BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN BÀI TẬP LỚN CUỐI KÌ HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BVTV SINH HỌC GVHD ThS Huỳnh Đặng Hà Uyên Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Phú MSSV 201A220001 T[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN BÀI TẬP LỚN CUỐI KÌ HỌC PHẦN : CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BVTV SINH HỌC GVHD: ThS Huỳnh Đặng Hà Uyên Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trần Phú MSSV: 201A220001 Tp Hồ Chí Minh,ngày 23 tháng năm 2023 Nhận xét đánh giá giảng viên DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VKCS: Vi khuẩn cộng sinh IJs: Infective juveniles - ấu trùng xâm nhiễm BSL: Galleria Mellonella – bướm sáp lớn VKCS: Vi khuẩn cộng sinh Trình bày cơng nghệ sản xuất sinh khối tuyến trùng Cơ chế tác động chế phẩm tuyến trùng trừ sâu (Câu 6) Trả lời: Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes, viết tắt EPN) nhiều nước giới nghiên cứu phát triển công nghệ để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại trồng Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng EPN thuộc hai giống Steinernema Heterohabtidis chúng cộng sinh với vi khuẩn Xenorhadus: Ở heterorhabtidis chúng cộng sinh với Potorhabdus chuyên ký sinh côn trùng hại sống đất, côn trùng phải qua phần vòng đời hay vùng sinh thái đất Hiện giới phát triển hệ thống công nghệ nhân nuôi sản xuất tuyến trùng nhân nuôi in vivo nhân nuôi in vitro hai công nghệ khác chủ yếu nguồn vật liệu nhân nuôi: vật liệu tự nhiên vất liệu nhân tạo Sản xuất chế phẩm sinh học EPN dù theo công nghệ in vivo in vitro bao gồm công đoạn chủ yếu sau: - Sản xuất vật liệu ban đầu nguồn IJS - Gây nhiễm trùng nhân nuôi - Nhân ủ để tuyến trùng sinh sôi phát triển - Thu hoạch tuyến trùng - xử lý làm tuyến trùng Ngoài tuỳ mục đích kinh doanh sử dụng hay cần bảo quản vận chuyển xa mà có công đoạn sau: - Phối chế tuyến trùng - Đóng gói bảo quản tuyến trùng *Cơng nghệ nhân ni in vivo Công nghệ nhân nuôi in vivo đơn giản , khơng cần đầu tư lớn, có áp dụng quy mơ hộ gia đình, trang trại đơn vị sản xuất nhỏ Tuy nhiên công nghệ có nhược điểm suất thấp, chất lượng không ổn định đặc biệt tôn nhiều công lao động nên giá thành cao Bước 1: Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL Tuyến trùng xâm nhiễm IJs thường bảo quản lạnh từ 12 – 14 OC trước xâm nhiễm nên để IJs ấm dần lên đến nhiệt độ phòng (20-24 OC) kiểm tra tuyến trùng kình hiển vi soi Tuyến trùng sống tốt chuyển động Lấy 1ml tuyến trùng pha lượng nước xác định cho có nồng độ tuyến trùng đạt 200 IJS/ml Đếm số lượng IJs hợp đếm kính hiển vi soi để biết xác mật độ IJs sở điều chỉnh nồng độ tuyến trùng đạt 200 IJS/ml thêm hay bớt lượng nước hợp lý để đạt nồng độ Khi có nồng độ mong muốn hút ml dung dịch chứa tuyến trùng cho vào giấy lọc Mỗi hộp cho vào 10 ấu trùng BSL qua xử lý nhiệt để không tạo kén Như nồng độ gây nhiễm khoảng 200 IJs/BSL Nếu nồng độ gây nhiễm cao thì nồng độ tuyến trùng sinh bị cạnh tranh bị nhiễm vi khuẩn bên đậy nắp hộp chứa tuyến trùng vi khuẩn bên Dán nhãn để túi nilon Đặt tối nhiệt độ phòng Sau gây nhiễm hầu hết BSL chết, cẩn thận chuyển BSL chết vào white trap (white 1927) Thông thường BSL bị nhiễm EPN chết mùi thúi có màu sắc đặc trưng BSL bị nhiễm Steinerma có màu vàng nâu mềm gấp kẹp BSL bị nhiễm Herterohabditis có màu đỏ gạch cứng mơt chút Những BSL bị chết nhiễm nặng hay chết nguyên nhân khác thường màu đen có mùi thối Tốt khơng thu tuyến trùng từ số lượng chúng gây nhiễm nặng cho đợt Bước 2: Thu hoạch tuyến trùng IJs Làm bẫy nước (white trap) theo white (1927): Đặt giấy lọc whatman N01- 90mm mặt lõm đĩa đồng hồ đĩa petri thuỷ tinh lớn Đặt vào nồi hấp 20 phút 121 OC Cho vào đĩa petri khoảng 70ml nước cất cho thêm formalin để tạo thành dung dịch 0.1% formalin Chú ý: không để nước nhỏ vào mặt lõm đĩa đồng hồ Đặt giấy lọc lên đĩa đồng hồ gập mép giấp ngược phía đáy đĩa, cho đặt vào đĩa petri chứa nước, mép giấy tiếp xúc với bề mặt nước Mỗi đĩa khoảng 20-30 BSL sát giấy lọc sát mép đĩa đồng hồ Ấu trùng BSL Thông thường sau nhiễm từ 10-12 ngày, IJs bắt đầu phát tán khỏi BSL chuyển vào nước đĩa petri Còn xác BSL lại đĩa đồng hồ tuyến trùng xuất đĩa petri nên tiến hành thu chúng hàng ngày tới số lượng giảm (3-4 ngày) Để thu hoạch, nhấc đĩa có chứa BSL ra, rót nước chứa IJs vào cốc (rữa đĩa petri để thu huyết trùng) thêm 70ml nước cất 0.1% formalin thay đĩa đồng hồ Với hầu hết tuyến trừng EPN ấu trùng thoát khỏi vật chủ BSL IJs chủng, với S.glaseri, ấu trùng thoát từ xác chết trùng chúng dạng ấu trùng tiền xâm nhiềm tuyến trùng di chuyển vào môi trường lỏng chúng khơng phát triển hồn tồn thành dạng IJs Để cho chúng thành IJs cần thay đĩa đồng hồ giấy lọc đĩa petri chuẩn bị đặc biệt Đĩa petri chứa lớp mỏng khoảng 2mm plaster, để lớp plaster khô làm ẩm không nên ướt sũng Kiểm tra mức độ ẩm trước thu hoạch cộng thêm vài giọt nước thầy cần thiết Vật chủ nhiễm đặt giấy plaster ẩm này, di chuyển hai đến ba ngày vào môi trường nước 0.1% formalin đĩa petri thuỷ tinh lớn Chúng thu cách thông thường Bước 3: Chuẩn bị cho bảo quản Kiểm tra IJs cịn hoạt động, mơ vật chủ tuyến trùng IJs phải loại bỏ có vấn đề phát sinh số lớn tuyến trùng không hoạt động cần xem xét xử lý loại bỏ, tiến hành rửa cuối Tách IJs khỏi xác chết vật chủ, môi trường nhân nuôi tạp chất khác cách cho IJs di chuyển qua rây lọc có kích thước lỗ thích hợp (60 - 60µm) để giữ lại mơ vật chủ tuyến trùng giai đoạn không lây nhiễm Các giai đoạn khơng xâm nhiễm bị giết rửa tuyến trùng dung dịch Hyamine 0.4% 15 phút Nếu muốn tất giai đoạn không xâm nhiễm hai giai đoạn Steinerma Herterohabditis bị chết nhiệt độ phòng vài ngày Để rửa tuyến trùng, cho chúng vào cốc, để tuyến trùng lắng đọng, gạn phần nước phía cho phần nước vào dung dịch từ 2-4 lần Nếu dung dịch bị ô nhiễm nặng chúng rửa lần dung dịch formalin Có thể ly tâm tốc độ 300 vịng /phút phút đẩy nhanh q trình Trong thời gian ngắn tuyến trùng cất giữ qua đêm tủ lạnh nên rửa lần trước cho vào tủ lạnh Cuối chuyển tuyến trùng cho vào lọ bảo quản * Công nghệ nhân nuôi in vitro Bước 1: Phân lập VKCS VKCS EPN mẫn cảm với nồng độ Oxy thấp, thay đổi độ thẩm thấu, thiếu nguồn dinh dưỡng nhân nuôi nhỏ chủng thông thường khác (E.coli) Các vi khuẩn sơ cấp bảo quản 17% mơi trường dinh dưỡng glyseron chai martney giữ 18 OC Thể treo làm tan nhanh nước nóng 60 OC Các vi khuẩn bảo quản 12-24OC cấy chuyền thường xuyên Phân lập nuôi sơ cấp - Chuyển 10 ấu trùng vào ẩm 10% vào đĩa petri cho nhiễm vào khoảng 100 IJs BSL Không nên cho nhiều nước đề tránh BSL bị ngập nước mà chết trước nhiễm tuyến trùng - Sau 24-48 ấu trùng BSL Chết chúng chuyển vào cốc thuỷ tinh rửa cồn vòng 5-10 phút - Mổ xác chết kéo kim nhọn sắc khử trùng lấy giọt huyết tương lên NBTA sử dụng que cấy platin dạng vòng Chú ý: tác mỗ lấy mẫu huyết tương không làm vỡ ruột ấu trùng BSL để tránh nhiễm bẩn - Ủ đĩa môi trường nhân nuôi 25OC buồn tối - Chọn lấy khuẩn lạc đơn sơ cấp nhiễm trở lại vào môi trường NBTA agar - Nếu đĩa nhân ni chất lượng khơng bị nhiễm bẩn (có thể phân loại nhân ni thứ cấp này), nhân nuôi cách nhân nuôi Nhân nuôi thứ cấp - Cấy chuyển khuẩn lạc vào dịch YS- broth ủ 1-2 ngày nhiệt độ 25 OC 200 vòng phút tối - Bổ sung thêm 15% glyserol vào dịch nhân nuôi, trộn lắc lấy 2ml vào ống túyp khử trùng - Sau san dịch vào ống túyp, chuyển chúng sang bảo quản -80OC Luu ý: ống túyp cần ghi nhãn tên chủng, ngày chuẩn bị mẩu Để chắn cần thêm mô tả ngắn nguồn giống nhân nuôi hồ sơ đông lạnh -80 OC, nghĩa số thứ tự khay hộp chứa mẩu, số chủng ni, đặc tính chủng ( sơ cấp, thứ cấp)… Bước 2: Chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng Chuẩn bị môi trường chicken offal Các nội quan tim gan , ruột,… gia cầm gia súc sử dụng môi trường nhân nuôi EPN a Loại bỏ túi mật ( muối mật có hại cho phát triển tuyến trùng) Không làm vỡ túi mật lấy b Cho vật liệu lòng vào nối áp suất để hấp 121 độ C 20-25 phút c Xay nghiến cho nhuyễn vật liệu, trước xay nên dùng kéo cắt ruột thành đoạn ngắn khoảng 15cm d Bảo quản lạnh chưa trộn môi trường Tốt trộn xong sau bảo quản để giữ an tồn cho không gian tủ bảo quản e Trộn nước mỡ bị theo tỷ lệ sau: Mơi trường nhân ni lồi Steinernema : Dung dịch offal + phần nước (khơng mỡ bị) Mơi trường nhân ni lồi Heterorhabditis : Dung dịch offal + phần nước + phần mỡ bò Bước 3: Chuẩn bị dụng cụ nhân nuôi Tiến hành cắt xốp thành miếng nhỏ (kích thước 1cm) sau trộn với môi trường chicken offal chuẩn bị sẵn với tỷ lệ mơi trường/xốp (tính theo trọng lượng) 1.25/1 Mỗi bình tam giác cho lượng 250-300ml (khoảng 100g) môi trường trộn với xốp Lau miệng bình bịt kín nút bơng bọc vải thưa hấp 121 độ C 20 phút Bình nhân nuôi làm lạnh thời gian trước sử dụng Trường hợp mơi trường có mùi thối nguyên liệu để lâu trước chế biến sử dụng chất khử mùi Chú ý: Trong suốt trình thao tác cần mang găng tay cao su Đây yêu cầu quan trọng để tránh nhiễm trùng cho môi trường nhân nuôi Dùng túi nilon chịu nhiệt thay cho bình tam giác hộp nhựa để nhân ni EPN tiết kiệm chi phí nhân ni Ngồi ra, chuyển trực tiếp túi nhân nuôi đồng ruộng để phun rải mà không cần qua khâu tách lọc vừa nhiều thời gian vừa bị hao hụt Bước 4: Gây nhiễm vi khuẩn Dịch nhân nuôi vi khuẩn sơ cấp nên ủ trước ngày trước bình ni chuẩn bị Vi khuẩn cấy chuyền vào ống nghiệm (tốt nhân nuôi vi khuẩn ống cho bình nhân ni) có chứa 5ml nutrient broth Tốt để ống tuýp qua đêm máy lắc xốy nước ống trước ủ Khi nhiễm rót ống dịch vi khuẩn vào bình nhân ni Lắc để trộn lẫn dịch vi khuẩn với môi trường chất xốp Ủ 2-3 ngày 25 OC để vi khuẩn phát triển nhanh Bước 5: Gây nhiễm tuyến trùng nhân giống tổ hợp (monoxenic) Sau nhân nuôi vi khuẩn xong tiến hành nhiễm tuyến trùng vào bình chuẩn bị sẵn vi khuẩn Một bình tam giác ban đầu chia thành bình Dùng pipet hút lượng nước chứa tuyến trùng khoảng 3-4ml phun vào bình 3-5 điểm Sau nhiễm tuyến trùng, tốt tránh rung lắc mạnh bình nhân ni tuyến trùng ðể bình nhân ủ phòng tối nhiệt độ 25 - 28 OC, ẩm độ 75-80% thời gian 1014 ngày thấy tuyến trùng sinh sôi bám đầy thành bình thu hoạch 10 Khi bình nhân ni có dấu hiệu khơng tốt bị nghi ngờ, IJs vơ trùng bề mặt phục vụ chất gây nhiễm ban đầu Khi chủng IJs không nên cho nhiều nước với tuyến trùng (tốt < 5ml) Sau 2-3 ngày kiểm tra xem bình nhân ni có thành cơng khơng cách lấy mẫu từ bình ni cấy MacConkey Agar NBTA (Nutri agar, bromthymol blue tetrazolium choloride) sau kiểm tra màu sắc vi khuẩn phù hợp hình thái để biết độ khiết Bước 6: Thu hoạch IJs Để tách lọc lấy IJs từ bọt xốp cho xốp vào ray lọc kích thước lỗ 1-2mm Đặt rây vào chậu cho nước vừa ngập xốp, để yên tĩnh thời gian 2-6 cần để lâu đến 12 giờ, khơng nên để lâu q 24 thời gian lâu q khơng có lợi cho tuyến trùng Khơng rót nước lên xốp rửa phần chất dinh dưỡng (để nuôi tuyến trùng) Thông thường vịng đầu có khoảng 95% IJs di chuyền qua đáy rây lọc xuống chậu nước Làm lắng tuyến trùng rửa tuyến trùng để loại bỏ phần khác IJs khơng hoạt động Có thể dùng rây lọc kích thước lỗ nhỏ 0,5mm để lọc loại bỏ phần không cần thiết Đối với chủng Steinernema sử dụng dung dịch Hyamine để giết dạng IJs trước lọc qua rây Cần phải rửa tuyến trùng nhiều lần tới nước Trong trường hợp cần thiết dùng sục khí để phá vỡ thành phần nhỏ dung dịch sau rửa IJs Bước 7: Xử lý cố Để tránh nhiễm bình hộp nhân nuôi cần ý thao tác trình thao tác Chỉ cần giọt nước nhỏ sản xuất gây nhiễm, thay đổi đột ngột tạo pha thứ cấp VKCS Thậm chí nhiệt độ nhân ủ khơng thích hợp, ẩm độ khơng phù hợp nhiều ngun nhân hay yếu tố khác Sự nhiễm nhận biết dễ dàng xuất màu sắc mùi khơng bình thường chất rị rỉ khác lạ từ sinh khối vi khuẩn nấm gây Trong trường hợp nên kiểm tra cách gây nhiễm NBTA MacConkey agar Ở thời điểm trước tuần, bình tam giác nuôi cấy chứa tỷ lệ cao vi khuẩn thứ cấp bình thường, nhiên điều quan trọng bình phải chủng vi khuẩn sơ cấp lúc ban đầu Mặc dù nhiệt độ nhân ni tối ưu khác lồi tuyến trùng, nhiệt độ 2528OC tốt cho việc sản xuất hầu hết chủng tuyến trùng Độ ẩm điều 11 chỉnh cách thêm vào hay bớt lượng chất lỏng định bước khác quy trình sản xuất Nếu môi trường lỏng nhiều chất lỏng cho vào nhiễm, tuyến trùng bị giữ lại chỗ nhiễm chết Nếu môi trường khô, nhân nuôi độ ẩm trước số lớn tuyến trùng sản xuất Duy trì độ ẩm cao nơi đặt bình tam giác để nhân ủ tốt Việc sản suất bảo quản IJs cần tính tốn thời gian phù hợp để không làm giảm khả xâm nhiễm IJs Sản xuất in vitro nên tiến hành 4-6 tháng trước sử dụng để tránh làm giảm độc tố khả gây bệnh tuyến trùng vật chủ Mặt khác cần quan tâm thích đáng để trì điều kiện thích hợp cho sinh trưởng, phát triển bảo quản để làm giảm nguy vấn đề chất lượng tuyến trùng Nhìn chung, người sản xuất tuyến trùng cần phải lường trước vấn đề xảy Để làm người nhân nuôi cần trang bị kiến thức hệ thống nhân nuôi để chủ động theo dõi phản ứng hợp lý thay đổi mang tính thủ tục Cùng với vài hiểu biết sinh học tuyến trùng, nguyên nhân giải pháp khắc phục Thậm chí sản xuất in vitro khơng phải dễ dàng, vậy, thử thách cố cần thiết cho người tập để làm hoàn thiện hệ thống sản xuất Bước 8: Bảo quản IJs Sau thu hoạch làm sạch, tuyến trùng chứa nước cất với giọt Triton X-100 (Tác nhân làm ẩm ngăn chặn tuyến trùng dính vào bên cốc) 0.1% formalin (chỉ sử dụng ô nhiễm trở thành vấn đề quan trọng) Nếu bảo quản điều kiện khơng sục khí nồng độ IJs khơng nên q 10-20.000 IJs/ml độ sâu nước nên trì mức 1cm Các bình tam giác bình ni cấy tế bào dụng cụ lí tưởng bảo quản tuyến trùng Trong điều kiện thông khí (dùng bơm sủi thiết bị cung cấp khí nào) bảo quản tuyến trùng nồng độ 100.000 IJs/ml Các chủng Steinernema bảo quản tốt nhiệt độ 4-10OC 6-12 tháng mà khơng hoạt tính Các chủng Heterorhabditis thường không để lâu vậy, từ 2-4 tháng 4-10 OC Nếu thấy có tượng tạo búi Heterorhabditis cần bổ sung với nồng độ 1gr/50ml nước (hoặc nhiều ) để làm tan búi mà khơng ảnh hưởng đến tuyến trùng Nhìn chung, chủng tuyến trùng việt nam có khả bảo quản lâu bảo quản nhiệt độ cao Kết thí nghiệm bảo quản IJs nước nhiệt độ 12 OC với mật độ 20.000 IJs/ml, chủng S-TX1 S-TX4 lồi Sterinerna sangi giữ 6-12 tháng động lực diệt sâu cịn Trong đó, với điều kiện bảo quản tương tự, chủng H-MF11 H-TN3 lồi Herterohabditis indica sống giữ động lực thời gian 4-8 tháng 12 Có thể bảo quản IJs xốp Polyerher polyurethane Dùng xốp ấm hấp để chứa IJs Steinerma với số lượng tuyến trùng 10 lần khối lượng xốp đặc cốc vào bình vơ trùng sục khí qua màng lọc vi khuẩn (0.45µm) Vắt xốp cho đến tuyến trùng khỏi xốp Việc tách lọc thường tốn nhiều thời gian không thích hợp cho việc thương mại thích hợp cho mục đích nghiên cứu Bảo quản IJs than hoạt tính đặc biệt bảo quản IJs trạng thái khô để IJs không hoạt động hướng khả thi nhiều người quan tâm nghiên cứu (Yukawa & Pitt 1985) *Cơ chế tác động Cơ bản: Khi tiếp cận vật chủ, tuyến trùng thường sâm nhập qua miệng, hậu môn, lổ thở, tuyến tơ, nơi có lớp kitin mỏng Xâm nhập vào vật chủ tuyến trùng giải phóng vi khuẩn cộng sinh, vi khuẩn nhân lên nhanh chóng chất độc chúng nguyên nhân gây chết trùng vịng 48 giờ.(Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ) Chi tiết: 13 Chu trình xâm nhập phát triển EPN bên thể côn trùng vật chủ Một chu kỳ xâm nhập côn trùng vào vật chủ phát triển tuyến trùng EPN xác chết côn trùng vật chủ pha IJs đến pha phát triển ký sinh bên thể côn trùng vật chủ sau kết thúc pha ký sinh lại trở pha IJs bên ngồi trùng vật chủ Ấu trùng xâm nhập vào hai tập tính để tiếp cận với trùng: Hầu hết IJs của loài tuyến trùng Heterohabditis số lồi giống sternernema có tập tính săn lùng tìm vật chủ nhờ chúng chúng định hướng tìm mục tiêu nhanh phía vất chủ để xâm nhập Nhóm cịn lại hầu hết IJs giống sternernema có tập tính phục kích tức ngồi chổ đất để phục kích , chờ côn trùng vật chủ qua sẻ tiếp nhận xâm nhập Khi tìm vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào thể côn trùng qua lỗ tụ nhiên miệng, hậu môn lổ hở hậu môn, môt số dạng IJs trang bị mấu kitin đục thủng thành thể trùng nơi xung yếu ranh giới đốt thể để xâm nhập Sau vào thể, IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu, giây vi khuẩn cộng sinh (VKCS) giải phóng khỏi tuyến trùng qua miệng qua hậu mơn Tại nhờ mơi trường thích hợp huyết tương vi khuẩn cộng sinh vòng 48h Giai đoạn đầu thể côn trùng IJs phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành thê hệ 14 Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối đực cái, trứng thụ tinh với tinh trùng đực Điều có nghĩa để sinh sản thể côn trùng vật chủ tuyến trùng cần xâm nhập IJs đực IJs cái, để chúng thâm nhập đực trưởng thành cho phép chúng có điều kiện ghép đơi vật chủ Một số nghiên cứu Gfinfinet at (2001) cho biết có chủng Steinernema phân lập Indonesea nhiễm vào trùng vật chủ có khả phát triển thành lưỡng tính tự thụ tinh có kích thước lớn Trong quần thể hệ chúng có đực số lượng đực Ở giai đoạn đầu đẻ trứng vào thể côn trùng trứng nở thành ấu trùng tuổi hai, nhiên già không đẻ trứng mà trứng giữ lại nở ấu trùng tuổi hai bên thể Mỗi chứa tới hàng trăm ấu trùng bên Các ấu trùng thể hệ không phát tán mà lại bên xác chết thể vật chủ để sử dụng chất dinh dưỡng mơ trùng vật chủ để phát triển đạt đến nhanh chóng giai đoạn trưởng thành giai đoạn hai Trong trường hợp xác chết vật chủ vẩn cịn nguồn thức ăn chúng vẩn tiếp tục giao phối phát triển qua hệ ba chí hệ bốn bên thể vật chủ Cuối chúng dừng lại hệ hai xác chết cạn nguồn dinh dưỡng chúng bắt đầu chui bên trở thành IJs tuổi ba từ chúng bắt đầu phát triển với côn trùng vật chủ Theo dõi phát triển tuyến trùng Việt Nam steinernema sanggi cho thấy: Một chu kì phát triển tuyến trùng ấu trùng BSL 8-9 ngày, tương đương đến thời gian phát triển sâu khoang Khơng giống với steinerma, lồi tuyến trùng Herteroabdits IJs xâm nhập vào thể côn trùng phát triển thành lưỡng tính Con có khả sinh sản tinh trùng với trứng thụ tinh để sinh sản Từ hệ trở sau IJs phát triển thành trưởng thành phân tích đực sinh sản hình thức giao phối, giai đoạn đầu lưởng tính phân tính chúng để trứng giai đoạn sau già chúng đẻ trứng thai, lúc ấu trùng nở bên thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi hai, biến trở thành bọc chứa ấu trùng tuổi phá thành thể mẹ chui trở thành ấu trùng nhiễm tuổi chúng giữ ấu võ ấu trùng tuổi hai Một chu kì phát triển tuyến trùng EPN thể trùng vật chủ lồi tuyến trùng giống Steinernema spp, dao động từ 7-10 ngày, loài tuyến trùng giống Heterorhabditis spp, từ 12-15 ngày Như vậy, chu kỳ phát triển tuyến trùng EPN bên thể trùng hồn tồn khác so với chu kỳ hay vịng đời phát triển tuyến trùng Một vòng đời phát triển tuyến trùng chu kỳ khép kín hệ, chu kỳ phát triển EPN bên vật chủ trùng có 15 thể gồm vài hệ Qua chu kỳ xâm nhập phát triển vậy, từ vài IJs lồi tuyến trùng Heterorhabditis spp Và Steinernema spp, sinh sản qua số hệ bên xác chết côn trùng nhân số lượng chúng lên hàng trăm ngàn IJs Đây ưu loài tuyến trùng EPN PTSH sâu hại Khả sinh sản tạo số lượng lớn IJs để nhân nuôi sản xuất tuyến trùng, sư dụng côn trùng làm môi trường nhân nuôi ( in vivo), sử dụng môi trường nhân tạo để nhân nuôi (in vitro) sản xuất tuyến trùng quy mô công nghiệp Trình bày điều kiện để thuốc bảo vệ thực vật phát huy tính độc? Phân tích yếu tố liên quan đặc điểm sinh vật đến độ độc thuốc BVTV (Câu 14) * Những yếu tố liên quan đặc điểm sinh vật đến độ độc thuốc BVTV Các loài sinh vật có phản ứng khác loại thuốc Cùng loại thuốc, liều lượng, phương pháp xử lý, chí điểm xử lý, có lồi sinh vật bị thuốc gây hại, lồi khác lại khơng hay bị hại Ví dụ: Dung dịch boocđơ diệt trừ nhiều loại nấm vi khuẩn gây bệnh cho cây, lại có hiệu lực khơng diệt loài nấm phấn trắng (Erisiphales) Thuốc trừ cỏ Ethoxysulfuron có khả diệt trừ mạnh cỏ cói lác cỏ rộng; lại có hiệu lực trừ cỏ hoà thảo, đặc biệt cỏ lồng vực nước khơng gây hại lúa Thuốc Buprofezin có hiệu lực trừ loại chích hút cao, gây hại cho sâu miệng nhai Mỗi loại thuốc diệt số loài sinh vật, nên người ta chia thuốc BVTV thành nhóm khác để tiện cho việc sử dụng thuốc trừ sâu, trừ bệnh, trừ cỏ Cùng lồi sinh vật, tính mẫn cảm loài sinh vật giai đoạn phát dục khác không giống với loại thuốc Ví dụ: giai đoạn trứng nhộng trùng thường chống thuốc mạnh giai đoạn sâu non trưởng thành; cỏ non thường chống chịu thuốc cỏ già ( khả xâm nhập thuốc vào cỏ già vào cỏ non khả trao đổi chất cỏ già cỏ non) Tính mẫn cảm chất độc cịn biến đổi theo ngày đêm Những trùng hoạt động ban ngày thường mẫn cảm với thuốc vào ban đêm Ngược lại, côn trùng hoạt động ban đêm lại có khả chống chịu với thuốc mạnh ban ngày Giới tính ảnh hưởng đến chống chịu thuốc Thông thường khả chống chịu đực Tính mẫn cảm cá thể sinh vật loài, giai đoạn phát dục với loại thuốc khác Khi bị lượng nhỏ chất độc tác động, có cá thể 16 bị hại nghiêm trọng, có cá thể khác khơng bị hại Đó phản ứng cá thể sinh vật gây nên lồi sinh vật có cấu tạo khác hình thái, đặc trưng sinh lý sinh hố khác Những trùng đói ăn, sinh trưởng điều kiện khó khăn thường có sức chống chịu với thuốc Hiện tượng hay nhiều nguyên nhân sau gây nên: -Các lồi sinh vật có khả tự bảo vệ khác để tránh xâm nhập thuốc vào thể sinh vật Lồi gặm nhấm có vị giác khứu giác phát triển, hệ thần kinh chúng hồn thiện nên chúng có tính đa nghi, tự bảo vệ cách khơng ăn hay ăn bả, nơn mửa hay tự gây nôn mửa để tống bả độc ngồi -Giữa lồi sinh vật có cấu tạo khác cấu tạo giải phẫu, độ dày mỏng biểu bì; đứng lá, có lơng hay nhẵn bóng, độ dày lớp sáp, độ nơng sâu rễ v.v ảnh hưởng nhiều đến khả xâm nhập thuốc vào thể sinh vật -Tình trạng sinh lý hoạt tính sinh lý lúc bị ngộ độc ảnh hưởng đến khả chịu đựng loại thuốc sinh vât Sinh vật có trạng thái sinh lý tốt, có khả trao đổi chất mạnh, khả thải loại chất độc khỏi thể mạnh khả chịu đựng chất độc lồi tăng Ngược lại, hoạt tính sinh lý cao tạo điều kiện cho thuốc xâm nhập vào thể nhiều hơn, nên độ mẫn cảm sinh vật thuốc cao -Thành phần hệ men thể sinh vật có ảnh hưởng định đến tính chống thuốc dịch hại Các lồi sinh vật có hệ men phân huỷ chất độc thành chất khơng độc, độ mẫn cảm lồi chất độc giảm nhiều * Những điều kiện để thuốc bảo vệ thực vật phát huy tính độc Thuốc phải tiếp xúc với sinh vật Là điều kiện tiên để thuốc phát huy tác dụng Muốn thuốc tiếp xúc với dịch hại nhiều nhất, phải nắm đặc tính sinh vật học, sinh thái học dịch hại đặc tính loại thuốc, tìm biện pháp xử lý thích hợp để thuốc tiếp xúc nhiều với dịch hại hạn chế thuốc tác động đến sinh vật khơng đối tượng phịng trừ, giảm nguy gây hại thuốc đến môi sinh, môi trường Mỗi lồi sinh vật có đặc tính sinh học khác nhau: Côn trùng: cần hiểu rõ khả di chuyển trùng ( rệp di chuyển, sâu hại khác lại di chuyển mạnh); nơi chúng sống, nơi gây hại cách gây hại, thời điểm hoạt động để chọn thuốc phương pháp xử lý thích hợp - Nấm bệnh nhện : loại sinh vật hay khơng tự di chuyển Phải phun thuốc vào nơi chúng sống, hạt thuốc phải mịn, trang trải thật bề mặt vật phun, lượng nước phun phải lớn phát huy tác dụng - 17 Chuột: Chuột di chuyển rộng, nên phải tạo điều kiện cho chuột tiếp xúc với bả, cách rải bả lối chuột, chọn bả khơng mùi, hay có mùi hấp dẫn, tránh dùng bả gây tác động mạnh để chuột không sợ phải thay mồi bả liên tục để lừa chuột - Cỏ dại : phải phun, rải trộn thuốc vào đất, tạo điều kiện cho cỏ dại nhận nhiều thuốc Dùng thuốc trừ cỏ nội hấp phun nhiều lần liên tiếp liều gây chết tăng hiệu thuốc Khi phun thuốc trừ cỏ không chọn lọc ruộng có trồng, phải phun định hướng, để tránh để trồng tiếp xúc với thuốc, đỡ bị thuốc gây hại làm tăng tính chọn lọc thuốc trừ cỏ - Thuốc phải xâm nhập vào thể sinh vật sau phải dich chuyển đến trung tâm sống chúng : Con đường xâm nhập thuốc BVTV vào thể sinh vật: Thuốc xâm nhập vào thể dịch hại đường tiếp xúc (còn gọi thuốc Ngoại tác động): thuốc gây độc cho sinh vật thuốc xâm nhập qua biểu bì chúng Thuốc xâm nhập vào thể dịch hại đường vị độc (cịn gọi thuốc có tác động Đường ruột hay Nội tác động): loại thuốc gây độc cho động vật thuốc xâm nhập qua đường tiêu hoá chúng Độ pH dịch ruột thời gian tồn thuốc dày ruột non ảnh hưởng mạnh đến hiệu lực thuốc Thuốc có tác động xơng hơi: thuốc có khả bay hơi/ bụi, đầu độc bầu khơng khí bao quanh dịch hại gây độc cho sinh vật thuốc xâm nhập qua đường hơ hấp -Thuốc có tác động thấm sâu: thuốc có khả xâm nhập qua biểu bì thực vật, thấm vào tế bào phía trong, diệt dịch hại sống phận Các thuốc có tác động theo chiều ngang, mà khơng có khả di chuyển - Thuốc có tác động nội hấp: loại thuốc có khả xâm nhập qua thân, lá, rễ phận khác cây; thuốc dịch chuyển cây, diệt dịch hại nơi xa vùng tiếp xúc với thuốc Những thuốc xâm nhập qua rễ dịch chuyển lên phận phía dịng nhựa nguyên, gọi vận chuyển hướng Do mạch gỗ tế bào, nên chất độc bị tác động Ngược lại, có thuốc xâm nhập qua lá, vận chuyển xuống phận phía cây, theo mạch libe, dòng nhựa luyện, gọi vận chuyển hướng gốc hay thuốc mang tính lưu dẫn Mạch libe tế bào sống, nên thuốc bị chất tế bào sống, men tác động yếu tố sinh học tác động Có thuốc lại xâm nhập qua rễ, vận chuyển hướng hướng gốc Sự xâm nhập di chuyển chất độc vào thể sinh vật - 18 Sự xâm nhập di chuyển chất độc vào nấm bệnh: Bề mặt chất nguyên sinh có tính khuyếch tán mạnh, cản trở chất tế bào khuyếch tán Ngược lại, khối ngun sinh lại có tính hấp phụ tạo hệ số cân Trong điều kiện bình thường hệ số hấp phụ thấp Khi bị chất độc tác động, hệ số cân tăng lên, chất độc theo vào tế bào mạnh Mặt khác, màng ngun sinh chất có tính thấm chọn lọc, cho chất hoà tan qua với tốc độ khác Nhưng tính thấm bị thay đổi theo điều kiện ngoại cảnh Bị chất độc kích thích, tính thấm màng tế bào tăng nhanh, chất độc xâm nhập nhanh chóng vào tế bào trạng thái cân áp suất thiết lập Màng tế bào có khả hấp phụ mạnh, đặc biệt ion kim loại nặng đồng, thuỷ ngân Trên màng tế bào, ion tập trung lại với nồng độ cao xâm nhập trực tiếp vào tế bào nấm bệnh mạnh Sự xâm nhập di chuyển chất độc vào thể trùng: Những thuốc dễ hồ tan lipit lipoproteit chất béo, dễ xâm nhập vào thể sinh vật qua đường tiếp xúc Biểu bì trùng khơng có tế bào sống, cấu tạo lipit lipoproteit biến tính, có tác dụng giữ khung thể, ngăn không cho nước thể trùng ngồi chất khác bên xâm nhập vào thể Nhưng lớp biểu bì bao phủ khơng tồn thể, có chỗ mỏng, mềm khớp đầu, ngực bàn chân, chân lông v.v thuốc xâm nhập qua dễ dàng Các thuốc dạng sữa dễ xâm nhập vào thể qua biểu bì trùng biểu bì Những biểu bì q dày, thuốc khơng qua được, thuốc hồ tan biểu bì nhiều, bị giữ lại biểu bì mà khơng vào bên trong, hiệu lực thuốc bị giảm Xâm nhập qua biểu bì, thuốc tiếp vào máu máu di chuyển đến trung tâm sống Các thuốc xông lại xâm nhập vào lỗ thở, hệ thống khí quản vi khí quản vào máu gây độc cho côn trùng Chất độc xâm nhập qua đường hô hấp có tính độc mạnh đường khác, tác động đến máu Cường độ hô hấp mạnh, khả ngộ độc tăng Vì thế, xơng côn trùng kho, người ta thường rút bớt khơng khí, bơm thêm CO2 vào kho để kích thích hơ hấp trùng Các thuốc trừ sâu vị độc, chuyển từ miệng đến ống thực quản, túi thức ăn vào ruột Dưới tác động men có nước bọt dịch ruột giữa, thuốc chuyển từ dạng khơng hồ tan sang dạng hoà tan, thẩm thấu qua vách ruột hay phá vỡ vách ruột vào huyết dịch, huyết dịch đến trung tâm sống Những chất độc cịn lại khơng tan bị thải qua hậu môn, qua nôn mửa; phần nhỏ chất độc thẩm thấu qua thành ruột trước, vào thành ruột sau bị giữ Q trình tiết chậm, thời gian tồn lưu ruột lâu, lượng chất độc xâm nhập vào thể nhiều, độ độc thuốc mạnh Độ pH dịch ruột ảnh hưởng nhiều đến độ tan thuốc Độ tan lớn, nguy gây độc tăng Sự xâm nhập di chuyển chất độc vào thể lồi gậm nhấm : Thuốc trừ chuột xâm nhập vào thể loài gậm nhấm ba đường : tiếp xúc, vị độc 19 xông Nhưng khả hoạt động lồi gậm nhấm nói chung lồi chuột nói riêng rộng, nên khó diệt chúng đường tiếp xúc Biện pháp diệt chuột loài gậm nhấm chủ yếu trộn thuốc trừ chuột với thức ăn (làm bả) ( đường vị độc) Tác động xông (đường hô hấp), áp dụng khoảng khơng gian kín (trong kho tàng, hang) Dù đường nào, cuối thuốc vào máu Khi vào máu, thuốc phần phá hại máu, phần khác vận chuyển đến trung tâm sống, tác động đến chức sống quan này, chuột bị ngộ độc chết Sự xâm nhập di chuyển chất độc vào thể cỏ dại: Chất độc xâm nhập vào phân thực vật, rễ hai nơi chất độc dễ xâm nhập Bề mặt phận khác mặt đất, bao phủ màng lipoit chất béo khác, có chất chất khơng phân cực, nên thường dễ cho chất không phân cực qua Vỏ thân lớp bần, thuốc BVTV phân cực hay khơng phân cực khó xâm nhập; xâm nhập qua vỏ thân, chất độc vào bó mạch di chuyển đến phận khác Giọt chất độc nằm lá, ban đầu xâm nhập vào bên nhanh, theo thời gian, nước bị bốc hơi, nồng độ giọt thuốc tăng cao, khả hoà tan thuốc kém, thuốc xâm nhập vào chậm dần Chất độc đất xâm nhập qua rễ ( xâm nhập qua hạt giống lóng thân lớp đất mặt) nhờ khả hấp phụ nước chất hoà tan Các chất phân cực dễ xâm nhập qua rễ Tốc độ xâm nhập thuốc qua rễ thường lúc đầu tăng sau giảm dần Riêng hai thuốc trừ cỏ 2,4-D DNOC lại khác: lúc đầu xâm nhập nhanh, sau ngừng hẳn lại có lượng thuốc từ rễ ngồi đất Mặt có nhiều khí khổng tế bào kèm, nên chất phân cực lại dễ xâm nhập Chất độc phải tồn giữ thể sinh vật thời gian, nồng độ định đủ để phát huy tác dụng: Chất độc thể sinh vật biến đổi theo hướng: Độ độc chất độc tăng lên: chúng biến đổi thành chất có tính độc cao Ví dụ : MCPB phát huy tác dụng diệt cỏ cây, chúng chuyển thành MPCA Malathion có độ độc Malaoxon, sản phẩm oxy hố Malathion Các thuốc trừ sâu thuộc nhóm nereistoxin ( Cartap, Bensultap, Monosultap, Thiocyclam ) có hiệu lực diệt sâu chúng chuyển thành Nereistoxin thể côn trùng Thuốc trừ nấm Thiophanate methyl vào nấm bệnh chuyển thành carbendazim có độ độc với nấm bệnh - Chất độc trở nên độc hơn, chí hẳn tính độc: chất độc phản ứng với chất có thể, tác động men phân huỷ thuốc, hay phản ứng thuỷ phân hay trao đổi khác - 20