Sinh học - NC, phân tích chỉ tiêu và xác định mối quan hệ di truyền, mức sai khác trong DNA các giống đậu xanh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ` ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ THAO NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU XANH [Vigna radiata (L.) Wilczek] LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ THAO NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU XANH [Vigna radiata (L.) Wilczek] Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 26 tháng 10 năm 2010. Tác giả luận văn Hoàng Thị Thao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Chu Hoàng Mậu đã tài trợ một phần kinh phí và tạo điều kiện để tôi hoàn thành kết quả của luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, ThS. Đỗ Tiến Phát- Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học đã hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm sinh học – Khoa khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và Bộ môn Sinh học phân tử, Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên. Qua đây, tôi cũng xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác - Viện nghiên cứu Ngô đã cung cấp một số giống đậu xanh giúp tôi có thể thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã nhiệt tình ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Công trình được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của dự án TRIG. Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tác giả luận văn Hoàng Thị Thao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Những chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1.CÂY ĐẬU XANH 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh 3 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh 3 1.1.3. Tầm quan trọng của cây đậu xanh 7 1.1.4. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh 8 1.1.4.1. Protein 8 1.1.4.2. Lipid 9 1.2. NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT 9 1.2.1. Một số phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di truyền ở thực vật 9 1.2.1.1. Kỹ thuật RAPD 9 1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP 12 1.2.1.3. Kỹ thuật RFLP 12 1.2.1.4. Kĩ thuật SSR 13 1.2.1.5. Bản đồ QTL 14 1.2.2. Nghiên cứu quan hệ di truyền ở thực vật sử dụng kỹ thuật RAPD 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 1.2.3. Nghiên cứu quan hệ di truyền ở đậu xanh sử dụng kỹ thuật RAPD 19 1.3. NHẬN XÉT CHUNG 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.1.1. Vật liệu thực vật 22 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 24 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Phương pháp hoá sinh 24 2.2.1.1. Định lượng lipid tổng số 24 2.2.1.2. Định lượng protein 25 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử 27 2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 27 2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số 28 2.2.2.3. Phương pháp RAPD 29 2.2.2.4. Phân tích số liệu RAPD 31 2.2.3. Phương pháp xử lý kết quả và số liệu 31 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU 32 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của 30 giống đậu xanh 32 3.1.2. Hàm lượng protein, lipid của 30 giống đậu xanh nghiên cứu 34 3.2. PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD 38 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu xanh 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 3.2.2. Kết quả nghiên cứu quan hệ di truyền DNA bằng kĩ thuật RAPD 40 3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xanh dựa trên phân tích RAPD 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 1. KẾT LUẬN 62 2. ĐỀ NGHỊ 62 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt, đứng sau đậu tương và lạc. Đậu xanh cũng chính là cây trồng có vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam [9], [17]. Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi, mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất do rễ của cây đậu xanh có các nốt sần chứa một số loài vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [3], [4]. Vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu chọn tạo các giống đậu xanh có chất lượng tốt, phục vụ nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu. Hiện nay, việc nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và đậu xanh nói riêng nhờ chỉ thị phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi. Các nhà khoa học đã sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, RFLP, SSR…để xác định quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác chọn tạo giống cây trồng. Trên thế giới, kỹ thuật RAPD đã được nhiều tác giả sử dụng để nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh như: Afzal và cs (2004), Betal và cs (2004), Lakhanpaul và cs (2000) [33], [35], [45]. Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng đã được các tác giả Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Điêu Thị Mai Hoa sử dụng để xác định quan hệ di truyền của các giống đậu xanh đột biến, các giống đậu xanh chịu hạn, các giống đậu xanh chín tập trung và không tập trung [8], [20], [26]. Nhằm tạo cơ sở cho việc lựa chọn giống đậu xanh có chất lượng tốt phục vụ công tác lai tạo giống, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek ]”. 2 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lượng hạt của một số giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh. - Khảo sát sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của 30 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RAPD. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân tích một số đặc điểm hình thái như: màu gốc thân mầm, màu vỏ hạt, hình dạng hạt, khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu. - Phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh: hàm lượng lipid, protein tan tổng số của các giống đậu xanh nghiên cứu. - Tách chiết DNA tổng số của 30 giống đậu xanh nghiên cứu. - Phân tích sự đa hình DNA được nhân bản ngẫu nhiên, xác định mức sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của các giống đậu xanh nghiên cứu. - Thiết lập mối quan hệ di truyền của 30 giống đậu xanh nghiên cứu. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU XANH 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck] thuộc ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis. Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn được gọi là nhóm đậu châu Á, bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V. aconitifolia, V. angularis, V. umbellata [9], [17]. Đậu xanh có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [9]. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh Đậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt. Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. Đặc điểm của rễ Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm, rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm [12]. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây. Tuy nhiên, bộ rễ của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém. Nếu bộ rễ phát triển [...]... Mai Chõu - Ho Bỡnh 17 T17 Yờn Phong - Bc Ninh 3 T3 Bỏt Xỏt - Lo Cai 18 T18 ỡnh Bng - Bc Ninh 4 T4 Mc Chõu - Sn La 19 T19 Nam Sỏch - Hi Dng 5 T5 Bo Lc - Cao Bng 20 T20 Yờn Th - Bc Giang 6 T6 Xut Hoỏ - Bc Kn 21 T21 Vit Yờn - Bc Giang 7 T7 ng H - Thỏi Nguyờn 22 T22 044/DX06 - Vin NC Ngụ 8 T8 Phỳ Lng - Thỏi Nguyờn 23 T23 T Liờm - H Ni 9 T9 Hm Yờn - Tuyờn Quang 24 T24 Long Biờn - H Ni 10 T10 Sn Dng - Tuyờn... Quang 24 T24 Long Biờn - H Ni 10 T10 Sn Dng - Tuyờn Quang 25 T25 VN9 9-3 - Vin NC Ngụ 11 T11 Bc Quang - H Giang 26 T26 DXVN4 - Vin NC Ngụ 12 T12 Hong Su Phỡ - H Giang 27 T27 DXVN5 - Vin NC Ngụ 13 T13 Thanh Thu - Phỳ Th 28 T28 VN9 3-1 - Vin NC Ngụ 14 T14 Yờn Bỡnh - Yờn Bỏi 29 T29 Vnh Bo - Hi Phũng 15 T15 Kim Bng - H Nam 30 T30 Yờn Lc - Vnh Phỳc 22 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16... trong 7 mt nm Do ú, cõy u xanh cú th c trng xen, trng gi, luõn canh trờn nhiu loi t canh tỏc khỏc nhau [27] Trng cõy u xanh cũn cú tỏc dng trong ci to v bi dng t u xanh l ngun m sinh hc quan trng trong c cu cõy trng luõn canh bi h r u xanh cú cỏc nt sn cha cỏc vi khun cng sinh cú kh nng c nh nit t khớ tri, cung cp mt phn m cho cõy v li lng m ỏng k trong t sau khi thu hoch Vỡ vy, t sau khi trng u xanh. .. lm khụ DNA (Speed Vac) v mt s thit b, mỏy múc cn thit khỏc 2.1.3 a im nghiờn cu Cỏc thớ nghim c tin hnh ti B mụn Sinh hc phõn t v Cụng ngh gen - Vin Khoa hc S sng - i hc Thỏi Nguyờn; Phũng thớ nghim sinh hc - Khoa Khoa hc s sng - Trng i hc khoa hc - i hc Thỏi Nguyờn v Phũng Cụng ngh T bo thc vt - Vin Cụng ngh Sinh hc Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU 2.2.1 Phng phỏp hoỏ sinh 2.2.1.1... cú th c dựng lm rau, mui da Thõn lỏ xanh ca cõy u xanh dựng lm thc n cho chn nuụi, cũn thõn lỏ gi em phi khụ, nghin nh lm bt d tr cho gia sỳc [17, 27] Ngoi ra, u xanh cũn cú giỏ tr trong y hc Ht u xanh cú v ngt, tớnh mỏt, khụng c nờn cú tỏc dng gii nhit, gii bỏch c [16] Cõy u xanh cú thi gian sinh trng ngn, kh nng sinh trng mnh, mi chu k sinh trng kộo di t 60 - 90 ngy Mt khỏc, yờu cu k thut canh tỏc... [1], [7], [24] * Chu k phn ng Phn ng RAPD c tin hnh qua cỏc giai on sau: - Giai on bin tớnh DNA: nhit 950C trong 30 - 60 giõy lm cho cỏc liờn kt hydro gia 2 mch b t Khi ú DNA si ụi tỏch thnh 2 si n to iu kin cho s bt cp mi - Giai on tip hp mi: Nhit h xung 320 - 400C, mi bỏm vo u 3OH ca mch khuụn DNA v bt u quỏ trỡnh tng hp si mi - Giai on tng hp: Nhit c nõng lờn 720C thỡ cỏc on mi ó bt cp vi cỏc mch... khi lng mu trc v sau khi chit phn trm khi lng khụ %L Trong ú: a b *100% a % L - % ca lipid a - khi lng mu trc khi chit b - khi lng mu sau khi chit 2.2.1.2 nh lng protein nh lng protein tan trong ht u xanh theo phng phỏp Lowry [2] * Nguyờn tc Da vo cng mu xanh ca phc cht ng, protein kh hn hp phosphomolipdate - phosphovonphramate (thuc th Foling - Ciocalteau) Cng mu t l thun vi hm lng protein * Lp... 5 - 50 ng trong 20 - 25 àl DNA khuụn l vt liu khi u cho phn ng RAPD, c tỏch t cỏc mu: virus, vi khun, t bo thc vt, ng vt DNA cú tinh sch, cú th l si n, si ụi, mch vũng hoc mch thng DNA khuụn c khuch i di dng thng cú hiu qu hn dng vũng Kớch thc DNA khuụn nh hn 3 kb cho kt qu tt nht [7] - on mi (primer): ch s dng mt mi ú l mt oligonucleotide cú trt t nucleotide ngu nhiờn v cú chiu di 8 - 10 nucleotide... nhit cao trong cỏc loi enzyme c im ca chỳng l cú kh nng kộo di mi to mt sn phm cú chiu di 8 - 13 kb Taq-polymerase c tỏch chit t chng vi khun sui nc núng Thermus aquaticus, khụng b mt hot tớnh nhit bin tớnh DNA (92o - 950C) Taq - polymerase cú hot tớnh di nhit cao, tn 10 ti nhit 950C kộo di Enzyme ny cú hot tớnh cao 72 0 - 800C lm cho phn ng xy ra nhanh, hiu qu v chớnh xỏc [1], [24] - dNTP:... mc, xanh búng, xanh nõu, vng mc, vng búng nm ngn cỏch nhau bng nhng vỏch xp ca qu Rut ht mu vng, xanh, xanh nht Hỡnh dng ht kt hp vi mu sc v ln ca ht l ch tiờu 6 quan trng ỏnh giỏ cht lng ca ht Mi qu cú t 8 - 15 ht Ht ca nhng qu trờn thõn thng to, my hn ht ca cỏc qu cnh Ht ca cỏc qu la u cng to v my hn cỏc qu la sau S lng ht trung bỡnh trong mt qu l mt trong nhng yu t ch yu to thnh nng sut ca u xanh . cứu. - Phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh: hàm lượng lipid, protein tan tổng số của các giống đậu xanh nghiên cứu. - Tách chiết DNA tổng số của 30 giống đậu xanh nghiên cứu. - Phân tích sự. của các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm sinh học – Khoa khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và Bộ môn Sinh học phân tử, Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại. tích sự đa hình DNA được nhân bản ngẫu nhiên, xác định mức sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của các giống đậu xanh nghiên cứu. - Thiết lập mối quan hệ di truyền của 30 giống đậu xanh nghiên cứu.