Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối (termitomyces sp )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ NGỌC NHI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI HỆ SỢI NẤM MỐI (Termitomyces sp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 62420201 Cần Thơ, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ NGỌC NHI MÃ SỐ NCS: P0915005 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI HỆ SỢI NẤM MỐI (Termitomyces sp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS TS TRẦN NHÂN DUNG Cần Thơ, 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu làm luận án, nhận nhiều giúp đỡ quý báu từ phía thầy cơ, bạn bè người thân Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: Quý thầy cô Ban Giám hiêu Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Sau Đại học, Viên Nghiên cứu Phát triển Công nghê Sinh học tạo điều kiên thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Trần Nhân Dũng – người tận tụy với học trị, nhiêt tình hướng dẫn chun mơn, ln đôn đốc, động viên giúp đỡ suốt trình học tập thực hiên luận án Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô PGS.TS Nguyễn Hữu Hiêp, PGS.TS Nguyễn Minh Chơn, PGS.TS Nguyễn Văn Thành, GS.TS Cao Ngọc Điêp, PGS.TS Trương Trọng Ngôn, TS Bùi Thị Minh Diêu, TS Trương Thị Bích Vân, TS Ngơ Thanh Phong, PGS.TS Lê Vinh Thúc, TS Nguyễn Thị Pha, TS Trần Đình Giỏi, PGS.TS Phan Thị Phượng Trang, PGS.TS Ngơ Thị Phương Dung, TS Dương Thị Hương Giang, TS Huỳnh Ngọc Thanh Tâm cung cấp cho kiến thức q báu suốt khóa học q trình hồn thành luận án Xin đơng kính gửi lời chân thành cảm ơn đến quý thầy cô GS.TSKH Thái Trần Bái, GS.TSKH Trịnh Tam Kiêt, PGS.TS Bùi Văn Lê, PGS.TS Phạm Thành Hổ, PGS.TS Đinh Minh Hiêp, PGS.TS Ngô Đại Nghiêp, TS Phạm Văn Ngọt, TS Ngô Đại Hùng, PGS.TS Võ Thanh Sang, TS Phan Huy Dục, TS Đỗ Tấn Khang, TS Trần Trung Hiếu, TS Nguyễn Thị Nhật Hằng, TS Nguyễn Thị Liên Thương tận tình giúp đỡ truyền đạt kinh nghiêm quý báu cho để hồn thành luận án Nhân tơi xin gửi lời biết ơn đến thầy PGS.TS Nguyễn Văn Hiêp (chủ tịch hội đông trường) quý thầy cô trường Đại học Thủ Dầu Một tạo điều kiên để tơi hồn thành chương trình Xin cảm ơn anh Phạm Đình Khơi, anh Trần Văn Bé Năm, em Nguyễn Tường Vy, em Thạch Rưn, em Nguyễn Văn Luân, em Nguyễn Thị Diêu Thiên em sinh viên thu mẫu động viên suốt trình học tập Cảm ơn người thân yêu gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Xin trân trọng cảm ơn tất cả! Nguyễn Thị Ngọc Nhi i TĨM TẮT Luận án “ Nghiên cứu quy trình cơng nghê sản xuất sinh khối sợi nấm mối (Termitomyces sp.)” thực hiên nhằm mục tiêu thiết lập qui trình ni cấy sản xt thử nghiêm sinh khối sợi nấm mối T clypeatus thống nuôi cấy sinh học (bioreactor) 60L Kết dựa khảo sát hình thái thể nấm khuẩn lạc, kết hợp giải trình tự gen đoạn IST1, 5S IST2 đặc trưng nấm cho thấy bảy chủng nấm mối phân lập thuộc chi Terminomyces, có hai chủng định danh đến lồi T clypeatus (N1) T microcarpus (BD) Nghiên cứu sản xuất thử nghiêm loài nấm mối T clypeatus cho thấy mơi trường nhân giống cấp thích hợp cho phát triển lồi nấm mơi trường có chứa KH2PO4 (0,1%), pepton (0,2%), glucose (4%), yeast extract (0,1%), MgSO4 (0,015%), thời gian nuôi tối ưu 20 ngày Trong mơi trường nhân giống cấp có khác biêt gơm gơm ty lê chủng giống 10% v/v với chế độ sục khí 0,4 v/v/m Một qui trình sản xuất thử nghiêm ni sinh khối sợi nấm mối T clypeatus thiết lập thống ni cấy sinh học với bình ni thể tích 60L Kết khảo sát cho thấy điều kiên tối thích cho sinh khối sợi phát triển mạnh tỉ lê giống chủng vào môi trường nuôi cấy 5% (v/v), pH 5,0, lượng khí sục 0,4 v/v/m, tốc độ khuấy 180 vịng/phút, nhiêt độ mơi trường 28oC Lượng sinh khối thu nhận 6,633±0,041 g/L Sinh khối sợi nấm tươi (93,9% ẩm độ) có chứa protein (3,75%), carbohydrate (1,76%), acid amin tổng (2,16%) bao gôm acid amin thiết yếu valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, lysine, arginine, histidine Cao chiết methanol sinh khối khô sợi nấm T clypeatus trung hịa gốc tự DPPH với IC50 trung bình 2,26 mg/mL, nơng độ mg/mL ức chế lên đến 71,65-83,52% gốc tự DPPH Bên cạnh cao chiết có khả kháng vi khuẩn gây bênh Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 6538 với MIC 10,98 mg/mL Độc tính cao chiết xác định tế bào gan người LO-2, kết cho thấy tỉ lê sống tế bào cao (90%) nông độ cao chiết 2.500 μg/mL Kết xác định độc tính cấp độc tính bán trường diễn cao chiết chuột cho thấy, hai trường hợp khơng có chuột tử vong liều 10.000 mg/kg thể trọng thử nghiêm độc tính cấp, liều 1.000 mg/kg thể trọng thử nghiêm độc tính bán trường diễn Từ khóa: Hê thống ni sinh học, hoạt tính sinh học, nấm mối, ni cấy chìm ii ABSTRACT The thesis “Studying on mycelium biomass production procedure from Termitomyces sp.” was carried out with the aim of establishing a culture process for experimental production of T clypeatus mycelium in 60 L Bioreactor The results based on the morphological survey of fungal fruiting bodies and colonies, combined with gene sequencing of ITS1, 5S and ITS2 fragments that are characteristic of fungi, showed that seven strains of termite mushroom, belonged to the genus Terminomyces, in which there are two strains that have been identified as T clypeatus (N1) and T microcarpus (BD) Research on experimental production on the termite mushroom T clypeatus showed that the primary propagation medium suitable for the growth of this fungus was the medium containing KH2PO4 (0.1%), peptone (0.2%), glucose (4%), yeast extract (0.1%), MgSO4 (0.015%), optimal culture time is 20 days Meanwhile, the secondary propagation medium was different, including the seed rate of 10% v/v with the aeration mode of 0.4 v/v/m An experimental production procedure for T clypeatus mycelium was established on a biological culture system with a cultural tank of 60 liters The survey results showed that the optimal conditions for the growth of mycelium biomass were the seed rate 5% (v/v), pH 5, aeration mode of 0.4 v/v/m, stirring speed 180 rmp, the temperature of 28ºC The amount of collected biomass was 6.633±0.041 g/L Fresh mycelium biomass (93.9% moisture) contains proteins (3.75%), carbohydrates (1.76%), total amino acids (2.16%) including essential amino acids such as valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, lysine, arginine, histidine The dry biomass methanol extract of mycelium was able to neutralize DPPH free radicals with an average IC50 value of 2.26 mg/mL, at a concentration of mg/mL inhibiting up to 71.6583.52% DPPH free radicals Besides, this extract was also resistant to pathogenic bacteria such as Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 with MIC of 10.98 mg/mL The toxicity of the extract was also determined on LO-2 hepatocytes, the results indicated extremely high cell survival (90%) at the extract concentration of 2500 g/mL The results of determining acute toxicity and semi-permanent toxicity of the extract in rats showed that, in both cases, there was no death of rats at the dose of 10,000 mg/kg body weight in the acute toxicity test, and at the dose of 1,000 mg/kg body weight in the semi-permanent toxicity test Keywords: Biological activity, bioreactor, submerged culture, termite mushroom iii LỜI CAM ĐOAN Quyển luận án thân nghiên cứu sinh thực hiên hướng dẫn PGS.TS Trần Nhân Dũng, không người khác làm thay, tài liêu tham khảo nghiên cứu sinh xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng trích dẫn đầy đủ Kết nêu luận án hoàn thành dựa kết nghiên cứu thân kết nghiên cứu chưa dùng cho luận án cấp khác Cán hướng dẫn Tác giả luận án Nguyễn Thị Ngọc Nhi PGS.TS Trần Nhân Dũng iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iiv MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH HÌNH x CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm 2.1.1 Khái quát nấm 2.1.2 Chu trình sống nấm 2.1.3 Các giai đoạn phát triển nấm 2.1.4 Đặc điểm biến dưỡng nấm 2.1.5 Điều kiện sinh trưởng nấm 2.2 Nấm mối 2.2.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại 2.2.2 Chu trình sống nấm mối 2.2.3 Đặc điểm hình thái thể nấm mối 10 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm mối 19 2.2.5 Mối quan hệ cộng sinh nấm mối mối 20 2.2.6 Giá trị dinh dưỡng dược tính nấm mối 22 2.3 Tổng quan ni cấy chìm 28 2.3.1 Tổng quan ni cấy chìm loài nấm 28 2.3.2 Tổng quan ni cấy chìm nấm mối 31 2.4 Giới thiệu ni cấy chìm hệ thống Bioreactor 32 2.5 Tình hình nghiên cứu nấm mối giới Việt Nam 35 2.5.1 Tình hình nghiên cứu nấm mối giới 35 2.5.2 Tình hình nghiên cứu nấm mối Việt Nam 35 2.6 Định danh nấm ăn nấm dược liệu dựa sở sinh học phân tử 36 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 v 3.1 Thời gian địa điểm 38 3.2 Vật liệu nghiên cứu 38 3.2.1 Mẫu vật nghiên cứu 38 3.2.2 Hóa chất 38 3.2.3 Thiết bị dụng cụ 39 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập, định danh giữ giống nấm mối 39 3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối cấp 1, dạng dịch thể 42 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối Bioreactor 60 lít 47 3.3.4 Nội dung 4: Phân tích thành phần dinh dưỡng khảo sát hoạt tính sinh học sinh khối hệ sợi nấm mối 52 3.3.5 Nội dung 5: Sản xuất thử nghiệm độc tính sản phẩm 56 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 59 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 4.1 Kết phân lập định danh nấm mối 60 4.1.1 Kết phân lập định danh nấm mối Termitomyces clypeatus 60 4.1.2 Kết phân lập định danh nấm mối Termitomyces microcarpus 63 4.1.3 Kết phân lập định danh nấm mối Termitomyces sp.1 65 4.1.4 Kết phân lập số chủng nấm mối khác 66 4.1.5 Phân tích mối quan hệ di truyền chủng nấm mối phân lập 68 4.2 Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối T clypeatus 69 4.2.1 Ảnh hưởng mơi trường thời gian ni cấy lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 69 4.2.2 Tối ưu hóa hàm lượng chất chủ yếu ảnh hưởng đến tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 71 4.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủ yếu ảnh hưởng tới tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 778 4.2.4 Tác động tỷ lệ cấp giống chế độ sục khí tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối 84 4.3 Sản xuất thử nghiệm sinh khối nấm mối Bioreactor 85 4.3.1 Ảnh hưởng nông độ môi trường dịch thể tới tích lũy sinh khối nấm mối 85 4.3.2 Ảnh hưởng tốc độ khuấy tới tích lũy sinh khối sợi nấm mối 87 4.3.3 Quy trình cơng nghê sản xuất thử nghiêm sinh khối sợi nấm mối Bioreactor 88 4.4 Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối nấm mối 90 4.5 Kết thử hoạt tính sinh học 93 4.5.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa sinh khối nấm mối 93 vi 4.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 94 4.6 Thử độc tính dịch chiết sinh khối nấm mối 99 4.6.1 Thử độc tính tế bào dịch chiết sinh khối nấm mối 99 4.6.2 Thử độc tính cấp dịch chiết sinh khối nấm mối 101 4.6.3 Thử độc tính bán trường diễn dịch chiết sinh khối nấm mối 104 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1099 5.1 Kết luận 109 5.2 Đề xuất 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 126 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Tóm tắt hình thái thể loài nấm mối (Termitomyces) (Tibuhwa et al., 2010) 16 Bảng 2.2: Thành phần dịch chiết tổ mối (Zeleke et al., 2013) 19 Bảng 2.3: Kết phát triển hoạt độ enzyme nấm mối môi trường khác (Zeleke et al., 2013) 20 Bảng 2.4: Thành phần dinh dưỡng nấm mối (% khối lượng khô) 23 Bảng 2.5: Thành phần khoáng chất nấm mối (mg/100g khối lượng khô) (Gbolagade et al., 2006) 23 Bảng 2.6: Hàm lượng saponin polysaccharides từ sinh khối khô nuôi cấy lỏng (DMCB) thể nấm mối T albuminosus (Lu et al., 2008) 26 Bảng 2.7: Thành phần mơi trường ni cấy chìm nấm sản xuất hợp chất sinh học 29 Bảng 2.8: Sinh khối nấm ni cấy chìm loại nấm có sử dụng Glucose (Elisashvili, 2012) 30 Bảng 2.9: Các loại nấm nuôi cấy Bioreactor 33 Bảng 3.1: Thành phần môi trường YESS 41 Bảng 3.2: Thành phần mơi trường PDB có bổ sung muối khoáng 42 Bảng 3.3: Sự tác động môi trường thời gian nuôi cấy lên tích lũy sinh khối sợi nấm mối 43 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiêm khảo sát tác động đông thời nông độ (g/L) glucose, pepton KH2PO4 44 Bảng 3.5: Sự tác động ty lê cấp giống chế độ sục khí tới tích lũy sinh khối sợi nấm mối 47 Bảng 3.6: Nhiêt độ cô quay mẫu nấm chiết ethanol 55 Bảng 3.7: Bố trí thử nghiêm độc tính cấp 58 Bảng 3.8: Bố trí thử nghiêm độc tính bán trường diễn 59 Bảng 4.1: Kết phân tích ANOVA khối lượng khô 70 Bảng 4.2: Các nông độ glucose, nông độ pepton nơng độ khống KH2PO4 có tác động lên tích lũy sinh khối sợi nấm mối lựa chọn 74 Bảng 4.3: Ảnh hưởng nông độ glucose, nơng độ pepton nơng độ khống KH2PO4 lên tích lũy sinh khối sợi nấm mối 75 Bảng 4.4: Kết phân tích quy ANOVA sản lượng sinh khối khô sợi nấm Termitomyces clypeatus 76 Bảng 4.5: Các pH, tốc độ lắc nhiêt độ có tác động lên tích lũy sinh khối sợi nấm mối lựa chọn 81 viii B 9.4 Xử lý thống kê số sinh lý máu Descriptive Statistics: WBC, LYM%, MID%, NEUT%, LYM@, MID@, NEUT@, RBC, Chú Variable thích N Mean StDev WBC ĐC 6.97 2.47 Nt1 5.800 0.529 Nt2 5.300 0.600 Nt3 4.000 0.964 Nt4 5.300 1.510 Nt5 6.93 2.47 ĐC 76.17 7.17 Nt1 76.27 3.55 Nt2 74.70 3.08 Nt3 75.200 0.866 Nt4 77.00 5.24 Nt5 75.10 3.72 ĐC 11.77 2.99 Nt1 12.333 1.115 Nt2 13.47 2.16 Nt3 13.50 1.73 Nt4 10.77 1.79 Nt5 12.40 3.40 ĐC 12.07 4.56 Nt1 11.40 2.69 Nt2 11.83 2.40 Nt3 11.30 2.33 Nt4 12.23 3.50 Nt5 12.50 2.43 ĐC 5.40 2.25 Nt1 4.433 0.473 Nt2 7.30 5.98 Nt3 3.033 0.723 Nt4 3.900 0.917 Nt5 5.17 1.86 ĐC 0.800 0.265 Nt1 0.7000 0.1000 Nt2 0.7333 0.1528 Nt3 0.533 0.208 LYM% MID% NEUT% LYM@ MID@ — 55 — NEUT@ RBC HGB HCT MCV MCH Nt4 0.567 0.252 Nt5 0.933 0.462 ĐC 0.7667 0.0577 Nt1 0.6667 0.1528 Nt2 0.600 0.200 Nt3 0.4333 0.0577 Nt4 0.667 0.351 Nt5 0.833 0.208 ĐC 7.17 3.20 Nt1 10.210 0.466 Nt2 10.237 0.301 Nt3 7.54 3.82 Nt4 6.91 2.26 Nt5 7.69 1.92 ĐC 10.17 4.57 Nt1 14.500 0.500 Nt2 14.200 0.700 Nt3 10.43 4.97 Nt4 10.47 3.30 Nt5 10.97 2.66 ĐC 36.10 17.16 Nt1 52.57 3.35 Nt2 52.17 2.54 Nt3 37.3 18.6 Nt4 35.70 11.66 Nt5 38.03 9.31 ĐC 49.73 2.38 Nt1 51.400 0.800 Nt2 51.000 1.453 Nt3 49.767 0.737 Nt4 51.667 0.643 Nt5 49.567 1.201 ĐC 14.100 0.100 Nt1 14.133 0.153 Nt2 13.833 0.473 Nt3 13.933 0.924 Nt4 15.133 0.208 Nt5 14.233 0.651 — 56 — MCHC RDW-SD RDW-CV PLT MPV PDW PCT ĐC 28.500 1.323 Nt1 25.57 4.15 Nt2 27.167 0.252 Nt3 28.067 1.422 Nt4 29.333 0.416 Nt5 28.800 0.700 ĐC 28.500 1.039 Nt1 31.600 0.000000 Nt2 31.600 0.000000 Nt3 30.37 2.14 Nt4 31.57 1.85 Nt5 30.33 2.80 ĐC 13.833 0.569 Nt1 14.767 0.252 Nt2 14.933 0.451 Nt3 14.733 1.242 Nt4 14.733 0.874 Nt5 14.767 1.026 ĐC 331.7 93.0 Nt1 436.7 28.6 Nt2 428.00 14.18 Nt3 383.0 48.8 Nt4 580 188 Nt5 345.7 56.2 ĐC 6.50 1.85 Nt1 7.2333 0.1528 Nt2 7.100 0.400 Nt3 7.033 0.577 Nt4 7.533 0.289 Nt5 8.267 0.551 ĐC 7.90 3.30 Nt1 8.3333 0.1155 Nt2 8.867 0.569 Nt3 9.200 0.300 Nt4 10.067 0.404 Nt5 11.067 0.814 ĐC 0.2467 0.0709 Nt1 0.3300 0.0624 Nt2 0.3000 0.0300 — 57 — P-LCR Nt3 0.26333 0.01528 Nt4 0.4333 0.1531 Nt5 0.2767 0.0404 ĐC 12.27 1.91 Nt1 10.833 1.450 Nt2 9.33 4.46 Nt3 7.37 4.88 Nt4 11.87 2.22 Nt5 19.70 4.21 B10 Thử độc tính bán trường diễn B10.1 Số liệu thô khối lượng chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn Số chuột cân Khối lượng tổng Khối lượng TB/con Chú thích 81.3 20.33 Chuột đem sau 24 82.8 20.7 Chuột đem sau 24 bố trí chng ni 10 207.2 20.72 Chuột đem sau 24 bố trí chng ni 82.5 20.63 Chuột đem sau 24 bố trí chng ni 10 210.7 21.07 Chuột đem sau 24 bố trí chuông nuôi 4 122.5 30.63 Chuột nuôi sau 30 ngày lô ĐC chuông 148.7 29.74 Chuột nuôi sau 30 ngày lô ĐC chuông 156.6 31.32 Chuột nuôi sau 30 ngày lô ĐC chuông 147.5 29.5 Chuột nuôi sau 30 ngày lô thử nghiêm chuông 151.5 30.3 Chuột nuôi sau 30 ngày lô thử nghiêm chuông 147.8 29.56 Chuột nuôi sau 30 ngày lô thử nghiêm chuông — 58 — B10.2 Xử lý thống kê phần khối lượng Descriptive Statistics: khối lượng TB/con Variable Lô chuột khối lượng TB/con N Chuột đem vê Mean 20.690 SE Mean 0.118 30.563 0.457 0.792 Chuột nuôi thử nghiệm sa 29.787 0.257 0.446 DF SS MS F P Lô chuột 246.265 123.132 510.25 0.000 Error 1.931 0.241 Total 10 248.195 S = 0.4912 R-Sq = 99.22% R-Sq(adj) = 99.03% Level N Mean StDev Chuột đem vê 20.690 0.264 Chuột nuôi ĐC sau 30 ngà 30.563 0.792 Chuột nuôi thử nghiệm sa 29.787 0.446 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level Chuột đem vê + + + + (-*-) Chuột nuôi ĐC sau 30 ngà (-*-) Chuột nuôi thử nghiệm sa (-*-) + + + + 21.0 24.0 27.0 30.0 Pooled StDev = 0.491 Grouping Information Using Tukey Method Lô chuột N Mean Chuột nuôi ĐC sau 30 ngày 30.563 Chuột nuôi thử nghiệm sau 30 ngày 29.787 Chuột đem vê 0.264 Chuột nuôi ĐC sau 30 ngà One-way ANOVA: khối lượng TB/con versus Lô chuột Source StDev 20.690 Grouping A A B Means that not share a letter are significantly different Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Lô chuột Individual confidence level = 97.87% — 59 — B10.3 Số liệu thô số sinh lý máu thử độc tính bán trường diễn WBC LYM % 4.8 63.7 MID % MID @ NEUT @ RDW- NEUT % LYM @ 17.1 19.2 3.1 0.8 0.9 8.62 13.2 45.6 53 15.3 28.9 31.6 14.4 475 72.4 16 11.6 3.6 0.8 0.6 11.52 17.8 63 54.7 15.4 28.2 29.7 13.1 7.3 44.6 18.2 37.2 3.3 1.3 2.7 8.33 12.2 42.6 51.2 14.6 28.6 26 72.1 13.7 14.2 2.9 0.5 0.6 11.41 16.8 61.3 53.8 14.7 27.4 4.1 75.7 11.2 13.1 3.1 0.5 0.5 10.52 15.4 54.3 51.7 14.6 4.5 74.8 14.3 10.9 3.4 0.6 0.5 9.7 14 50.1 51.7 6.5 66.1 11.2 22.7 4.3 0.7 1.5 10.25 14.3 52.1 7.5 70.8 11.5 17.7 5.3 0.9 1.3 12.2 5.5 79 12.1 8.9 4.4 0.7 0.4 7.79 10 80.8 9.7 9.5 8.1 0.9 5.9 58.7 16.2 25.1 3.5 4.1 81.9 8.2 9.9 3.4 0.3 RBC HGB HCT MCV MCH MCHC RDW -CV PDW PCT P-LCR 7.7 8.9 0.36 13.5 ĐC ban đầu 441 8.1 10.7 0.35 17.2 ĐC ban đầu 12.2 497 7.6 8.2 0.37 13.5 ĐC ban đầu 29.7 13.3 539 10.7 0.43 16.8 ĐC ban đầu 28.3 33.4 13.9 349 7.5 8.9 0.26 13.8 Liều thử 1000 14.4 27.9 29.7 13.8 300 7.7 8.9 0.23 15.7 Liều thử 1000 50.9 13.9 27.4 31.6 15 480 7.4 8.2 0.35 12.9 Liều thử 1000 42.1 52.7 15.2 28.9 31.6 14.4 431 8.3 12.3 0.35 18.7 Liều thử 1000 11.1 39.8 51.2 14.2 27.8 29.7 14.9 538 7.4 0.37 9.1 ĐC sau 30 ngày 11.42 15.5 56 49.1 13.5 27.6 27.9 13.7 458 7.7 8.9 0.35 14.3 ĐC sau 30 ngày 1.4 10.22 13.9 51.3 50.2 13.6 27 27.9 13.4 321 6.5 7.7 0.2 9.8 ĐC sau 30 ngày 0.4 4.91 6.9 23.7 48.4 14 29.1 29.7 13.9 240 7.9 9.5 0.18 16 ĐC sau 30 ngày SD — 60 — PLT MPV Chú thích B10.4 Xử lý thống kê số sinh lý máu thử độc tính bán trường diễn Descriptive Statistics: WBC, LYM%, MID%, NEUT%, LYM@, MID@, NEUT@, RBC, Variable Chú thích N Mean StDev WBC ĐC ban đầu 5.275 1.417 ĐC sau 30 ngày 6.38 2.54 Liều thử 1000 5.650 1.620 ĐC ban đầu 63.20 13.04 ĐC sau 30 ngày 75.10 11.00 Liều thử 1000 71.85 4.39 ĐC ban đầu 16.250 1.923 ĐC sau 30 ngày 11.55 3.49 Liều thử 1000 12.050 1.507 ĐC ban đầu 20.55 11.54 ĐC sau 30 ngày 13.35 7.84 Liều thử 1000 16.10 5.23 ĐC ban đầu 3.225 0.299 ĐC sau 30 ngày 4.85 2.21 Liều thử 1000 4.025 0.991 ĐC ban đầu 0.850 0.332 ĐC sau 30 ngày 0.750 0.332 Liều thử 1000 0.6750 0.1708 ĐC ban đầu 1.200 1.010 ĐC sau 30 ngày 0.775 0.479 Liều thử 1000 0.950 0.526 ĐC ban đầu 9.970 1.731 ĐC sau 30 ngày 8.59 2.88 Liều thử 1000 9.617 1.131 ĐC ban đầu 15.00 2.72 ĐC sau 30 ngày 11.85 3.77 Liều thử 1000 13.975 1.328 ĐC ban đầu 53.13 10.52 ĐC sau 30 ngày 42.70 14.38 Liều thử 1000 49.65 5.32 ĐC ban đầu 53.175 1.489 ĐC sau 30 ngày 49.725 1.231 Liều thử 1000 51.750 0.737 LYM% MID% NEUT% LYM@ MID@ NEUT@ RBC HGB HCT MCV — 61 — MCH MCHC RDW-SD RDW-CV PLT MPV PDW PCT P-LCR ĐC ban đầu 15.000 0.408 ĐC sau 30 ngày 13.825 0.330 Liều thử 1000 14.525 0.538 ĐC ban đầu 28.275 0.650 ĐC sau 30 ngày 27.875 0.885 Liều thử 1000 28.125 0.634 ĐC ban đầu 29.25 2.34 ĐC sau 30 ngày 28.800 1.039 Liều thử 1000 31.575 1.511 ĐC ban đầu 13.250 0.904 ĐC sau 30 ngày 13.975 0.650 Liều thử 1000 14.275 0.550 ĐC ban đầu 488.0 41.1 ĐC sau 30 ngày 389.3 133.9 Liều thử 1000 390.0 80.8 ĐC ban đầu 7.850 0.238 ĐC sau 30 ngày 7.275 0.645 Liều thử 1000 7.725 0.403 ĐC ban đầu 9.625 1.274 ĐC sau 30 ngày 8.375 0.991 Liều thử 1000 9.575 1.846 ĐC ban đầu 0.3775 0.0359 ĐC sau 30 ngày 0.2750 0.0988 Liều thử 1000 0.2975 0.0618 ĐC ban đầu 15.25 2.03 ĐC sau 30 ngày 12.30 3.38 Liều thử 1000 15.27 2.56 — 62 — Two-Sample T-Test & CI: WBC, Chú thích Two-sample T for WBC Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 6.38 2.54 1.3 Liều thử 1000 5.65 1.62 0.81 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: 0.72 (-2.96, 4.41) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 0.48 P-Value = 0.647 DF = Both use Pooled StDev = 2.1283 Two-Sample T-Test & CI: LYM%, Chú thích Two-sample T for LYM% Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 75.1 11.0 5.5 Liều thử 1000 71.85 4.39 2.2 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: 3.25 (-15.59, 22.09) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 0.55 P-Value = 0.621 DF = Two-Sample T-Test & CI: MID%, Chú thích Two-sample T for MID% Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 11.55 3.49 1.7 Liều thử 1000 12.05 1.51 0.75 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.50 (-5.78, 4.78) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.26 Two-Sample T-Test & CI: NEUT%, Chú thích Two-sample T for NEUT% Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 13.35 7.84 3.9 Liều thử 1000 16.10 5.23 2.6 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: -2.75 — 63 — P-Value = 0.806 DF = 95% CI for difference: (-14.29, 8.79) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.58 P-Value = 0.581 DF = Both use Pooled StDev = 6.6677 Two-Sample T-Test & CI: LYM@, Chú thích Two-sample T for LYM@ Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 4.85 2.21 1.1 Liều thử 1000 4.025 0.991 0.50 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: 0.82 (-2.54, 4.19) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 0.68 P-Value = 0.534 DF = Two-Sample T-Test & CI: MID@, Chú thích Two-sample T for MID@ Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 0.750 0.332 0.17 Liều thử 1000 0.675 0.171 0.085 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: 0.075 (-0.443, 0.593) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 0.40 P-Value = 0.708 DF = Two-Sample T-Test & CI: NEUT@, Chú thích Two-sample T for NEUT@ Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 0.775 0.479 0.24 Liều thử 1000 0.950 0.526 0.26 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.175 (-1.045, 0.695) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.49 Both use Pooled StDev = 0.5029 Two-Sample T-Test & CI: NEUT@, Chú thích Two-sample T for NEUT@ Chú thích N ĐC sau 30 ngày Mean StDev 0.775 0.479 SE Mean 0.24 — 64 — P-Value = 0.640 DF = Liều thử 1000 0.950 0.526 0.26 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.175 (-1.089, 0.739) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.49 P-Value = 0.643 DF = P-Value = 0.552 DF = P-Value = 0.328 DF = P-Value = 0.431 DF = Two-Sample T-Test & CI: RBC, Chú thích Two-sample T for RBC Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 8.59 2.88 1.4 Liều thử 1000 9.62 1.13 0.57 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -1.03 (-5.95, 3.89) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.67 Two-Sample T-Test & CI: HGB, Chú thích Two-sample T for HGB Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 11.85 3.77 1.9 Liều thử 1000 13.98 1.33 0.66 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -2.13 (-7.01, 2.76) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -1.06 Both use Pooled StDev = 2.8248 Two-Sample T-Test & CI: HCT, Chú thích Two-sample T for HCT Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 42.7 14.4 7.2 Liều thử 1000 49.65 5.32 2.7 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -6.95 (-31.34, 17.44) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.91 — 65 — Two-Sample T-Test & CI: MCV, Chú thích Two-sample T for MCV Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 49.73 1.23 0.62 Liều thử 1000 51.750 0.737 0.37 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -2.025 (-4.017, -0.033) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -2.82 P-Value = 0.048 DF = P-Value = 0.091 DF = P-Value = 0.662 DF = Two-Sample T-Test & CI: MCH, Chú thích Two-sample T for MCH Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 13.825 0.330 0.17 Liều thử 1000 14.525 0.538 0.27 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.700 (-1.576, 0.176) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -2.22 Two-Sample T-Test & CI: MCHC, Chú thích Two-sample T for MCHC Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 27.875 0.885 0.44 Liều thử 1000 28.125 0.634 0.32 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.250 (-1.582, 1.082) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.46 Both use Pooled StDev = 0.7697 Two-Sample T-Test & CI: RDW-SD, Chú thích Two-sample T for RDW-SD Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 28.80 1.04 0.52 Liều thử 1000 31.57 1.51 0.76 — 66 — Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -2.775 (-5.018, -0.532) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -3.03 P-Value = 0.023 DF = P-Value = 0.993 DF = P-Value = 0.290 DF = P-Value = 0.316 DF = Both use Pooled StDev = 1.2966 Two-Sample T-Test & CI: PLT, Chú thích Two-sample T for PLT SE Chú thích N Mean StDev Mean ĐC sau 30 ngày 389 134 67 Liều thử 1000 390.0 80.8 40 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.8 (-217.8, 216.3) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.01 Two-Sample T-Test & CI: MPV, Chú thích Two-sample T for MPV Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 7.275 0.645 0.32 Liều thử 1000 7.725 0.403 0.20 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.450 (-1.427, 0.527) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -1.18 Two-Sample T-Test & CI: PDW, Chú thích Two-sample T for PDW Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 8.375 0.991 0.50 Liều thử 1000 9.57 1.85 0.92 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -1.20 (-4.11, 1.71) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -1.15 — 67 — Two-Sample T-Test & CI: PCT, Chú thích Two-sample T for PCT Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 0.2750 0.0988 0.049 Liều thử 1000 0.2975 0.0618 0.031 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -0.0225 (-0.1723, 0.1273) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.39 P-Value = 0.715 DF = P-Value = 0.210 DF = Two-Sample T-Test & CI: P-LCR, Chú thích Two-sample T for P-LCR Chú thích N Mean StDev SE Mean ĐC sau 30 ngày 12.30 3.38 1.7 Liều thử 1000 15.27 2.56 1.3 Difference = mu (ĐC sau 30 ngày) - mu (Liều thử 1000) Estimate for difference: 95% CI for difference: -2.97 (-8.16, 2.21) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -1.40 Both use Pooled StDev = 2.9974 B11 Kết so sánh trình tự nu NCBI (bổ sung cho hình 4.6) — 68 — — 69 —