Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TSKH Ngô Kế Sương TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành chương trình Nghiên cứu sinh Luận án Tiến sĩ, nhận quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ nhiều thầy cô, anh chị, bạn bè khoá, đồng nghiệp đơn vị Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính ln động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tơi hồn thiện Luận án Trân trọng cám ơn TS Đinh Minh Hiệp hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ suốt trình thực Luận án Xin trân trọng cám ơn thầy cô giáo Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức, góp ý cho tơi suốt trình học tập thực đề tài Trân trọng cám ơn bạn nhóm nghiên cứu (TS Trần Minh Trang, ThS Nguyễn Tài Hoàng) dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tơi hồn thành Luận án Trân trọng cám ơn Trung ương Đoàn TNCS Hồ Chí Minh, quan tơi cơng tác suốt thời gian thực Luận án, chia sẻ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình học tập nghiên cứu Và cuối cùng, tơi xin dành tình cảm, biết ơn gia đình, người ln mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tơi hồn thành Luận án Trân trọng cám ơn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày Luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người thực Lê Quốc Phong MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Nấm Cordyceps sinensis 1.1.1 Đặc điểm, phân bố 1.1.2 Hoạt tính sinh học .4 1.2 Selen vai trò sinh học selen 1.2.1 Nguồn selen 1.2.2 Vai trò selen thể 1.2.3 Con đường chuyển hóa selen nấm .11 1.3 Nuôi trồng nấm Cordyceps 13 1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps 13 1.3.2 Các nghiên cứu nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen .15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Địa điểm thời gian thực .18 2.3.1 Địa điểm thực hiện: 18 2.3.2 Thời gian thực 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu .18 2.4.1 Chuẩn bị giống 18 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng Se đến C sinensis môi trường PGA môi trường lỏng PS 18 2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng Se đến C sinensis môi trường PGA .18 2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng Se đến C sinensis môi trường lỏng PS 19 2.4.3 Phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến 19 2.4.4 Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy Cordyceps sinensis môi trường lỏng bổ sung selen .20 2.4.3.1 Sàng lọc thành phần môi trường Plackett – Burman 20 2.4.3.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường bổ sung selen mơ hình đáp ứng bề mặt Box -Behnken 21 2.4.3.3 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy mơ hình đáp ứng bề mặt Doptimal 23 2.4.5 Phương pháp thu nhận cao chiết .24 2.4.5.1 Cao chiết tổng 24 2.4.5.2 Cao chiết phân đoạn 25 2.4.5.3 Cao chiết CPS 25 2.4.5.4 Thu nhận EPS 25 2.4.5.5 Thu nhận IPS 26 2.4.6 Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết .26 2.4.6.1 Khả bắt gốc tự ABTS 26 2.4.6.2 Khả bắt gốc tự DPPH 26 2.4.6.3 Xác định lực khử .27 2.4.6.4 Xác định khả bảo vệ DNA 27 2.4.6.5 Hoạt tính ức chế xanthine oxidase 27 2.4.6.6 Đánh giá hoạt tính kháng viêm 28 2.4.6.7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase 28 2.4.6.8 Khảo sát khả gây độc tế bào 28 2.7 Định lượng selen nấm Cordyceps sinensis 29 2.7.1 Phân tích selen tổng 29 2.7.2 Phân tích selen nguyên dạng 29 2.7.3 Phân tích FT-IR 30 2.8 Thử nghiệm độc tính cấp sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 30 2.9 Phương pháp xử lý số liệu .30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31 3.1 Về ảnh hưởng selen đến phát triển nấm Cordyceps sinensis 31 3.1.1 Ảnh hưởng selen đến phát triển tơ nấm Cordyceps sinensis 31 3.1.2 Ảnh hưởng selen đến sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis .33 3.1.3 Về nâng cao khả phát triển sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis môi trường bổ sung selenate phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến 36 3.2 Tối ưu hóa môi trường điều kiện nuôi cấy để nâng cao chuyển hóa selen sinh khối nấm Cordyceps sinensis .41 3.2.1 Sàng lọc thành phần môi trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối tích lũy selen nấm Cordyceps sinensis 41 3.2.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường 48 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 52 3.2.4 Thảo luận 57 3.3 Xác định thành phần hoạt chất dạng selen chuyển hóa nấm Cordyceps sinensis 60 3.3.1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm dịch nuôi cấy .60 3.3.2 Hàm lượng selen cao chiết 61 3.3.3 Sự diện selen cao chiết chứa polysaccharide 62 3.4 Về hoạt tính sinh học nấm Cordyceps sinensis giàu selen .64 3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 64 3.4.1.1 Hoạt tính bắt gốc tự ABTS 64 3.4.1.2 Hoạt tính bắt gốc tự DPPH 66 3.4.1.3 Hoạt tính kháng oxy hóa thơng qua lực khử 67 3.4.1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa dựa khả bảo vệ tính nguyên vẹn DNA 68 3.4.2 Khả ức chế xanthine oxidase 69 3.4.3 Hoạt tính kháng viêm in vitro 70 3.4.4 Hoạt tính ức chế α–glucosidase 72 3.4.5 Hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư 73 3.4.6 Thảo luận chung hoạt tính sinh học 76 3.5 Đề xuất quy trình ni cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen 81 3.5.1 Thành phần hoạt chất sinh học nấm 81 3.5.2 Đánh giá độc tính cấp sinh khối C sinensis giàu Se chuột 83 3.5.3 Đánh giá tiêu an toàn thực phẩm 84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 90 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC 104 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh tắt ABTS Tiếng Việt 2,2 - azinobis - (3- 2,2 - azinobis - (3- ethylbenzothiazoline - - ethylbenzothiazoline - - sulphonate) sulphonate) apoER2 apolipoprotein E receptor apolipoprotein E receptor BuOH Butanol Butanol BSA Bovine serum albumin Albumin huyết bê CPT Camptothecin Camptothecin DCF 2’,7’-dichlorofluorescein 2’,7’-dichlorofluorescein DCFH Dichlorodihyddrofluorescein Dichlorodihyddrofluorescein DCFH-DA Dichloro-Dihydro- Dichloro-Dihydro- Fluorescein Fluorescein Diacetate Diacetate DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2 - diphenyl - - 2,2 - diphenyl - - picrylhydrazyl picrylhydrazyl ĐC Đối chứng EPS Exopolysaccharide Polysaccharide ngoại bào EtOAc Ethylacetate Ethylacetate EtOH Ethanol Ethanol FT-IR Fourier-transform infrared Quang phổ hồng ngoại spectroscopy ii Chữ viết Tiếng Anh tắt Hep G2 Liver hepatocellular Tiếng Việt Tế bào ung thư gan Hep G2 carcinoma IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ICP-MS Inductively coupled plasma Khối phổ plasma ghép cảm ứng Mass spectrometry Jurkat Jurkat Cell Line Dòng tế bào Jurkat IPS Intrapolysacharide Polysaccharide nội bào MeOH Methanol Metanol Môi trường MT MCF-7 Breast cancer cell line Tế bào ung thư vú NK cells Natural Killer cells Tế bào sát thủ tự nhiên Nghiệm thức NT nrSSU The partial small subunit of dnrLSU rDNA (nrSSU) and the partial Tiểu đơn vị nhỏ tiểu đơn vị lớn large subunit of rDNA (nrLSU) OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline Đệm PBS PE Petroleum ether Ete dầu hỏa PGA Potato glucose agar Môi trường PGA PG Potato glucose Mơi trường PG PS Mơi trường PS PTN Phịng thí nghiệm ROS Reactive oxygen species Gốc oxy hóa iii Chữ viết Tiếng Anh tắt Tiếng Việt Recommended Nutrition Lượng dùng khuyến cáo hàng Intakes ngày cho người SOD Superoxide dismutase Superoxide dismutase SRB Sulforhodamin B assay Thử nghiệm độc tính SRB Se-EPS Seleno-exopolysaccharide Seleno-exopolysaccharide Se-IPS Seleno-intracellular Seleno-intracellular polysaccharide polysaccharide Se-Pr Seleno-protein Seleno-protein SeNPs Selenium nanoparticles Hạt nano selen RNI Kênh vận chuyển Sul1p/Sul2p Sul1p/Sul2p MMP-2 Matrix Metalloproteinase-2 Matrix Metalloproteinase-2 MMP-9 Matrix Metalloproteinase -9 Matrix Metalloproteinase -9 uPA Urokinase-type plasminogen Urokinase-type plasminogen activator activator Mitogen-activated protein Mitogen-activated protein kinas MAPK kinas PDGF/ERK Platelet-derived growth TGF-β1 Platelet-derived growth factor/Extracellular signal- factor/Extracellular signal- regulated kinase regulated kinase Transforming growth factor Transforming growth factor beta beta ROS Reactive oxygen species Các chất oxy hóa mạnh PKA protein kinase A protein kinase A PKC protein kinase C protein kinase C 116 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) 250 4000 2000 1000 Cao H2O 500 250 4000 2000 1000 Cao CPS 500 250 4000 2000 1000 IPS 500 250 4000 2000 EPS 1000 500 Giá trị ∆OD 0,640 ± 0,006 0,177 ± 0,012 0,373 ± 0,003 0,509 ± 0,007 0,566 ± 0,003 0,586 ± 0,007 0,235 ± 0,003 0,456 ± 0,004 0,563 ± 0,004 0,612 ± 0,004 0,638 ± 0,003 0,270 ± 0,004 0,451 ± 0,013 0,567 ± 0,000 0,625 ± 0,009 0,646 ± 0,006 0,288 ± 0,023 0,447 ± 0,017 0,554 ± 0,007 0,589 ± 0,022 Cao chiết Nồng độ (µg/mL) 250 4000 2000 1000 Cao H2O 500 250 4000 2000 1000 Cao CPS 500 250 4000 2000 1000 IPS 500 250 4000 2000 EPS 1000 500 Giá trị ∆OD 0,645 ± 0,005 0,192 ± 0,008 0,418 ± 0,003 0,513 ± 0,004 0,570 ± 0,003 0,590 ± 0,01 0,254 ± 0,004 0,448 ± 0,011 0,561 ± 0,003 0,616 ± 0,002 0,641 ± 0,004 0,259 ± 0,008 0,454 ± 0,007 0,569 ± 0,002 0,620 ± 0,005 0,641 ± 0,003 0,276 ± 0,011 0,434 ± 0,015 0,537 ± 0,010 0,596 ± 0,003 117 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD 250 0,623 ± 0,009 Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD 250 0,627 ± 0,003 Phụ lục 14: Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự DPPH O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 2500 0,213 ± 0,008 2500 0,239 ± 0,002 1250 0,439 ± 0,009 1250 0,413 ± 0,013 625 0,516 ± 0,012 625 0,509 ± 0,004 312,5 0,567 ± 0,006 312,5 0,569 ± 0,008 0,609 ± 0,008 0,609 ± 0,008 5000 0,122 ± 0,002 5000 0,104 ± 0,004 2500 0,339 ± 0,006 2500 0,321 ± 0,005 1250 0,481 ± 0,008 1250 0,488 ± 0,003 625 0,561 ± 0,006 625 0,566 ± 0,004 0,633 ± 0,002 0,634 ± 0,003 2500 0,121 ± 0,003 2500 0,009 ± 0,001 1250 0,349 ± 0,005 1250 0,231 ± 0,008 625 0,441 ± 0,015 Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc 625 0,457 ± 0,005 312,5 0,524 ± 0,011 312,5 0,523 ± 0,000 0,570 ± 0,011 0,591 ± 0,005 5000 0,129 ± 0,005 5000 0,207 ± 0,008 2500 0,370 ± 0,008 2500 0,370 ± 0,008 1250 0,508 ± 0,003 Cao BuOH 1250 0,502 ± 0,009 625 0,557 ± 0,004 625 0,563 ± 0,006 0,611 ± 0,006 0,611 ± 0,006 5000 0,254 ± 0,006 5000 0,302 ± 0,014 2500 0,439 ± 0,009 2500 0,474 ± 0,014 118 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Cao H2O 1250 0,532 ± 0,003 Cao H2O 625 Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 1250 0,550 ± 0,011 0,580 ± 0,010 625 0,592 ± 0,005 0,629 ± 0,002 0,629 ± 0,002 Phụ lục 15: Khảo sát hoạt tính kháng viêm O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 0 0,00 46,875 12,66 ± 2,06 93,75 13,20 ± 5,53 93,75 22,40 ± 0,76 187,5 23,40 ± 0,81 187,5 54,68 ± 15,37 375 26,86 ± 1,05 375 95,75 ± 1,42 750 40,92 ± 1,21 0,00 0 0,00 15,63 15,64 ± 0,81 93,75 20,65 ± 7,60 187,5 51,26 ± 4,89 Cao EtOH Cao PE 31,25 24,49 ± 1,91 62,50 48,99 ± 2,47 375 92,97 ± 3,32 125,00 95,59 ± 2,49 750 97,90 ± 1,52 0 0,00 93,75 7,73 ± 1,72 93,75 7,78 ± 5,52 375 26,04 ± 1,98 Cao EtOAc 187,5 22,51 ± 1,45 375 38,26 ± 8,54 750 50,12 ± 2,10 750 80,50 ± 0,87 1500 88,06 ± 1,58 0 0,00 62,5 -8,62 ± 1,24 93,75 4,97 125 0,00 ± 0,53 187,5 7,63 250 1,64 ± 1,27 375 11,45 500 5,23 ± 2,98 750 39,22 0 0,00 93,75 3,82 ± 1,99 93,75 8,37 Cao BuOH 119 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS Giá trị ∆OD Cao chiết 187,5 1,95 ± 2,04 Cao H2O 375 Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 187,5 10,56 4,16 ± 1,23 375 14,44 750 -2,63 ± 1,81 750 38,56 0,00 5000 0,040 ± 0,010 93,75 8,02 ± 3,83 2500 0,388 ± 0,019 375 18,12 ± 1,17 1250 0,504 ± 0,000 1500 58,58 ± 1,79 625 0,563 ± 0,007 0 0,00 93,75 3,32 ± 0,2 93,75 7,26 187,5 10,09 ±0,08 187,5 12,95 375 13,54 ± 1,59 375 14,65 750 29,0 ± 1,8 750 43,70 1500 59,24 ± 7,23 0,00 0 0,00 93,75 2,50 ±1,16 93,75 11,47 375 5,24 ± 0,00 750 43,13 750 9,90 ± 1,20 1500 76,88 1500 20,74 ± 2,57 Cao CPS Phụ lục 16: Khả ức chế α-glucosidase cao chiết C sinensis O, sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD O, sinensis đối chứng Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 0,53 0,968 50 0,58 50 0,958 500 0,55 500 1,003 5000 0,51 5000 1,001 Cao EtOH 120 O, sinensis đối chứng O, sinensis giàu selen Cao chiết Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 0,59 0,968 50 0,61 50 0,840 500 0,59 500 0,744 5000 0,54 5000 0,737 0,59 0,888 50 0,58 50 0,889 500 0,56 500 0,873 5000 0,45 5000 0,774 0,542 0,764 50 0,544 50 0,767 500 0,539 500 0,751 5000 0,525 5000 0,743 0,542 0,762 50 0,541 50 0,784 500 0,530 500 0,797 5000 0,513 5000 0,781 0,595 0,636 50 0,591 50 0,631 500 0,566 500 0,605 5000 0,555 5000 0,593 0,824 0,936 50 0,780 50 0,906 500 0,725 500 0,940 5000 0,789 5000 0,926 0,549 0,945 50 0,534 50 0,952 500 0,543 500 0,903 5000 0,531 5000 0,974 Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS 121 Phụ lục 17: Môi trường nuôi khuẩn, môi trường thực kháng khuẩn Môi trường thực kháng khuẩn: Môi trường Muller Hinton Agar (MHA): Cao thịt 2g/L; Casein 17,5g/L;Tinh bột 1,5g/L; Agar 17g/L Phụ lục 18: Kết khảo sát khả ức chế XO cao chiết từ sinh khối nấm C sinensis nồng độ 4000µg/mL Khả ức chế XO (%) Mẫu C sinensis giàu Se C sinensis ĐC EtOH 28,94 ± 1,02 47,80 ± 1,09 PE 57,51 ± 1,93 25,27 ± 3,75 EtOAc 59,83 ± 0,21 64,18 ± 4,82 BuOH 54,70 ± 4,33 27,96 ± 6,51 Nước 26,80 ± 2,40 30,75 ± 4,29 CPS 33,79 ± 2,67 38,07 ± 4,01 IPS 33,07 ± 2,28 20,78 ± 0,82 EPS 39,12 ± 6,42 21,92 ± 3,53 Phụ lục 19: Kết thử độc tính cấp chuột C sinensis giàu Se CS-Se liều 2500mg/kg STT Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Giới Tính 21,2 21,5 22,7 24,3 25,3 26,2 27 Cái 22,1 23,7 24,7 26,4 27,8 28,7 29,5 Cái 21,5 22,1 23 23,6 24,2 24,8 25,6 Cái 19,3 19,9 19,2 20,7 21,7 22,5 23,2 Cái 20,7 21,3 21,7 23 23,1 24,2 25,1 Cái 19,1 19 18,6 19,6 20,3 21,5 22,3 Cái 23 24,4 23,9 26 27,2 28,6 29,2 Cái 122 CS-Se liều 2500mg/kg STT Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Giới Tính 19,3 19,3 20,8 22,3 24,2 24,2 26,5 Đực 19,4 20 20,7 21,5 23 24,3 25,9 Đực 10 20,6 20 21,3 22,7 23,3 24 26 Đực 11 21,5 20,6 21,4 24 25,8 26 26,2 Đực 12 22 22,5 23,2 25,1 26,2 27,8 28,7 Đực 13 22 22,8 22,8 24,6 25,6 26,8 28,1 Đực 14 21,6 21,3 21,2 23 24 25,9 27,6 Đực Phụ lục 20: Phần trăm gây độc tế bào (%) fibroblast Mẫu C sinensis giàu Se Phần trăm gây độc tế bào (%) fibroblast Lần Lần Lần TB ± ĐLC EtOH -10,38 -6,21 -10,38 -8,99 ± 2,41 PE -0,55 1,86 -4,92 -1,20 ± 3,44 EtOAc 9,84 9,94 5,46 8,41 ± 2,55 EtOH -2,66 6,48 6,60 3,48 ± 5,31 PE -1,60 6,02 6,13 3,52 ± 4,43 EtOAc 11,19 8,16 3,53 7,63 ± 3,86 BuOH 1,60 6,94 6,60 5,05 ± 2,99 C sinensis ĐC 123 Phụ lục 21: Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 nồng độ khác Mẫu Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 (%) (µg/mL) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 100 56,71 57,23 57,97 57,30 ± 0,64 50 57,65 59,51 53,72 56,96 ± 2,96 25 56,89 54,73 56,47 56,03 ± 1,15 10 25,00 21,45 26,62 24,36 ± 2,65 -1,39 2,68 -3,44 -0,72 ± 3,12 100 56,95 55,02 55,41 55,79 ± 1,02 10 45,98 48,41 48,38 47,59 ± 1,40 36,79 33,14 35,67 35,20 ± 1,87 -4,80 -0,93 -4,13 -3,29 ± 2,07 0,5 -5,18 -2,22 -7,30 -4,90 ± 2,55 100 62,07 61,64 61,08 61,60 ± 0,50 10 59,80 61,03 60,33 60,39 ± 0,62 59,54 61,38 60,88 60,60 ± 0,95 22,88 24,39 26,45 24,57 ± 1,79 0,5 -2,28 0,82 -2,89 -1,45 ± 1,99 50 55,65 60,04 52,76 56,15 ± 3,66 25 43,99 51,12 48,01 47,70 ± 3,58 C sinensis 10 11,39 17,14 26,87 18,46 ± 7,82 ĐC 11,75 10,85 11,83 11,48 ± 0,55 7,25 10,55 6,69 8,16 ± 2,08 50 55,64 57,41 56,09 56,38 ± 0,92 EtOH PE C sinensis giàu Se EtOAc EtOH PE 124 Mẫu Mẫu EtOAc BuOH Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 (%) (µg/mL) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 25 46,76 50,69 43,09 46,85 ± 3,80 10 39,14 44,91 34,43 39,49 ± 5,25 14,51 14,93 5,15 11,53 ± 5,53 5,85 0,23 3,40 3,16 ± 2,81 100 63,09 70,31 70,41 67,94 ± 4,20 50 61,18 64,60 69,43 65,07 ± 4,14 25 54,93 60,70 59,08 58,24 ± 2,97 10 25,16 31,22 25,52 27,30 ± 3,40 1,81 -3,77 -1,95 -1,30 ± 2,85 100 52,84 52,79 50,94 52,19 ± 1,08 50 29,85 31,60 20,73 27,39 ± 5,84 25 6,26 -0,69 -5,39 0,06 ± 5,86 10 -0,73 9,26 0,82 3,12 ± 5,38 4,18 11,57 -2,11 4,55 ± 6,85 125 Phụ lục 22: Phần trăm gây độc tế bào Jurkat nồng độ khác Phần trăm gây độc tế bào (%) Jurkat STT Ký hiệu Lần Lần Lần TB ± ĐLC ĐC -1,98 -1,00 7,00 1,34 ± 4,93 EPS 18,40 19,90 6,89 15,06 ± 7,12 IPS -1,35 -1,65 -5,88 -2,96 ± 2,53 EtOH 37,47 38,23 32,32 36,01 ± 3,21 PE 40,08 42,86 30,67 37,87 ± 6,39 EtOAc 35,19 41,54 34,62 37,11 ± 3,84 BuOH 3,54 5,95 14,05 7,85 ± 5,50 Nước -3,29 -4,71 -10,65 -6,22 ± 3,91 CPS -1,43 2,56 -2,94 -0,60 ± 2,84 EPS 23,39 25,90 27,77 25,69 ± 2,20 IPS -4,13 8,97 -7,60 -0,92 ± 8,74 EtOH 23,70 32,54 27,64 27,96 ± 4,42 PE 21,16 39,71 32,87 31,25 ± 9,38 EtOAc 36,93 40,14 31,69 36,25 ± 4,27 BuOH -10,79 5,55 3,65 -0,53 ± 8,94 Nước 0,41 -3,28 -2,18 -1,68 ± 1,89 CPS -21,80 -7,09 -7,31 -12,06 ± 8,43 C sinensis giàu Se C sinensis ĐC 126 Phụ lục 23: Mật độ tế bào ung thư sau xử lý với mẫu cao từ C sinensis ĐC 48 (200x) A: CPT 0,05mgSe/L; B: Cao EtOH 100mgSe/L; C: Cao PE100mgSe/L; D: Cao EtOAc100mgSe/L; E: Cao BuOH100mgSe/L Phụ lục 24: Sự phát triển nấm Cordyceps sinensis môi trường PGA bổ sung selenourea từ đến 40 mgSe/L thời điểm 15 ngày 127 Phụ lục 25: Sắc kí đồ selen nguyên dạng SeCysa 128 Phụ lục 26: Sắc kí đồ phân tích selen nguyên dạng mẫu sinh khối nấm C sinensis C sinensis theo PP1 Sắc kí đồ SeMet, SeCys2, Se4+, Se6+, SeMetCys C sinensis theo PP1 Sắc kí đồ SeCysa 129 C sinensis theo PP2 Sắc kí đồ SeMet, SeCys2, Se4+, Se6+, SeMetCys C sinensis theo PP2 Sắc kí đồ SeCysa 130 Phụ lục 27: Kết phân tích thành phần dinh dưỡng, hoạt chất tiêu ATTP