnh, thành phố trưng cầu giám định ADN Khoa Y sinh học – Viện Pháp y quốc gia 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN Đề tài sử dụng phương pháp tách chiết ADN tùy thuộc loại mẫu mục đích nghiên cứu: - Phương pháp tách chiết ADN Chelex® 100: Đây phương pháp tách chiết sử dụng mẫu thơng thường như: máu, lơng, tóc mẫu mô chưa bị phân hủy - Phương pháp tách chiết ADN Qiamp® ADN micro kit: Phương pháp sử dụng mẫu có nồng độ ADN thấp, mẫu thu thập trường vụ án khó tách chiết ADN - Phương pháp tách chiết ADN QIAamp® ADN investigator kit hãng QIAgen – Đức: Phương pháp sử dụng mẫu xương, hài cốt bị phân huỷ, có nồng độ ADN thấp, ADN bị đứt gãy nhiều 2.2.2 Phương pháp định lượng ADN - Với mẫu tách chiết theo phương pháp Chelex® 100: Đo nồng độ ADN sau tách chiết máy Quantus Fluorometer (Promega) theo hướng dẫn nhà sản xuất, - Với mẫu tách chiết sử dụng kit: sau tách chiết ADN tiến hành định lượng ADN phương pháp Realtime PCR theo Trio DNA Quantification Kits (Applied Biosystem, Mỹ) máy 7500 RealTime PCR (Applied Biosystem, Mỹ) 2.2.3 Phương pháp điện di gel Chạy điện di phát sản phẩm PCR gel Polyacrylamide 6% 2.2.4 Phương pháp PCR - Phân tích 29 thị Y-STR: theo kit PowerPlex® Y23 System (hãng Promega - Mỹ) Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific –Mỹ), thành phần phản ứng PCR với hai kit tuân theo hướng dẫn nhà sản xuất - Phân tích 10 thị mini Y-STR: thiết kế cặp mồi tối ưu chu trình phản ứng PCR 2.2.5 Phương pháp điện di mao quản - Phân tích 29 thị Y-STR từ kit PowerPlex® Y23 System YPlus theo hướng dẫn nhà sản xuất - Sản phẩm sau PCR trộn với thang nội chuẩn Hi-Di Formamide, tra vào giếng đĩa 96 giếng, sốc nhiệt độ 95oC, phút Sau chuyển vào đá lạnh để biến tính phút cho vào hệ thống máy điện di mao quản 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ) để phân tích với chương trình cài đặt theo hướng dẫn nhà sản xuất - Dữ liệu phân tích phần mềm GeneMapper® ID-X 1.3 (Applied Biosystems - Mỹ) 2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen Theo phương pháp giải trình tự gen Sanger với bước chính: tinh sản phẩm sau PCR, Thực phản ứng PCR với BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit , tinh sau chạy Bigdye, phân tích hệ thống máy ABI 3500Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Thermo Scientific, Mỹ) 2.3 Phân tích xử lý số liệu Tần số alen locus, tần suất haplotype, tổng số alen tổng số haplotype nghiên cứu xác định Excel 2013 phần mềm Arlequin 1.3 Độ đa dạng gen (gene diversity – GD) locus Y-STR tính theo công thức: GD = n*(1- Σ pi2)/(n-1) Haplotype diversity (HD) theo công thức: HD = n*(1- Σ pith2)/(n-1) Khả phân biệt (Discrimination capacity - DC) tính theo cơng thức: DC= h/n Trong n số mẫu, pi tần số alen tương ứng, pth tần số haplotype tương ứng, h số haplotype khác quan sát thấy quần thể Ngồi chúng tơi sử dụng cơng cụ online AMOVA webiste http://yhrd.org để tính tốn khoảng cách di truyền quần thể (Rst) giá trị xác suất kết hợp (P value) quần thể nghiên cứu quần thể lân cận CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu với mẫu người sống có nồng độ ADN cao bao gồm: mẫu máu, tóc, niêm mạc miệng chúng tơi sử dụng phương pháp tách chiết Chelex® 100 – phương pháp đơn giản, nhanh có hiệu cao Phương pháp tách hạt chelex có ưu điểm ngăn chặn phân hủy ADN từ enzym phân hủy (DNase) từ chất gây nhiễm tiềm ẩn Mg2+ ức chế phân tích sau Tuy nhiên phương pháp có hạn chế bước gia nhiệt làm biến tính chuỗi xoắn kép kết ADN sợi đơn ổn định trình bảo quản, nồng độ ADN thu sau tách chiết khơng cao khơng loại bỏ hồn tồn chất gây nhiễm ức chế phản ứng PCR nên phù hợp với phân tích sử dụng kit thương mại có độ nhạy lớn Mẫu sau tách chiết định lượng phương pháp đo độ hấp thụ máy Quantus Fluorometer (hãng Promega - Mỹ) Đây phương pháp đo dựa tín hiệu huỳnh quang phát ra, có độ nhạy độ xác cao so với phương pháp đo OD truyền thống Giá trị trung bình đo 2,70 ng/µl đến 10,05 ng/µl Các mẫu ADN tổng số đạt tiêu chuẩn số lượng chất lượng để sử dụng làm ADN đầu vào cho nghiên cứu 29 thị Y-STR sử dụng kit PowerPlex® Y23 System YPlus Với mẫu có chất lượng kém, mẫu bị phân huỷ nhiều mẫu xương hài cốt, mẫu giám định án nồng độ ADN thu sau tách chiết thấp nên khó áp dụng phương pháp điện di gel để kiểm tra Thay vào chúng tơi sử dụng phương pháp định lượng Trio DNA Quantification Kits (hãng Thermo Fisher Scientific – Mỹ) hệ thống máy Real time PCR Bảng 3.1 Kết realtime PCR mẫu xương, ký hiệu R1-R5 T.Large autosomal: ADN kích thước lớn, T.Small autosomal: ADN kích thước nhỏ, T.Y: hàm lượng ADN NST Y Ký hiệu R1 R2 R3 R4 R5 Nồng độ ADN 0.0572 0.0787 0.0721 0.0542 0.1028 0.0974 0.0124 0.0202 0.0196 0.0544 0.0947 0.0575 0.0665 0.1007 0.0975 ADN đích T.Large Autosomal T.Small Autosomal T.Y T.Large Autosomal T.Small Autosomal T.Y T.Large Autosomal T.Small Autosomal T.Y T.Large Autosomal T.Small Autosomal T.Y T.Large Autosomal T.Small Autosomal T.Y Chỉ số phân hủy 1.376 1.897 1.633 1.740 1.513 Kết Realtime PCR mẫu xương, hài cốt ký hiệu R1-R5 minh họa cho thấy hàm lượng ADN kích thước lớn (T Large autosomal) hàm lượng ADN kích thước nhỏ (T Small autsomal) lại cao Chỉ số phân huỷ (DI-Degradation Index) tính tỷ lệ hàm lượng ADN kích thước nhỏ/ ADN kích thước lớn >1 chứng tỏ mẫu hài cốt có ADN bị phân huỷ Những mẫu xếp vào nhóm mẫu dùng nghiên cứu đánh giá hiệu phân tích Y-STR mẫu phân huỷ nhiều 3.2 Kết nghiên cứu 29 thị Y-STR từ kit PowerPlex® Y23 System Yfiler Plus 3.2.1 Lựa chọn thị Y-STR dùng nghiên cứu Tính đến có khoảng 400 marker Y-STR riêng rẽ nghiên cứu rõ cấu trúc vị trí NST Tuy nhiên để lựa chọn thành locus có tiềm ứng dụng giám định ADN cần đáp ứng số yêu cầu như: có độ đa hình cao, số alen tương đối lớn, cấu trúc lặp không phức tạp, nghiên cứu rõ trình tự gen, phương pháp phân tích đơn giản, có độ xác đọc kết Dựa tiêu chí đề tài lựa chọn 29 locus Y-STR để khảo sát quần thể nam giới người Kinh, Việt Nam sử dụng hai kit Y-STR thương mại phổ biến PowerPlex®Y23 System (hãng Promega, gọi tắt PowerPlex® Y23 System) Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (hãng Thermo Fisher Scientific, gọi tắt YPlus) 3.2.2 Xây dựng hồ sơ Y-STR Dựa theo hướng dẫn nhà cung cấp thu liệu Y-STR từ 400 mẫu nghiên cứu đáp ứng yêu cầu hồ sơ Y-STR hồn chỉnh Trong q trình đọc phân tích liệu cần lưu ý đến số vấn đề hay gặp phải để tránh đọc sai đỉnh (peak) hay nhận nhầm đỉnh giả Những trường hợp không đáp ứng đủ yêu cầu đỉnh thấp, mẫu bị nhiễm trình thao tác (peak lên nhiều locus thông thường nhiều hai locus DYS385ab DYF387S1ab) không đưa vào liệu thống kê chung 3.2.3 Bảng khảo sát tần suất 29 locus Y-STR thuộc kit PowerPlex® Y23 System YPlus Tần suất alen locus Y-STR thống kê tính tốn phần mềm Arlequin 1.3 để lập thành bảng tần suất phân bố alen locus Y-STR Bảng liệu tần suất alen locus so sánh với liệu chung tập hợp từ số liệu công bố trang web YHRD (www.yhrd.org) để thấy tương đồng sai khác tần suất phân bố alen 29 locus YSTR nghiên cứu Với locus alen có tần suất phân bố lớn in đậm bảng thống kê Nhận xét: Như từ việc lập hồ sơ Y-STR 400 mẫu nghiên cứu với kit PowerPlex® Y23 System YPlus lập bảng phân bố tần suất alen riêng 29 locus Y-STR Kết so sánh cho thấy có 16/29 locus có phân bố tần suất alen tương đối giống với liệu chung YHRD Ngược lại có 13/29 locus có phân bố khác so với liệu chung Ngoài thống kê cho thấy có 41 alen hiếm/ 29 locus Điều cho thấy sai khác cấu trúc di truyền quần thể người Kinh, Việt Nam so sánh với quần thể khác Bảng 3.2: Tần suất phân bố 29 locus Y-STR thuộc hai kit PowerPlex® Y23 System (PPY23) YPlus sAlen 10 11 12 DYS576 PPY23 YPlus 0.000 0.005 0.030 0.015 0.080 0.060 0.160 0.185 0.335 0.375 0.265 0.265 0.110 0.080 0.015 0.015 0.005 DYS391 PPY23 YPlus 0.020 0.005 0.010 0.025 0.630 0.615 0.325 0.330 0.015 0.025 Alen 12 13 14 15 16 DYS437 PPY23 YPlus 0.000 0.005 0.005 0.000 0.730 0.730 0.255 0.250 0.010 0.015 Alen 23 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 DYS449 PPY23 YPlus 0.005 0.040 0.160 0.080 0.090 0.105 0.095 0.145 0.125 0.050 0.040 0.040 0.025 Alen 12 13 14 15 16 17 18 DYS456 PPY23 YPlus 0.005 0.090 0.060 0.180 0.165 0.525 0.570 0.160 0.155 0.025 0.040 0.020 0.005 Alen 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Alen 11 12 13 14 15 DYS389 I PPY23 0.085 0.310 0.385 0.215 0.005 YPlus 0.085 0.350 0.385 0.180 DYS481 PPY23 YPlus 0.005 0.020 0.020 0.085 0.130 0.330 0.405 0.295 0.170 0.140 0.115 0.095 0.105 0.030 0.035 0.005 0.015 DYS570 Alen PPY23 YPlus 14 0.000 0.025 15 0.040 0.045 16 0.330 0.310 17 0.230 0.175 18 0.135 0.135 19 0.145 0.140 20 0.075 0.120 21 0.025 0.030 22 0.015 0.010 23 0.005 0.010 DYS518 Alen PPY23 YPlus 32 0.005 33 0.005 34 0.015 35 0.060 36 0.120 37 0.120 38 0.095 39 0.105 40 0.150 41 0.145 42 0.105 43 0.065 44 0.005 45 0.005 YGATAH4 Alen PPY23 YPlus 10 0.130 0.125 11 0.365 0.425 12 0.465 0.425 13 0.040 0.025 Alen 19 21 22 23 24 25 26 27 28 Alen 10 11 12 13 14 15 DYS448 PPY23 YPlus 0.010 0.010 0.045 0.425 0.530 0.010 0.235 0.215 0.005 0.180 0.155 0.115 0.055 0.010 DYS549 PPY23 YPlus 0.005 0.175 0.560 0.235 0.015 0.010 Alen 18 19 20 21 22 23 24 25 DYS635 PPY23 YPlus 0.005 0.005 0.050 0.030 0.130 0.110 0.365 0.405 0.195 0.205 0.190 0.195 0.050 0.040 0.015 0.010 Alen 10 11 12 13 14 15 DYS393 PPY23 YPlus 0.000 0.005 0.000 0.025 0.375 0.310 0.180 0.165 0.400 0.465 0.045 0.030 Alen 10 11 12 13 DYS643 PPY23 YPlus 0.015 0.075 0.190 0.290 0.350 0.080 Alen 16 17 18 18.2 19 19.2 20 21 22 Alen 25 27 28 29 30 31 32 33 DYS389 II PPY23 YPlus 0.000 0.005 0.050 0.095 0.295 0.260 0.355 0.340 0.225 0.230 0.060 0.055 0.015 0.010 0.005 Alen 10 11 12 13 14 DYS533 PPY23 0.005 0.340 0.445 0.190 0.015 0.005 Alen 22 23 24 25 26 DYS390 PPY23 0.025 0.255 0.360 0.305 0.055 Alen 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 DYS458 PPY23 YPlus 0.010 0.005 0.005 0.025 0.015 0.120 0.135 0.170 0.190 0.195 0.200 0.310 0.295 0.140 0.085 0.025 0.045 0.015 0.010 0.000 0.005 Alen 10 11 12 13 DYS460 PPY23 YPlus 0.110 0.645 0.190 0.050 0.005 YPlus 0.390 0.435 0.165 0.010 YPlus 0.035 0.180 0.385 0.365 0.035 Alen 12 13 14 15 16 17 Alen 10 11 12 14 Alen 10 11 12 13 14 15 Alen 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Alen 10 11 12 13 14 15 DYS19 PPY23 0.045 0.120 0.415 0.355 0.065 DYS438 PPY23 0.005 0.005 0.840 0.120 0.030 DYS439 PPY23 0.035 0.255 0.530 0.160 0.015 0.005 YPlus 0.005 0.015 0.135 0.450 0.330 0.065 YPlus 0.005 0.005 0.825 0.145 0.015 0.005 YPlus 0.025 0.260 0.520 0.160 0.030 0.005 DYS627 PPY23 YPlus 0.005 0.005 0.005 0.065 0.080 0.230 0.230 0.235 0.100 0.045 DYS392 PPY23 YPlus 0.010 0.100 0.045 0.035 0.030 0.655 0.700 0.200 0.205 0.010 0.010 Bảng 3.3 Tần suất phân bố alen locus DYS385a/b DYF387S1 DYS385a/b Alen PPY23 9, 17 11,11 11,12 11,13 11,14 11,15 11,17 11,18 11,19 11,20 12,12 12,12.3 12,13 12,14 12,15 12,16 12,17 12,18 12,19 12,20 12,21 13,13 13,14 13,15 13,16 13,17 0.005 0.015 13,18 13,19 0.005 0.005 0.005 0.005 0.035 0.010 0.010 0.025 0.005 0.005 0.005 0.015 0.020 0.050 0.035 0.040 0.010 16.000 3.000 YPlus 0.005 0.015 0.005 0.005 0.020 0.005 0.010 0.010 0.015 0.005 0.015 0.020 0.030 0.035 0.055 0.005 0.050 0.080 0.015 0.015 0.015 0.045 0.150 0.120 0.185 0.105 DYF387S1 Alen PPY23 YPlus Alen YPlus 13,20 13,21 13,22 14,14 14,15 14,16 14,17 14,18 14,19 14,20 14,21 15,15 15,16 15,17 15,18 15,19 15,20 15,21 15,22 15,23 16,17 16,18 16,19 16,20 16,21 17,20 18,19 0.040 0.005 0.010 0.035 0.010 0.005 0.005 34,34 34,36 34,37 34,40 35,36 35,37 35,38 35,39 35,40 36,36 36,37 36,38 36,39 36,40 36,41 37,37 0.010 0.005 0.005 0.005 0.005 0.010 0.045 0.015 0.010 0.040 0.050 0.100 0.070 0.025 0.015 0.090 37,38 37,39 37,40 37,41 38,38 38,39 38,40 39,39 39,40 39,41 40,40 40,41 0.140 0.080 0.015 0.010 0.095 0.040 0.030 0.040 0.020 0.005 0.020 0.005 0.010 0.005 0.005 0.025 0.020 0.010 0.015 0.005 0.030 0.020 0.015 0.015 0.005 0.005 0.005 0.020 0.015 0.010 0.015 0.010 0.025 0.010 0.010 0.010 0.005 0.060 0.025 0.015 0.005 0.005 0.015 0.015 0.005 0.005 Bảng tần suất phân bố Y-STR xây dựng nghiên cứu bảng có số lượng mẫu nghiên cứu số locus nhiều khảo sát quần thể người Việt Nam với số lượng mẫu phương pháp nghiên cứu đạt độ tin cậy cao Các công bố trước quần thể người Việt Nam chủ yếu thực với 13-17 Y-STR số lượng mẫu tương đối nhỏ 200 mẫu Việc xây dựng bảng tần suất locus Y-STR điều cần thiết, đáp ứng nhu cầu tính tốn số hình liên quan đến nam giới quần thể người Việt Nam Trên liệu chung YHRD thấy số lượng haplotype cơng bố sử dụng kit PowerPlex® Y23 System YPlus từ nghiên cứu với quần thể toàn giới lớn Ngược lại với quần thể người Việt Nam trước nghiên cứu số lượng haplotype cơng bố cịn hạn chế với 45 haplotype từ PowerPlex® Y23 System 47 halotype với YPlus đóng góp thơng số nghiên cứu nhỏ lẻ quần thể người Việt Nam Với nghiên cứu chúng tơi đóng góp thêm 200 haptype sử dụng PowerPlex® Y23 System vào liệu chung YHRD với mã số truy cập YA004576 nâng tổng số hapotype liệu YHRD quần thể người Việt Nam lên 245 với PowerPlex® Y23 System 10 3.2.5 Độ đa hình 29 thị Y-STR Từ tần suất phân bố alen chúng tơi tính tốn độ đa hình độ dạng gen (GD - gene diversity) locus Y-STR nghiên cứu Kết cho thấy hai locus với tổ hợp alen DYS385a/b DYS387S1a/b locus có độ da dạng di truyền cao (GD 0.941, 0.934) Với locus đơn alencó chung hai kit DYS458, DYS570 coi locus có độ đa hình cao (GD trung bình 0.809, 0.808) đồng thời locus có số alen nhiều (9 - 10 alen) Ngược locus DYS438 locus có độ đa hình thấp (GD khoảng 0.28) với - alen phát quần thể người Việt Nam, DYS437 (GD: 0.490), DYS392 (GD: 0.495), DYS391 (GD:0.507) Đây coi locus có độ đa hình thấp nhỏ 0.5 Các nghiên cứu trước quần thể người Kinh Việt Nam cho thấy DYS437, DYS438 locus có giá trị GD thấp Kết tương đồng với phân tích toàn cầu 23 locus Y-STR cho thấy locus DYS391, DYS437 DYS438 có giá trị GD thấp so với locus Y-STR khác quần thể người châu Ádựa theo nghiên cứu khảo sát tần suất 23 Y-STR từ 129 quần thể thuộc 51 quốc gia Josephine Purps cs Kết so sánh độ đa hình 23 locus Y-STR với số nước khác khu vực cho thấy tương đồng Độ đa hình locus YPlus so sánh với thống kê quần thể người châu Á Mỹ nhà sản xuất cung cấp cho thấy tương quan giá trị Tuy nhiên độ đa hình có chênh lệch đáng kể so với liệu chung locus DYS392, DYS391, DYS438 DYS460 Trong locus DYS392, DYS438, DYS460 quần thể người Việt Nam có độ đa hình thấp nhiều so với nước khu vực, ngược lại DYS391 lại có độ đa hình cao Những khác biệt phản ánh đặc trưng phân tách vốn gen quần thể người Kinh, Việt Nam so với quần thể khác Bảng 3.4 Độ đa dạng gen 29 locus Y-STR nghiên cứu so sánh với giá trị trung bình quần thể người châu Á STT Tên locus DYS576 PPY23 YPlus Độ lệch GD trung GD châu Độ lệch GD 0.776 GD 0.748 chuẩn 0.01 bình 0.762 Á 0.7996 chuẩn 0.02 DYS389 I 0.713 0.693 0.01 0.703 0.6564 0.02 DYS389 II 0.734 0.751 0.01 0.742 0.6585 0.04 DYS448 0.713 0.647 0.03 0.680 0.7650 0.04 DYS19 0.685 0.669 0.01 0.677 0.6920 0.01 DYS391 0.499 0.514 0.01 0.507 0.4136 0.05 DYS481 0.771 0.768 0.00 0.769 0.8416 0.04 DYS549 0.603 0.603 0.6425 0.02 DYS533 0.653 0.635 0.01 0.644 0.6265 0.01 10 DYS438 0.280 0.300 0.01 0.290 0.5707 0.14 11 DYS437 0.404 0.406 0.00 0.405 0.4891 0.04 10 11 12 DYS570 0.795 0.821 0.01 0.808 0.8313 0.01 13 DYS635 0.774 0.745 0.01 0.760 0.7700 0.01 14 DYS390 0.712 0.687 0.01 0.700 0.7325 0.02 15 DYS439 0.630 0.638 0.00 0.634 0.6823 0.02 16 DYS392 0.522 0.467 0.03 0.495 0.7434 0.12 17 DYS643 0.749 0.749 0.7510 0.00 18 DYS393 0.668 0.662 0.00 0.665 0.6597 0.00 19 DYS458 0.806 0.813 0.00 0.809 0.8275 0.01 20 DYS385 0.947 0.936 0.01 0.941 0.9741 0.02 21 DYS456 0.661 0.622 0.02 0.641 0.6093 0.02 22 YGATAH4 0.635 0.626 0.00 0.630 0.6345 0.00 23 DYS627 0.820 0.820 0.8120 0.00 24 DYS460 0.536 0.536 0.6750 0.07 25 DYS518 0.893 0.893 0.8670 0.01 26 DYS449 0.900 0.900 0.8820 0.01 27 DYF387S1 0.934 0.934 0.9450 0.01 Kết xếp theo độ đa hình 29 locus Y-STR hình 3.2 cho thấy số locus có độ đa hình từ 0.7-1 chiếm tỷ lệ nhiều với 84.2% (bao gồm 16/29 locus với locus có giá trị GD> 0.9, locus có GD nằm khoảng 0.8-0.9, locus GD khoảng 0.7-0.8), locus có GD khoảng 0.5 – 0.6 chiếm 31% có locus có GD ≤ 0.5 Qua cho thấy hầu hết locus nghiên cứu có độ đa hình cao, có tiềm lớn việc phân biệt cá thể nam giới quần thể người Kinh, Việt Nam khảo sát 3.2.6 Độ đa dạng haplotype (HD) khả phân biệt Với riêng kit phân tích 200 mẫu nghiên cứu quan sát thấy 200 haplotype khác nhau, nghĩa haplotype quần thể khảo sát Do độ đa dạng haplotype (haplotype diversity - HD) 1.00 Khả phân biệt (discriminating capacity - DC) tính tỷ số số haplotype khác quan sát thấy quần thể/ tổng số mẫu nghiên cứu Do haplotype nên khả phân biệt cá thể 100% với cá kit PowerPlex® Y23 System YPlus Điều phản ánh tiềm cao 29 locus Y-STR việc phân biệt cá thể nam khơng có liên quan huyết thống theo dịng cha Kết phù hợp với nghiên cứu Toan T.T khảo sát quần thể người Kinh, Việt Nam với tổ hợp 17 Y-STR Yfiler cho khả phân biệt 100% Cũng quần thể người Việt Nam nghiên cứu Koji Dewa khảo sát 119 mẫu với tổ hợp 13 Y-STR cho khả phân biệt 95% Điều lần cho thấy việc tăng số lượng Y-STR phân tích góp phần làm tăng độ đa dạng haplotype khả phân biệt 11 12 Nghiên cứu khảo sát với kit PowerPlex® Y23 System 129 quần thể khác giới cho thấy quần thể châu Á có khả phân biệt cao (> 97%), Châu Âu Châu Mỹ Latinh (DC khoảng 96%) cuối Châu Phi (DC khoảng 85%) 3.3 Nghiên cứu số chi thi mini Y-STR 3.3.1 Lựa chọn locus mini Y-STR Do yêu cầu kít thương mại phải khuếch đại đồng thời nhiều locus Y-STR khác nên để phân biệt trình điện di mao quản địi hỏi locus phải có kích thước khác Kết số locus Y-STR có kích thước lớn (>200 bp) khó để phân tích thành cơng với mẫu có ADN bị phân hủy, ADN bị đứt gãy nhiều Các mini Y-STR với đặc điểm có kích thước ngắn 200 bp phù hợp với loại mẫu sinh học phân huỷ có ADN bị đứt gãy nhiều Hiện nay, Việt Nam số lượng cơng trình nghiên cứu locus Y-STR cịn hạn chế chưa có nghiên cứu thiết kế cặp mồi khuếch đại locus mini Y-STR nhằm ứng dụng phân tích ADN cho mẫu sinh học phân hủy Vì vậy, để tạo điều kiện thuận lợi cho công tác giám định ADN giám định hài cốt Viện Pháp y quốc gia đạt kết tốt bên cạnh 29 locus Y-STR có kit nêu chúng tơi thử nghiên cứu locus Y-STR có tiềm ứng dụng giám định ADN với quần thể người Việt Nam Trong nghiên cứu lựa chọn locus có độ đa hình cao quần thể người Việt Nam, ngồi cịn có kích thước lớn kit thương mại cố gắng giảm tối thiểu kích thước locus Y-STR để đạt tỷ lệ phân tích thành cơng cao với mẫu bị phân hủy Trong số 29 thị Y-STR thuộc hai kit lựa chọn thị có độ đa hình cao > 0.6, có kích thước > 200 bp có khả rút gọn kích thước vùng lõi lặp Dựa tiêu chí chúng tơi lựa chọn thị Y-STR DYS481, DYS643, DYS533, DYS19, Y-GATA-H4 Đây thị nằm kit PowerPlex® Y23 System Bên cạnh chúng tơi thiết kế mồi để khuếch đại thêm thị DYS460 nằm YPlus thị mini Y-STR là: DYS505, DYS522, DYS508, DYS388 locus chưa có kit thương mại theo số nghiên cứu cơng bố cho thấy có độ đa hình cao, có tiềm ứng dụng phân tích Y-STR 3.3.2 Tối ưu hoá điều kiện phản ứng PCR Phản ứng PCR khảo sát với 10 cặp mồi 10 phản ứng PCR riêng rẽ Nhiệt độ gắn mồi locus dao động từ 56 – 58 oC Chu trình phản ứng PCR tối ưu hóa với điều kiện bao gồm: nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi Sản phẩm sau PCR kiểm tra gel Polyacryamide 6% Hình ảnh điện di cho thấy băng sản phẩm PCR rõ nét, băng phụ có kích thước cơng bố trước Kích thước locus dao động từ 91-213bp Điều cho thấy cặp mồi thiết kế có tính khả dụng cho việc khuếch đại locus Y-STR mong muốn 12 13 Phản ứng PCR khảo sát 10 phản ứng PCR riêng rẽ Chu trình phản ứng PCR tối ưu hóa với điều kiện bao gồm: nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi Sản phẩm sau PCR kiểm tra gel Polyacryamide 6% Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm sau PCR với 10 locus Y-STR gel Polyacrylamide 6% (Sử dụng thang chuẩn ILS 500 (Promega – Mỹ)) Việc thực phản ứng PCR đơn lẻ với mẫu nghiên cứu đòi hỏi tiêu tốn nhiều hóa chất, thời gian cơng sức Phản ứng PCR đa mồi thiết kế dựa việc trộn nhiều cặp mồi vào phản ứng nhằm khuếch đại đồng thời nhiều locus Y-STR cải tiến phù hợp Nguyên tắc để lựa chọn locus Y-STR khuếch đại locus phải có nhiệt độ gắn mồi tương đồng nhau, ngược lại sản phẩm PCR phải có kích thước chênh lệch để đảm bảo phân tách trình điện di kiểm tra Trong nghiên cứu locus Y-STR có kích thước khoảng 100 - 200 bp, kích thước chênh lệch khơng nhiều nên số locus phản ứng PCR đa mồi không vượt locus Chúng tối ưu nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi khuếch đại thành công số 10 locus Y-STR thông qua phản ứng PCR đa mồi khác Phản ứng multiplex PCR với nhiều cặp mồi sở để tạo nên kit STR Y-STR thương mại phân tích lên tới 27 locus thông qua phản ứng PCR 13 14 Hình 3 Ảnh điện di gel polyacrylamide phản ứng PCR đa mồi 3.3.3 Giải trình tự xác định cấu trúc lặp locus Y-STR Kết giải trình tự máy ABI 3500, Pop7, Cappilarry 50 cm với chương trình chạy hãng cho trình tự có đỉnh sóng rõ ràng Việc giải trình tự cho phép xác định rõ motif lặp, số lần lặp đặc trưng locus Y-STR Ví dụ locus DYS505 có cấu trúc lặp TCCT với số lần lặp 15 alen 15 (hình 3.4) Hình 3.4 Kết giải trình tự locus DYS505 Kết giải trình tự locus DYS505 cho thấy kích thước đoạn khoảng 170 bp cấu trúc lặp TCCT Việc giải trình tự cho phép xác định rõ motif lặp, số lần lặp đặc trưng locus Y-STR Ví dụ locus DYS505 có cấu trúc lặp TCCT với số lần lặp 15 alen 15 (hình 3.4) Đây sở để xây dựng thang alen cho locus chưa có kit thương mại Việc đếm số lần lặp cấu trúc lõi phương pháp giải trình tự cho kết trùng khớp với việc phân tích kit thương mại minh họa locus DYS643 (Hình 3.5) Trong nghiên cứu với mẫu xác định rõ alen xây dựng thang alen thị DYS643 (đã có PowerPlex® Y23 System) dựa vào phương pháp mini Y-STR Thang alen làm sở để xác định số alen xác mà 14 15 khơng cần phải giải trình tự lại phân tích sau đồng thời sở để phân biệt sai khác alen mẫu Hình 3.5 Kết tạo thang chuẩn mini Y-STR với thị DYS643 A Kết GTT với số lần lặp CTTTT 11, B Kết phân tích sử dụng PowerPlex® Y23 System với số alen 11, C: Thang chuẩn thị DYS643 với alen 10, 11,12, 13 3.3.4 Kết phân tích 10 mini Y-STR mẫu phân hủy Dựa vào phương pháp PCR đa mồi với 10 cặp mồi nêu ứng dụng việc phân tích 50 mẫu nghiên cứu bị phân hủy mẫu xương hài cốt liệt sỹ thu thập từ nghĩa trang Với mẫu răng, xương bị phân hủy tỷ lệ khuếch đại thành công 10 mini Y-STR dao động từ 44 % đến 82% Cụ thể: có locus DYS533 DYS481 đạt tỷ lệ thành công cao (lần lượt 80%, 76.7%) với kích thước locus khoảng 100 - 150 bp Tiếp theo locus DYS388, DYS508, DYS460, YGATA-H4 đạt tỷ lệ thành công từ 66.7 – 73.3% với khoảng kích thước khuếch đại dao động từ 91 – 141 bp Hai locus DYS522, DYS505 với kích thước khoảng 112 – 176 bp đạt tỷ lệ thành công 53,3% 56,7% Riêng hai locus có kích thước lớn DYS19 (177-213 bp) DYS643 (121 – 166 bp) đạt tỷ lệ khuếch đại thấp, 43.3 % 50% Bảng Bảng thống kê tỷ lệ khuếch đại thành công 10 locus mini Y-STR 30 mẫu bị phân hủy Locus DYS533 DYS19 DYS481 DYS643 Kích thước PPY23 245-285 312-352 139-184 368-423 Kích thước YPlus 338-379 184-224 207-252 15 Kích thước dùng mini Y-STR 107-127 177-213 119-149 121-166 Tỷ lệ khuếch đại thành công 80.0% 43.3% 76.7% 50.0% 16 Y-GATA-H4 DYS460 DYS505 DYS508 DYS388 DYS522 374-414 236-264 79-109 121-141 101-121 164-176 105–129 91-106 112–132 70.0% 60.0% 56.7% 73.3% 66.7% 53.3% Điều lý giải locus có kích thước lớn (ví dụ locus DYS19 ~ 200bp) tỷ lệ khuếch đại thành cơng thấp Đặc biệt với mẫu hài cốt có ADN bị phân hủy, đứt gãy nhiều Ngồi yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất PCR chất lượng mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu với mẫu hài cốt lâu năm phân hủy nặng (chỉ số phân hủy mức cao), ADN bị đứt gãy nhiều việc khuếch đại hết locus Y-STR gặp khó khăn Đặc biệt điều kiện khí hậu Việt Nam nóng ẩm, nhiều loại vi sinh vật lòng đất ảnh hưởng lớn đến chất lượng mẫu xương Dựa theo kết nghiên cứu thấy có khoảng mẫu phân tích khơng thành cơng sử dụng mini STR Có thể thấy việc ứng dụng mini Y-STR giải nhiều tình đặc biệt công tác giám định mẫu phân hủy 3.4 Hiệu thị Y-STR xét nghiệm ADN 3.4.1 Hiệu phân tích mẫu bị phân huỷ Sau nghiên cứu thành công kỹ thuật khuếch đại mini Y-STR với cặp mồi tương ứng, thử ứng dụng vào số trường hợp giám định cụ thể tại Khoa Y - Sinh học, Viện Pháp y quốc gia 3.4.1.1 Trong công tác giám định án Hiện năm Khoa Y sinh học thực nhiệm vụ giám định vụ án từ định trưng cầu giám định quan công an Rất nhiều mẫu thu thập trường vụ án thu sau thời điểm xảy vụ án thời gian khiến chất lượng ADN mẫu vật khơng cịn ngun vẹn lượng ADN thu thập mẫu (mẫu dạng vi vết) Điều gây khó khăn nhiều cho công tác giám định đưa kết luận Với hiệu nghiên cứu mini Y-STR ứng dụng thực tế giám định thu kết định minh họa qua trường hợp cụ thể Những trường hợp xét nghiệm so sánh hồ sơ mẫu thu trưởng mẫu thu nạn nhân có hồ sơ Y-STR PowerPlex® Y23 System YPlus không lên đủ tất locus, đặc biệt locus có kích thước lớn nên không đủ sở để so sánh với mẫu nghi phạm Khi việc phân tích thêm mini Y-STR giúp bổ sung liệu vào hồ sơ Y-STR, cho phép đưa kết luận mẫu thu trường (nạn nhân) trùng/khác với mẫu thu từ nghi phạm Đây biện pháp có hiệu số vụ án giám định 3.4.1.2 Trong công tác giám định danh tính liệt sỹ Trong cơng tác giám định danh tính hài cốt liệt sỹ; hài cốt – mẫu có ADN bị phân huỷ, đứt gãy nhiều Thông thường để thực giám định hài cốt dựa vào phân tích so sánh trình tự 16 17 vùng siêu biến HV1, HV2 ADN ty thể nhằm xác định mối quan hệ huyết thống theo dòng mẹ Tuy nhiên số trường hợp phân tích vùng HV1, HV2 ADN ty thể cho thấy có sai khác nhỏ 1-2 vị trí Sự sai khác khác huyết thống cá thể đột biến ty thể, amin hoá mẫu tiếp xúc lâu với điều kiện môi trường không thuận lợi Với trường hợp không đủ sở để kết luận mối quan hệ huyết thống theo dịng mẹ Hoặc có trường hợp có mẫu so sánh theo dòng cha (con trai, cháu trai ) khơng thể áp dụng phương pháp phân tích ADN ty thể Khi việc phân tích thêm mini Y-STR cung cấp liệu bổ sung có giá trị quan trọng việc đưa kết luận cuối 3.4.1.3 Hiệu kit phân tích mẫu phân hủy Bên cạnh mini Y-STR hai kit PowerPlex® Y23 System YPlus gồm số alen vừa có kích thước nhỏ vừa có độ đa dạng gen locus gen lý tưởng cho việc phân tích bổ sung trường hợp giám định ADN với mẫu bị phân hủy nhiều, ADN bị đứt gãy thành đoạn nhỏ mẫu xương hài cốt, mẫu sau thảm họa, thiên tai… Để đánh giá tiềm phân tích với mẫu bị phân huỷ chúng tơi lọc riêng liệu tập hợp Y-STR có kích thước < 220 bp thuộc kit phân tích với 400 mẫu nghiên cứu tính tốn số di truyền liên quan Bảng 3.6 So sánh số di truyền thu từ tập hợp marker Y-STR có kích thước < 220 bp PowerPlex® Y23 System (PPY23) YPlus Số haplotype Chỉ xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất 10 cá thể Tổng số locus Tổng số haplotype quan sát HD DC Bộ haplotype 188 0 0 0 193 0.99954 97% Bộ haplotype 178 1 0 0 10 185 0.99829 93% Bộ PowerPlex® Y23 System gồm locus có kích thước < 220 bp (DYS576, DYS389I, DYS391, DYS481, DYS570, DYS635, DYS393 DYS458) Bộ YPlus gồm 10 locus có kích thước < 220 bp (DYS576, DYS389I, DYS458, DYS456, DYS390, DYS570, DYS437, DYS393, DYS439 DYS460) Kết Bảng 3.5 cho thấy với tập hợp Y-STR thuộc PowerPlex® Y23 System xuất haplotype giống 2, cá thể YPlus có haplotype giống 2,3,4 cá thể Số haplotype quan sát PowerPlex® Y23 System YPlus 193, 185 haplotypes (trên tổng số 200 mẫu 17 18 phân tích) Khả phân biệt PowerPlex® Y23 System 97% nhiều đáng kể so với YPlus 93% Như dù có số lượng Y-STR tập hợp Y-STR kích thước < 220 bp PowerPlex® Y23 System lại có khả phân biệt tốt so với tập hợp YPlus Điều lý giải số locus có kích thước ngắn thuộc PowerPlex® Y23 System có locus có độ đa hình cao DYS481 (GD: 0.77) DYS635 giúp tăng đáng kể khả phân biệt Kết phân tích khả tạo lập hồ sơ Y-STR gợi ý việc thiết kế lựa chọn Y-STR kit thương mại để đảm bảo vừa có khả phân tích mẫu có ADN bị phân huỷ, ADN nồng độ thấp vừa có khả tạo haplotype có độ đa dạng cao Có thể nói bên cạnh STR nhân, Y-STR thị lý tưởng việc xác định quan hệ huyết thống, định danh cá thể, điều tra hình 3.4.2 Hiệu sử dụng Y-STR phân tích mẫu lẫn (mixture sample) Trong nghiên cứu này, chúng tơi thử phân tích 50 mẫu lẫn với kit PowerPlex® Y23 System YPlus nhằm đánh giá khả tạo hồ sơ Y-STR hoàn chỉnh kit Những mẫu mẫu dịch âm đạo nạn nhân nữ thu thập từ vụ giám định án hiếp dâm/tấn cơng tình dục Khoa Y sinh học, Viện Pháp y quốc gia Phân tích STR nhân kit Powerplex® fusion system (Promega) mẫu cho thấy hồ sơ ADN thu chủ yếu dạng mẫu lẫn nam nữ nên sử dụng để truy nguyên cá thể Hình 3.6 Đồ thị so sánh khả tạo hồ sơ Y-STR sử dụng PowerPlex® Y23 System Yplus Kết cho thấy việc sử dụng kit PowerPlex® Y23 System cho số lượng hồ sơ Y-STR hoàn chỉnh nhiều kit YPlus Ngược lại số mẫu lên phần không lên tất locus YSTR kit YPlus lại nhiều so với PowerPlex® Y23 System Có số ngun nhân lý giải kết Thứ nhất, số lượng locus Y-STR kit YPlus nhiều PowerPlex® Y23 System nên lý thuyết tỷ lệ khuếch đại thành công tất Y-STR thấp Thứ hai, phần lớn locus bổ sung YPlus có kích thước lớn nên khó khuếch đại thành cơng đặc biệt mẫu có bị phân huỷ ADN bị đứt gãy nhiều mẫu có nồng độ ADN thấp Ngồi mẫu ADN có nguồn 18 19 gốc từ trường vụ án thường có chứa chất ức chế phản ứng PCR axit tannic axit humic PowerPlex® Y23 System YPlus cho thấy độ nhạy tương tự PowerPlex® Y23 System cho thấy khả chịu axit humic cao YPlus theo nghiên cứu trước Do đó, PowerPlex® Y23 System phù hợp để phân tích mẫu thu thập từ trường vụ án – dạng mẫu dễ dàng bị nhiễm điều kiện mơi trường Như với việc phân tích thêm liệu Y-STR giúp bổ sung thông tin, tăng tỷ giải thành công trường hợp có mẫu lẫn, hỗ trợ đáng kể cho việc đưa kết luận cho vụ án 3.4.3 Hiệu việc tăng khả phân biệt cá thể So với kit trước mà phổ biến Yfiler gồm 17 thị Y-STR, kit PowerPlex® Y23 System YPlus bổ sung thêm 12 locus Các locus bổ sung đem lại ưu đáng kể cho kit Đây locus lần khảo sát quần thể người Kinh, Việt Nam so sánh với nghiên cứu trước Việc bổ sung thêm locus đa kit YPlus PowerPlex® Y23 System (là locus có nhiều phiên STR vị trí khác NST Y) so với kit trước DYF387S1a/b DYSS385a/b chứng tỏ locus có độ đa dạng gen cao góp phần đáng kể việc tăng khả phân biệt kit Ngồi số 29 thị Y-STR có Y-STR locus có tốc độ đột biến nhanh (rapidly mutating Y-STR, gọi tắt RM Y-STR) Bộ kit PowerPlex® Y23 System bổ sung 02 RM Y-STR DYS570, DYS576; kit YPlus bổ sung RM Y-STR Các RM Y-STR có vai trị quan trọng việc phân biệt cá thể nam có quan hệ huyết thống gần gũi (ví dụ: anh trai - em trai, bố - trai) Để đánh giá hiệu locus bổ sung kit PowerPlex® Y23 System YPlus chúng tơi lập bảng so sánh giá trị HD, DC với tổ hợp Y-STR khác thường dùng phân tích hình Các tổ hợp bao gồm: - Bộ haplotype tối thiểu (MHT - European Minimal Haplotype) bao gồm locus: DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392 DYS393 - Bộ haplotype theo khuyến cáo Hiệp hội Các nhà khoa học làm việc lĩnh vực phân tích ADN (SWGDAM): bao gồm locus MHT locus: DYS438, DYS439 - Bộ AmpFLSTR™ Yfiler™ PCR Amplification Kit (gọi tắt Yfiler, hãng ThermoFisher) phát triển vào năm 2004 gồm 11 locus theo khuyến cáo SWGDAM kể locus có độ đa hình cao là: DYS437, DYS448, DYS456, DYS458, Y GATA H4, DYS635 - Bộ PowerPlex® Y23 System YPlus: bao gồm 17 locus nêu thêm locus 19 20 Bảng So sánh số lượng haplotype quan sát số thống kê thu từ tập hợp marker Y-STR haplotype từ liệu 200 mẫu với PowerPlex® Y23 System (PPY23) Số haplotype quan sát Chỉ xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Xuất cá thể Tổng số locus Tổng số haplotype quan sát HD DC Bộ haplotype Bộ haplotype Bộ tối thiểu SWGDAM Yfiler (9 locus) 153 11 171 0.9977 86% (11 locus) 169 11 1 11 182 0.9986 91% (17 locus) 192 0 0 17 196 0.9958 98% Bộ PPY23 (23 locus) 200 0 0 23 200 100% Kết so sánh cho thấy việc gia tăng số lượng marker Y-STR phân tích (từ marker Haplotype Y lên 23-27 marker YPlus) làm gia tăng đáng kể số haplotype độc (chỉ xuất cá thể nam quần thể nghiên cứu), giảm số lượng haplotype xuất người trở lên Qua làm tăng tổng số haplotype quan sát từ 171 -173 haplotype (Bộ locus) -> 193 - 196 haplotype (Bộ 17 locus) lên 200 haplotype (Bộ 23 27 locus) Từ độ đa dạng haplotype khả phân biệt gia tăng Cụ thể giá trị DC tăng từ 86% MHT-> 98 % Yfiler lên 100% PowerPlex® Y23 System YPlus Từ kết nghiên cứu mạnh dạn áp dụng việc phân tích thị YSTR từ hai kit PowerPlex® Y23 System Yfiler Plus cơng tác giám định Khoa Y sinh học đạt nhiều kết Trong giám định huyết thống, thị Y-STR sử dụng giám định trường hợp khơng cịn mẫu người bố so sánh, xác định mối quan hệ huyết thống người dòng cha anh – em trai, ông nội/chú/ bác – cháu trai Đặc biệt với số trường hợp xét nghiệm huyết thống cha – mà có sai khác locus - nghi ngờ đột biến lỗi phân tích, chúng tơi áp dụng phân tích mở rộng Y-STR để đảm bảo đưa kết luận xác 3.4.4 Ứng dụng thị Y-STR để so sánh khoảng cách di truyền quần thể Khoảng cách di truyền thước đo khác biệt di truyền loài quần thể lồi, đo khoảng cách thời gian từ tổ tiên chung hay mức độ phân hóa Các quần thể có nhiều alen tương tự có khoảng cách di truyền nhỏ Điều chúng có liên quan chặt chẽ có tổ tiên chung gần Do kiểu di truyền đặc trưng nam giới chất đơn bội nhiễm sắc thể Y, thị NST Y có độ nhạy cao so với thị NST thường việc đánh giá trôi dạt di truyền (genetic drift) hiệu ứng sáng lập Y-STR sử dụng rộng rãi để đánh giá cấu trúc khác biệt quần thể cách kiểm tra khoảng cách di truyền theo cặp Trong 20 21 nghiên cứu công cụ online AMOVA www.yhrd.org sử dụng để tính tốn khoảng cách di truyền dựa vào so sánh theo cặp (giá trị Rst) xác suất kết hợp (P value) quần thể người Việt Nam nghiên cứu với số liệu công bố trước 18 quần thể khác giới Giá trị Rst nhỏ P-value lớn thể khoảng cách di truyền gần khơng có ý nghĩa khác biệt quần thể Kết cho thấy quần thể người Kinh (Việt Nam) nghiên cứu có ý nghĩa khác biệt so với quần thể người Châu Phi châu Âu (Namibia Bỉ) với Rst > 0.2, P < 0.001 Ngược lại, quần thể người Kinh, Việt Nam có khoảng cách di truyền gần với quần thể người Thái Lan người Hán (Trung Quốc) so với quần thể người châu Á khác Trong khoảng cách di truyền người Kinh (Việt Nam) người Thái Lan (Rst =0.0085, P = 0.0157) gần gũi Khoảng cách di truyền gần gũi quần thể người Kinh, Việt Nam người Thái Lan đề cập số nghiên cứu Cụ thể dự án hệ gen người Việt Nam công bố năm 2019 cho thấy người Kinh Thái có tương đồng cao gen mối quan hệ tiến hóa chặt chẽ Việc phân cụm chia tách quần thể hình dung rõ cách sử dụng phân tích tỷ lệ đa chiều (MDS) dựa giống khoảng cách di truyền theo cặp quần thể không gian đa chiều nhờ cơng cụ AMOVA (hình 3.7) Hình 3.7 Sơ đồ biểu thị khoảng cách di truyền quần thể không gian chiều Quan trọng hơn, so sánh khoảng cách di truyền tập hợp haplotype Y (MHT) 400 mẫu từ nghiên cứu quần thể Việt Nam khác công bố YHRD cho thấy chênh lệch giá trị Rst không đáng kể Điều gợi ý khoảng cách tối thiểu nhóm mẫu quần thể dân tộc Việt Nam nói chung tương đối tương đồng, có sai khác cấu trúc di truyền Qua phân tích nói tiềm ứng dụng thị Y-STR lớn góp phần bổ sung liệu nhiều loại xét nghiệm ADN khác Kết luận án với tổng cộng 29 Y-STR 21 22 thuộc kit thương mại phổ biến 10 thị mini Y-STR nghiên cứu, khảo sát rõ thị Y-STR có độ đa hình hiệu khuếch đại cao áp dụng nhiều loài sở để lựa chọn phát triển thị phân tích riêng cho nam giới người Việt Nam CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong nghiên cứu, khảo sát đặc điểm 29 thị Y-STR quần thể nam giới phân bố miền Bắc, Việt Nam Cụ thể: - Bảng tần suất phản ánh đặc trưng cấu trúc di truyền quần thể nam giới người Kinh, Việt Nam so sánh với quần thể khác có ý nghĩa tính tốn số quan hệ huyết thống theo dòng cha - Kết khảo sát cho thấy số thị có độ đa hình cao > 0.7 (chiếm 55.2% tổng số locus khảo sát) hứa hẹn locus có độ đa hình cao, có tiềm lớn việc phân biệt cá thể nam quần thể người Kinh, Việt Nam - Kết khảo sát sử dụng hai kit Y-STR phổ biến PowerPlex®Y23 system (Promega) Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific) cho khả phân biệt 100% cá thể tập hợp 400 mẫu nghiên cứu Xây dựng thành cơng quy trình khuếch đại 10 mini Y-STR thị có kích thước nhỏ 200bp, độ đa hình cao Kết phân tích với mẫu bị phân hủy cho thấy tỷ lệ khuếch đại 10 mini Y-STR dao động từ 44 % đến 82% góp phần bổ sung liệu kết phân tích với thị Y-STR thơng thường không thành công Kết khảo sát mẫu thực tế cho thấy 29 thị Y-STR 10 mini Y-STR có tiềm cao nhiều hướng ứng dụng: - Trong xét nghiệm huyết thống theo dịng cha, phân tích mẫu có chất lượng kém, mẫu bị phân hủy, mẫu lẫn từ nhiều nguồn ADN Tùy vào nhu cầu phân tích lựa chọn loại thị Y-STR phù hợp - Nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể: kết so sánh tần suất, độ phân bố 29 thị Y-STR nghiên cứu cho thấy cấu trúc di truyền đồng nhóm dân tộc quần thể người Việt Nam có khoảng cách di truyền gần gũi với quần thể người Thái Lan Kiến Nghị Nhóm nghiên cứu xin đưa số kiến nghị để nghiên cứu hoàn thiện thời gian tới: 22 23 Tiến hành khảo sát thêm tần suất phân bố alen thị Y-STR với nhóm dân tộc khác phổ biến quần thể người Việt Nam, đặc biệt tần suất locus có độ đa hình cao Phát triển phương pháp khuếch đại mini Y-STR thị Y-STR có độ đa hình cao mồi gắn huỳnh quang điện mao quản để tạo nên kit riêng cho người Việt Nam NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây nghiên cứu Việt Nam khảo sát toàn diện 29 thị Y-STR quần thể nam giới dân tộc Kinh, Việt Nam với tổng cộng 400 mẫu nghiên cứu số thị Y-STR lớn so với nghiên cứu trước quần thể người Kinh, Việt Nam Nghiên cứu xây dựng bảng phân bố tần suất alen 29 thị Y-STR sở để tính tốn độ hồ sơ ADN quần thể số có quan hệ họ hàng (kinship index) hồ sơ ADN Kết nghiên tìm thị Y-STR có số alen lớn, độ đa hình cao, tiềm ứng dụng lớn phân biệt cá thể nam DYS385, DYF387S1, DYS518, DYS 627, DYS458 thị có alen gặp quần thể Đây nghiên cứu Việt Nam thực việc khảo sát mini Y-STR - thị có kích thước ngắn 200 bp, có hiệu cao việc phân tích mẫu bị phân hủy so với thị Y-STR thông thường kit thương mại Nghiên cứu khảo sát tiềm ứng dụng thị Y-STR kit thương mại mini Y-STR theo nhiều hướng lĩnh vực giám định pháp y Việt Nam bao gồm: giám định mẫu có quan hệ huyết thống theo dịng cha, giám định mẫu khoa học hình đặc biệt với trường hợp mẫu lẫn nam nữ, giám định mẫu lâu năm, mẫu bị phân huỷ Bên cạnh kết từ 400 hồ sơ Y-STR ứng dụng để xây dựng khoảng cách di truyền quần thể người Việt Nam nghiên cứu với nhóm quần thể khác giới DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Hà Hữu Hảo, Lê Tuấn Anh, Chu Thị Thủy, Đinh Thị Lan, Hoàng Thái Thanh, Nguyễn Thị Phương Liên, Phạm Thị Trà (2018), “Nghiên cứu tính đa hình locus Y - STR quần thể dân tộc Kinh Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, số (1073), 6-9 Hà Hữu Hảo, Nguyễn Đức Nhự, Lê Tuấn Anh, Chu Thị Thủy, Đinh Thị Lan, Hoàng Thái Thanh, Nguyễn Thị Phương Liên, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2018), “Đặc điểm di truyền 27 Locus Y-STR quần thể người kinh, Việt Nam sử dụng Yfiler Plus PCR Amplication Kit”,Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018, 564-569 23 24 Hao Huu Ha, Trang Hong Nguyen, Linh Huyen Tran, Hanh Thi Hong Nguyen, Ha Hoang & Hoang Ha Chu (2019), “Genetic characteristics of 23 Y-chromosomal STRs in the Kinh population in Northern Vietnam”, International Journal of Legal Medicine, volume 133: 1403–1404 Hà Hữu Hảo, Lê Tuấn Anh, Chu Thị Thủy, Đinh Thị Lan, Hoàng Thái Thanh, Nguyễn Thị Phương Liên (2019), “Nghiên cứu ứng dụng mini y-str giám định mẫu bị phân hủy Viện pháp y quốc gia”, Tạp chí Y học thực hành, số 11 (1128), 6-9 Hao Huu Ha, Nhu Nguyen Duc, Anh Le Tuan, Thuy Thi Chu, Lan Dinh Thi, Lien Nguyen Thi Phuong, Thanh Hoang Thai (2020), A case study on sexual assault involving an individual with a large 24 Y chromosome deletion and two X chromosomes genotype The Asian sciences network newsletter,Issue 10: 24-25 24