Untitled BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trần Thị Hƣơng NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thị Hƣơng NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thị Hƣơng NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn : Phan Thị Hồng Thảo Hà Nội - 2020 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng sản xuất bột giấy thân thiện với mơi trƣờng” kết nghiên cứu khơng có chép ngƣời khác Đề tài sản phẩm mà nỗ lực nghiên cứu trình học tập Học viện làm việc phòng Vi sinh vật đất Số liệu kết nghiên cứu thực luận văn hoàn toàn trung thực chƣa sử dụng cơng bố cơng trình khác Tất tài liệu tham khảo sử dụng để viết có nguồn gốc rõ ràng, dƣới hƣớng dẫn TS Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Tôi xin cam đoan tất điều thật, có vấn đề tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Trần Thị Hƣơng Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phịng Vi sinh vật đất, Viện Cơng nghê Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu tận tình giúp đỡ em trình nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp Em xin cám ơn thầy, cô Ngành Sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ truyền đạt kiến thức quý báu khoảng thời gian đào tạo Em xin gửi lời cám ơn tới tồn thể cán phịng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi phƣơng tiện, hƣớng dẫn em suốt q trình thực tập Em xin cảm ơn kinh phí đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học để phân hủy nhựa dăm mảnh gỗ keo, bạch đàn làm nguyên liệu sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng Việt Nam: Mã số: 05/HĐĐT.05.18/CNSHCB TS Phan Thị Hồng Thảo Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Trần Thị Hƣơng DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS Adt CMC DNA DNSA pNBP RBBR Tris-HCl U VSV : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) : Tấn khơ gió : Carboxymethyl Cellulose : Deoxyribonucleic acid : 3,5-dinitrosalicylic acid : p -nitrophenyl butyrate : Remazol Brilliant Blue R : Tris hydrochloride : Unit : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Các chủng vi khuẩn xạ khuẩn phân lập nhiệt độ 37oC 45oC mẫu 31 Bảng Khả phân hủy stigmassterol, sinh tổng hợp cellulase lipase vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập 36 Bảng 3.3 Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase cellulase chủng vi khuẩn phân lập 37oC 41 Bảng Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase cellulase chủng vi khuẩn phân lập 45oC 42 Bảng Khả phân hủy nhựa chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển chọn 45 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng CVSVC1-1 48 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến khả phát triển CVSVC1-1 48 Bảng 3.8 Mức độ tƣơng đồng di truyền chủng CVSVC1-1 với loài vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự gen16S rDNA 50 Bảng Khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzym chủng CVSVC1-1 số môi trƣờng khảo sát 51 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến sinh trƣởng hoạt tính enzyme sterol esterase, laccase cellulase chủng CVSVC1-1 55 Bảng 11 Khả sinh sterol esterase, laccase cellulase chủng CVSVC1-1 dăm mảnh gỗ tỷ lệ giống khác 58 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả giảm nhựa nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo 59 Bảng 3.13 Hiệu suất nấu bột số mẫu có lƣợng nhựa giảm tốt 60 Bảng 14 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả giảm nhựa chủng CVSVC1-1 60 Bảng 15 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả giảm nhựa chủng CVSCV1-1 61 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose 28 Hình Hình ảnh vi sinh vật phát triển mơi trƣờng phân lập 31 Hình 3.2 Khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn xạ khuẩn môi trƣờng phân lập lỏng 33 Hình 3.3 Khả sinh enzym lipase ngoại bào số chủng phân lập34 Hình 3.4 Khả sinh cellulase ngoại bào số chủng phân lập 34 Hình 3.5 Dăm mảnh gỗ keo đƣợc ngâm ngập dịch lên men chủng tuyển chọn 44 Hình 3.6 Quá trình chiết nhựa 45 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào vi khuẩn CVSVC1-1 dƣới kính hiển vi quang học (100x) (B) kính hiển vi điện tử độ phóng đại (50000X) (C) (10000X) (D) 46 Hình 3.8 Khả sinh bảo tử chủng vi khuẩn CVSVC1-1 47 Hình 3.9 Khả phân hủy số chất vi khuẩn CVSVC1-1 49 Hình 3.10 Điện di đồ DNA tổng số (A), sản phẩm PCR (B) gel agarose 1,0 % phát sinh chủng loài vi khuẩn CVSVC1-1 50 Hình 3.11 Khả sinh trƣởng chủng CVSVC1-1 môi trƣờng khảo sát 51 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ (A) pH (B) đến khả sinh trƣởng chủng CVSVC1-1 môi trƣờng MPA bổ sung 0,5g/L 53 Hình 13 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase laccase chủng CVSVC1-1 53 Hình 14 Ảnh hƣởng pH ni cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase laccase chủng CVSVC1-1 54 Hình 3.15 Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 tỷ lệ giống bổ sung khác 57 Hình 3.16 Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 sau rửa sấy 57 Hình 3.17 Mật độ vi sinh mẫu có không bổ sung chủng CVSVC1-1 nồng độ 105 57 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY 1.2 NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY 1.2.1 Nhựa 1.2.2 Tác động nhựa đến trình sản xuất bột giấy 1.3 VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY 1.3.1 Nấm phân hủy nhựa 1.3.2 Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa 12 1.3.3 Hệ enzym phân hủy nhựa 14 1.3.2.1 Esterase 14 1.3.2.2 Lipase 15 1.3.2.3 Laccase 16 1.3.4 Cơ chế phân hủy lignin chất chiết gỗ 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 22 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Thiết bị 22 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.4 Môi trƣờng 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Chuẩn bị chất chiết nhựa 23 2.2.2 Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa 23 2.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật đƣợc tuyển trọn 24 2.2.4 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzym 25 2.2.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym 26 2.2.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa chiết aceton 29 2.2.7 Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate 29 2.2.8 Phƣơng pháp xác định số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin) 30 2.2.9 Phƣơng pháp phân tích thống kê 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY 31 3.1.1 Phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn xạ khuẩn có khả phân hủy nhựa 31 3.1.2 Khả sinh tổng hợp sterol esterase, laccase cellulase chủng tuyển chọn 40 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả phân hủy nhựa 43 3.2 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG CVSVC1-1 46 3.2.1 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn CVSVC1-1 46 3.2.2 Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn phƣơng pháp phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA 49 3.3 NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP STEROL ESTERASE CỦA CHỦNG CVSVC1-1 51 3.3.1 Lựa chọn mơi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng sinh tổng hợp số enzym chủng CVSVC1-1 51 3.3.2 Ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ, pH tốc độ lắc đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzym chủng CVSVC1-1 52 3.4 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BỔ SUNG VI SINH VẬT TUYỂN CHỌN VÀO DĂM MẢNH GỖ KEO 56 3.4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả sinh trƣởng loại nhựa 56 3.4.3 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả giảm nhựa dăm mảnh gỗ 61 4.1 Kết luận 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63