Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.

Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - HÀ HỮU HẢO NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ THỊ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Y ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÁP Y LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI – 2023 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ THỊ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Y ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÁP Y Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Hà PGS.TS Lê Văn Sơn Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu số kết nghiên cứu, cộng tác với nhà khoa học khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành hội nghị nước quốc tế với đồng ý cho phép đồng tác giả; kết lại luận án chưa tác giả công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Hà Hữu Hảo LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Hà - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tận tình suốt trình thực luận án Thầy không truyền thụ cho tơi nhiều kiến thức chun mơn mà cịn giúp tơi bồi đắp lịng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Đó tảng cho trình thực luận án hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Người thầy sát dìu dắt, truyền lại cho tơi phương pháp nghiên cứu phân tích trình tự hệ gen ty thể niềm say mê nghiên cứu Hệ gen học Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ sinh tận tình hướng dẫn tơi hồn thành thủ tục suốt trình học tập, làm nghiên cứu sinh học viện Tôi xin chân thành cảm ơn TS.BS Nguyễn Đức Nhự, Viện trưởng Viện Pháp y quốc gia nhiệt tình giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận án Trong suốt trình thực Đề tài nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ tận tình chun mơn nhà khoa học, cán nghiên cứu công tác Khoa Y sinh học – Viện Pháp y quốc gia Họ bên cạnh giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Với tất lịng biết ơn, tơi xin dành cho bố mẹ, gia đình bạn bè ln tin tưởng, thơng cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn thời gian qua, giúptơi hồn thành tốt luận án Nghiên cứu sinh Hà Hữu Hảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phân tích ADN giám định pháp y 1.2 Các loại thị phân tử (marker) 1.3 Tổng quan thị STR .8 1.3.1 Đặc điểm gen 1.3.2 Phân loại STR 1.4 STR nhiễm sắc thể giới tính Y 11 1.5 Các hướng ứng dụng thị STR nhiễm sắc thể giới tính Y .12 1.5.1 Y-STR nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể (genetic structure) .12 1.5.2 Ứng dụng Y-STR xác định huyết thống 14 1.5.3 Ứng dụng Y-STR lĩnh vực khoa học hình 15 1.6 Phương pháp phân tích thị Y-STR 19 1.6.1 Phân tích dựa phương pháp điện di mao quản 19 1.6.2 Phân tích sử dụng kit Y-STR thương mại hóa 25 1.6.3 Phân tích sử dụng chiến lược mini STR 28 1.7 Tầm quan trọng việc tính tốn tần suất alen thị STR 30 1.8 Tình hình nghiên cứu thị Y-STR 31 1.8.1 Tình hình nghiên cứu giới .31 1.8.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 35 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu nghiên cứu 37 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 37 2.1.2 Hoá chất nghiên cứu 37 2.2 Thiết bị sử dụng 39 Quantus™ Fluorometer 39 2.3 Phương pháp nghiên cứu .39 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN 39 2.3.2 Phương pháp định lượng ADN 42 2.3.3 Phương pháp điện di gel 42 Phương pháp điện di sử dụng để xác định có mặt ADN đồng thời phân biệt khác kích thước đoạn ADN quan tâm 42 2.3.4 Phương pháp PCR .43 2.3.5 Phương pháp điện di mao quản 45 2.3.6 Phương pháp giải trình tự gen 46 2.3.7 Phân tích xử lý số liệu 46 2.4 Đạo đức nghiên cứu .47 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .48 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ mẫu nghiên cứu 49 3.1.1 Mẫu tách chiết theo phương pháp Chelex 49 3.1.2 Mẫu tách chiết kit thương mại .50 3.2 Kết khảo sát 29 thị Y-STR từ kit PPY23 Yfiler Plus 51 3.2.1 Xây dựng hồ sơ Y-STR 51 3.2.2 Bảng phân bố tần suất alen thuộc 29 thị Y-STR 53 3.2.3 Đánh giá đặc điểm alen thuộc 29 thị Y-STR .70 3.2.4 Độ đa hình 29 thị Y-STR .73 3.2.5 Độ đa dạng haplotype (HD) khả phân biệt 76 3.3 Kết nghiên cứu số thị mini Y-STR 77 3.3.1 Lựa chọn thị mini Y-STR .77 3.3.2 Tối ưu hoá phản ứng PCR 78 3.3.3 Giải trình tự xác định cấu trúc lặp mini Y-STR 81 3.3.4 Tỷ lệ khuếch đại thành công mini Y-STR 83 3.4 Hiệu thị Y-STR xét nghiệm ADN 86 3.4.1 Hiệu phân tích mẫu bị phân huỷ 86 3.4.3 Hiệu sử dụng Y-STR phân tích mẫu lẫn (mixture sample) 95 3.4.1 Hiệu việc tăng khả phân biệt cá thể 98 3.4.4 Ứng dụng thị Y-STR để so sánh khoảng cách di truyền quần thể 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 KẾT LUẬN 107 KIẾN NGHỊ .108 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO .110 PHẦN PHỤ LỤC .118 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic AMOVA Analysis of molecular variance (phân tích phương sai phân tử) AS-STR Autsomal STR (STR nhiễm sắc thể thường) Bp Base pair (Cặp base) CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) CRI Combined Paternity Index (chỉ số có quan hệ huyết thống kết hợp) DC Discriminating capacity (chỉ số khả phân biệt) DI Degration index (Chỉ số phân huỷ) ADN Deoxyribonucleic acid HD Haplotype diversity (Độ đa dạng Haplotype) HUGO Human Genome Organisation (Tổ chức gen người) GD Gene diversity (độ đa dạng gen) ISFN International Society for Forensic Genetic (Hiệp hội Di truyền Pháp y LR Likehood ratio (tỷ số tương đồng) MDS plot Multidimensional scaling plot (Đồ thị phân bố không gian đa chiều) MHL Minimal haplotype loci (Bộ haplotype tối thiểu) Mulitplex Mulitplex Polymerase chain reaction (Phản ứng PCR đa mồi) NIST National Institute of Standards and Technology (Viện tiêu chuẩn NGS Next generation sequencing (giải trình tự gen hệ mới) NST Nhiễm sắc thể OL Off ladder (Lệch thang) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di gel polyacrylamide) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PD Power of discrimination (Khả phân biệt) PP Y23 PowerPlex® Y23 System RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (đa hình chiều dài đoạn RM Y-STR Rapidly mutating Y – STR (Y-STR có tốc độ đột biến nhanh) RFU Relative fluorescence units (đơn vị đo tín hiệu huỳnh quang tương đối) SNP Single nucleotide polymorphism (đơn hình nucleotit) SSR Simple sequence repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) STR Short tandem repeat (Trình tự lặp lại ngắn) SWGDAM Scientific Working Group on ADN Analysis Methods (Hiệp hội VNTRs Variable Number of Tandem Repeats (tiểu vệ tinh) X-STR STR nhiễm sắc thể giới tính X YHRD Y-STR Haplotype Reference Database (Cơ sở liệu tham khảo Y-STR Y Chromosome - Short tandem repeat (STR nhiễm sắc thể giới YPlus YfilerTM Plus PCR Amplification Kit (bộ kit khuếch đại YfilerTM Plus Yfiler AmpFLSTR™ Yfiler™ PCR Amplification Kit DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Cấu trúc lặp điển hình STR Hình Mơ hình di truyền marker theo kiểu tái tổ hợp (trên NST thường), theo dòng cha (trên NST Y) theo dòng mẹ (trên ty thể) 12 Hình Mơ hình biểu thị phân hố nhóm Y haplotype khác bắt nguồn từ tổ tiên chung [17] 13 Hình Cấu trúc MDS plot phân loại mô tả mối quan hệ quần thểdựa liệu Y – halotype [18] 14 Hình So sánh việc lập hồ sơ ADN dựa STR NST thường NST Y 16 Hình Ví dụ hồ sơ Y-STR từ cá thể với locus gồm alen (ngoại trừ locus DYS385 gồm tổ hợp locus DYS385a b) 18 Hình Minh họa trình khuếch đại lúc locus sử dụng cặp mồi khác phản ứng multiplex PCR 21 Hình Các bước hoạt động hệ thống điện di mao quản [35] 23 Hình Kết phân tích Y-STR từ mẫu nam giới với locus DYS389I, DYS439, DYS437, DYS389II bị đột biến lặp đoạn với alen locus Y-STR đơn vị lặp [35] 25 Hình 10 Minh họa vị trí khuếch đại locus STR cặp mồi PCR kích thước lớn cặp mồi mini STR [35] 30 Hình 1.11 Sự gia tăng số lượng hồ sơ Y-STR YHRD.org từ năm 1999 đến 2018 (số năm biểu thị từ đến 59 [56] 33 Hình 2.1 Vị trí 29 locus Y-STR đồ NST Y 44 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu .48 Hình Ảnh điện di ADN tổng số tách chiết Chelex® 100 gel agarose 0.8% 49 Hình Dạng đỉnh lặp xuất locus DYS481 phân tích với PPY23 (mẫu phân tích ký hiệu ID101) Dạng đỉnh gai xuất locus DYS533 phân tích với Yfiler Plus (mẫu phân tích ký hiệu ID56) .52